内生放线菌A00122中germicidin生物合成基因的克隆

在植物和细菌中,Ⅲ型聚酮合酶能够产生种类多样的次生代谢产物.在药用植物内生放线菌A00122的发酵产物中,分离到了一个已知的Ⅲ型聚酮类化合物germicidin.对A00122菌株建立了基因组文库,根据已知的同源基因Sco7221设计引物作为探针对文库进行PCR筛选,并通过Southern杂交的方法从阳性克隆5-3-10中定位了包含germi-cidin基因的片段,经测序得到长度为1 185 bp的完整合成基因.该基因的获得为深入研究Ⅲ型聚酮合酶的底物选择性,通过定向改造的方法获得非天然Ⅲ型聚酮类化合物提供了重要基础.     

一个新的水稻GST类似蛋白基因XIG的克隆与分析

根据编码一种玉米GST类似蛋白的mRNA In2-1序列设计引物，以水稻cDNA文库为模板，PCR扩增得到一条270bp的DNA片段，以此片段为探针分别筛选水稻根cDNA文库及水稻基因文库，获得一条全长cDNA及其相应的全长基因，并通过测序得到了两者的全序列，该基因编码的蛋白具有GST的典型特征，在水稻中尚未见报道。     

盐藻（Dunaliella viridis）细菌人工染色体文库的构建和鉴定

盐藻具有极强的耐盐能力，是研究植物耐盐机制的模式系统.为了对其耐盐机制进行深入的 研究，以pCC1BAC为载体，构建了盐藻的细菌人工染色体（BAC）文库.该文库共有9 216 个转化子，插入片段平均长度为55 kb，以单克隆形式保藏在96块96孔板中，并建立了四维P CR基因筛选体系，可以通过4轮PCR快速筛选获得阳性单克隆.根据本实验室分离到的两个盐 藻基因的cDNA序列（ DvSPT2和DvTPSP ）设计引物，通过PCR从该文库中各筛到4个阳性BA C克 隆，说明该文库能有效用于分离盐藻基因的基因组序列，据此推测该文库约覆盖4倍盐藻基 因组序列.     

与ATP6相互作用的蛋白质的筛选和Bn HDL基因的cDNA克隆

以与甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育有关的atp6基因作为诱饵蛋白,通过酵母双杂交技术,筛选甘蓝型油菜的cDNA文库,寻找与其相互作用的蛋白质.根据筛选所获得的其中一个阳性克隆的序列,利用RACE技术和TAIL PCR技术,获得该基因的全长cDNA序列.将氨基酸序列在NCBI上进行Blast比对分析,具有水解酶家族17的保守结构域,与拟南芥的beta-1,3-glucanase 5具有84%的同源性,可能为水解酶家族的一个成员,暂定该蛋白质为Bn HDL.     

鲤NADH泛醌氧化还原酶亚基3基因的克隆及低温适应相关性分析

根据鲤低温下特异表达的基因（片段）序列设计引物,采用2轮菌落PCR方法对鲤脑全长cDNA文库中的克隆进行筛选,确定了基因序列152在文库中的位置,经生物信息学比对分析确定其为NADH泛醌氧化还原酶亚基3基因.这一基因在低温下的特异表达,对于低温下鱼类机体的供能,起着重要作用.结果还表明,NADH泛醌氧化还原酶亚基3基因在鲤氧化呼吸链电子传递系统中与低温适应性状在一定程度上存在相关性.     

Paenibacillus sp. K1 β-半乳糖苷酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

从鲜牛奶中分离到1株产β-galactosidase的细菌,经16S rDNA序列比对鉴定为类芽孢菌Paenibacillus sp. K1。提取该菌株的染色体DNA,以pUC18（lac-）为载体,构建其DNA文库;在含有X-gal的LB平板上筛选该文库,得到6个蓝色菌落;对阳性克隆中插入的DNA片段序列测定,鉴定出1个编码全长为2028bp并携带有组成型启动子的β-半乳糖苷酶基因。将该基因导入大肠杆菌BL21（DE3）中,实现了β-半乳糖苷酶高效表达,其酶活为25.06U/mL,高于原始菌株的4.55U/mL,并进一步用亲和层析将该酶进行了纯化。     

人Oligophrenin 1样(OPHN1L)基因的克隆

将人Oligophrenin 1(OPHN1)基因编码区2406 bp与EST数据库进行同源性分析,得到一个363 bp的EST AA035622与OPHN1基因编码区一致性为62%,该EST与一个cDNA序列AB014521完全匹配.在ABO14521中设计引物与cDNA文库载体臂上引物行巢式PCR扩增并进行5′RACE,在胎盘cDNA文库中获得cDNA序列606bp,与AB014521拼接成一个6906 bp的cDNA序列,其中包含一个2442 bp的开放阅读框,编码813个氨基酸.该cDNA序列的GenBank登录号为AF141884,并经GDB命名委员会命名为OPHN1L基因.OPHN1L基因3′端与大规模测序的BAC克隆AC005348及AC004782完全匹配,从而将该基因定位于5q21.2～q21.3,并由此获得它的部分基因组结构.     

人和鼠脑cDNA文库的建立以及全长cDNA的批量分离

应用λZAP Express cDNA文库构建试剂盒构建了人3个月和8个月胎儿脑及大小鼠脑cD-NA文库.第2链cDNA经Sepharose CL-4B凝胶过滤层析后去除了较小的片段,使大片段cDNA具有较高的克隆效率.所建立的文库具有较长的插入片段.合并不同长度范围的人3个月胎儿脑cDNA片段,分别克隆入文库载体,获得了长片段、中片段、短片段及合并cDNA文库.从分级文库中各随机挑取300个克隆,经载体引物PCR扩增后,测定5'末端序列,一共获得894个表达序列标签(EST)序列.根据同源性比较结果将感兴趣的克隆环化后测定全长cDNA序列,得到了12条新的全长cDNA.这些文库的建立以及新EST,cDNA的分离为文库筛选和获得脑表达的新基因奠定了基础.     

常规PCR与RACE结合法快速从cDNA文库中克隆基因

首先根据Fe(Ⅱ)-转运蛋白基因家族的保守区设计同源的常规PCR引物(F1，R1)，扩增出490bp的特异片段。然后根据RACE法原理，巧妙地设计3′RACE(F2)和5′RACE(R3)特异性引物，使两者既能分别与文库载体上的筛选扩增引物配对扩增cDNA 3′和5′末端序列，又能使扩增出的3′RACE和5′RACE产物序列有重叠部分；另外设计引物时还兼顾到使F2和R3也能配对，从而能对3′RACE和5′RACE扩增产物进行双特异性引物常规PCR鉴定。该方案不但能够直接根据序列鉴定3′RACE和5′RACE产物是否为同一基因序列，还能快捷地用常规PCR鉴定3′RACE和5′RACE扩增产物是否为特异性扩增，避免了对非特异性扩增产物的克隆测序等繁琐的鉴定过程，优化了基因克隆策略。最后根据拼读出的全长序列设计引物(F4，R4)扩增出完整编码区。应用该方法成功地从小金海棠缺铁处理的根系cDNA文库中克隆了Fe(Ⅱ)-转运蛋白基因的cDNA。说明该方案是一种从cDNA文库中克隆目的基因的快捷优化方法。     

线粒体COⅢ基因分析三种常见鲳鱼的亲缘关系

金鲳(Trachinotusovatus)、银鲳(Pampusargenteus)和中间低鳍鲳(Peprilusmedius)是重要经济鱼种,其中后两种鱼外形较为相似,分类一直存在分歧.本研究随机采集烟台、青岛地区银鲳、中间低鳍鲳和金鲳的生鲜海鱼样本,提取3种鱼的全基因组DNA,设计通用引物对目标基因进行PCR扩增和测序,后对其线粒体COⅢ全序列及ATP6部分序列进行基因多态性分析,探讨3种鱼的亲缘关系;依据测序结果,设计各鱼种的特异引物,用特异引物和通用引物进行复合PCR扩增方法对各鱼种进行种源性鉴定.通过比对分析测序结果,获得了中间低鳍鲳COⅢ基因全序列及ATP6基因部分序列且收录在NCBI核苷酸数据库中,登录号分别为KT210112和KT210113.证明NCBIGenBank中发布的刺鲳(Psenopsis anomala)序列(KP334103.1)实为中间低鳍鲳.遗传距离分析发现银鲳与金鲳的距离最大,与中间低鳍鲳次之,中间低鳍鲳与金鲳的遗传距离最小.采用复合PCR方法,实现了在同一复合PCR体系中有效区分3种鱼的方法,具有更加便捷、准确的优势.     

一个紫红曲霉HR-PKS基因MpER1的克隆及序列分析

利用已知HR-PKS中ER结构域的保守氨基酸序列,通过设计简并引物,并使用本实验设计的巢式PCR方法从紫红曲霉(Monascus purpureus)中成功克隆得到一条长约300 bp的ER基因片段MpER1,再用Genome Walking的方法获得该HR-PKS中ER的基因全长序列.序列分析显示:该ER基因长为936 bp,编码312个氨基酸.将该ER基因序列与已知的ER基因序列比对,发现不同产物的ER基因同源性较差.该ER基因对应的氨基酸序列与A.clavatus 有最高的同源性,为88%.与其他物种如Nectria haematococca、Magnaporthe grisea等有50%左右的同源性.     

大腹圆蛛拖丝蛋白基因3''''端克隆和序列分析

用PCR(Polymerase Chain Reaction)技术从大腹圆蛛主壶腹腺组织的基因组DNA和RNA中分别扩增获得编码拖丝蛋白基因的3'端基因序列,克隆PCR产物到pDrive载体,经PCR、限制性酶切筛选和序列分析后证明获得了蜘蛛拖丝蛋白基因两个克隆AvDS1和AvRS2.基因序列和氨基酸序列分析表明AvDS1和AvRS2具有拖丝蛋白基因序列和蛋白质氨基酸序列特有的结构特征,氨基酸序列中存在4个motifs-(A)n(GA)n(GFGX)n以及(GGX)n.AvDS1与基因库中已报道的蜘蛛拖丝蛋白基因序列同源性较低,而AvRS2与已经报道的Nephila clavipes拖丝蛋白基因组分-1的同源性可达91%,推测AvRS2是编码大腹圆蛛拖丝蛋白基因组分-1基因片段.比较这两个克隆的核苷酸序列和氨基酸序列,发现它们之间没有同源性.推测它们是同一基因的不同片段,或是编码大腹圆珠拖丝蛋白的两个基因组分. 明AvDS1和AvRS2具有拖丝蛋白基因序列和蛋白质氨基酸序列特有的结构特征,氨基酸序列中存在4个motifs-(A)n(GA)n(GFGX)n以及(GGX)n.AvDS1与基因库中已报道的蜘蛛拖丝蛋 基因序列同源性较低,而AvRS2与已经报道的Nephila clavipes拖丝蛋白基因组分-1的同源性可达91%,推测AvRS2是编码大腹圆蛛拖丝蛋白基因组分-1基因片段.比较这两个克隆的核苷酸序列和氨基酸序列,发现它们之间没有同源性.推测它们是同一基因的不同片段,或是编码大腹圆珠拖丝蛋白的两个基因组分. 明AvD     

新疆无苞芥OpNAC083基因的克隆与表达分析

本研究通过对新疆耐逆植物无苞芥幼苗c DNA文库的随机克隆测序分析,获得1条与拟南芥NAC转录因子基因At NAC083高度相似的EST序列(Gen Bank登录号为JZ151841),该序列包含1个723 bp最大开放阅读框(ORF),推测编码240个氨基酸。根据该ORF序列设计引物,利用RT-PCR技术从无苞芥叶片的c DNA中克隆了该基因,命名为Op NAC083。比对分析结果表明在其N端具有一段No apical meristem(NAM)保守结构域;该蛋白的二级结构包含33个α-螺旋和11个β-转角。系统进化树分析结果表明,Op NAC083编码产物与拟南芥At NAC083和琴叶拟南芥ANAC083进化关系较近,属于同一进化分支。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析基因表达结果显示,Op NAC083在无苞芥的不同组织中都有表达,在叶中表达量最高;高盐胁迫处理2 h、ABA处理6 h明显诱导该基因的表达,但PEG-6000和4℃胁迫却抑制该基因的表达。这表明Op NAC083在无苞芥应对盐和ABA胁迫中可能起着重要作用。     

兔肌肉生长抑制素基因的cDNA克隆及初步分析

以兔骨胳肌为实验材料,构建了兔骨骼肌cDNA文库,根据该基因保守序列,设计简并引物,利用RT-PCR技术,克隆了兔MSTN基因EST片段,以EST片段为探针,应用Southern杂交技术筛选文库,克隆了兔肌肉生长抑制素基因全长cDNA并在GenBank注册(注册号:AY169410).用生物信息学方法对该基因进行了比较分析,表明从氨基酸序列及进化角度兔和其他哺乳类生物的肌肉生长抑制素基因之间关系密切.     

筛选与拟南芥绒毡层发育过程中重要的转录因子DYT1相互作用的调控蛋白因子

DYT1是拟南芥绒毡层发育过程中重要的转录因子.DYT1的缺失会导致绒毡层相关功能的缺陷.然而,DYT1并不是使绒毡层功能化的充分因素,暗示了DYT1蛋白需要和其他转录因子形成复合物才能发挥功能.利用酵母双杂交技术以DYT1蛋白为诱饵在拟南芥cDNA文库中筛选与DYT1相互作用的蛋白.通过筛选从文库中得到20个阳性克隆,通过BLAST序列比对得到8个候选基因序列,从中鉴定出6种候选基因编码可能的转录因子或者其他调控转录的蛋白因子.其中5个编码调控因子的基因都被证实在花药中表达.更进一步,发现另一个对花药发育所必需的转录因子AMS能与DYT1在酵母体内形成转录复合物.表明这2个蛋白可能形成异源复合物在花药中共同调节下游基因的表达.     

棉花纤维细胞分化相关基因的cDNA阵列分析

利用陆地棉(Gossypiumhirsutum)品种徐州142(野生型)开花前1-3d的胚珠构建了一个高质量的cDNA文库,从该cDNA文库中提取13056个质粒,用Biomek2000高密度点阵系统,将这些质粒点于强化硝酸纤维素膜上.分别用徐州142野生型和无絮突变体开花前1-3d的胚珠mRNA反转录标记探针与cDNA阵列杂交,筛选到8个在野生型胚珠中高表达的基因,其中4个在GenBank中有同源序列,4个为未知新基因.Northern杂交表明有两个基因在野生型中比突变体中表达量显著提高.     

拟南芥耐干旱相关转录因子DREB1A基因的克隆及序列分析

设计引物利用PCR技术从拟南芥中克隆与植物耐旱相关序列DRE相结合的转录因子DREB1A的基因,得到扩增谱带后,进行TA克隆,经蓝白斑筛选获得pDREB重组质粒,经PCR验证和序列测定确认扩增所得片段为DREB1A基因,并对该基因序列进行了分析.