盐芥ThPHT1;8基因的克隆和功能分析

磷(P)是植物生长发育过程中重要的矿质营养元素之一,PHT1磷酸转运蛋白家族负责调控植物从土壤中吸收磷以及细胞间无机磷(Pi)的转运.本文以盐芥幼苗根cDNA为材料,克隆到盐芥磷酸转运蛋白ThPHT1;8基因.生物信息学分析结果表明,ThPHT1;8蛋白编码525个氨基酸残基,蛋白分子质量为58.1,ku,等电点6.33,是一个定位在细胞膜上的疏水、无信号肽的非分泌性蛋白,含有高亲和力磷酸转运蛋白典型的跨膜结构.实时定量PCR结果显示,低磷胁迫能促进ThPHT1;8基因在盐芥根部的表达,而且不同磷浓度处理下ThPHT1;8基因表达的模式不同.ThPHT1;8基因在转基因拟南芥中的生物学功能研究表明,不同浓度低磷胁迫处理下,与野生型拟南芥相比,35S:ThPHT1;8转基因拟南芥幼苗的主根根长显著增加、侧根密度显著降低,叶绿素含量、无机磷和总磷含量提高,花青素含量降低.上述结果表明,盐芥ThPHT1;8基因确实参与低磷胁迫时植物的应答,能够提高转基因拟南芥的耐低磷能力,为土壤磷高效利用提供了一种有潜力的候选功能基因.     

小拟南芥转运蛋白基因及NHX2基因的克隆与表达

转运蛋白(transport protein)是膜蛋白的一大类,介导生物膜内外的化学物质及信号的交换。植物体内存在多个与Na~+转运相关的蛋白,其中液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白(Vacuolar Na~+/H~+antiporter,NHX)在离子稳态和提高植物耐盐性方面发挥着重要作用。为了深入了解转运蛋白基因在短命植物小拟南芥(Arabidopsis pumila)耐盐方面的作用,本研究首先基于小拟南芥响应高盐胁迫叶片转录组数据筛选出1157个转运蛋白基因,按功能分为Na~+转运蛋白,K~+转运蛋白,Ca~(2+)转运蛋白,ABC转运蛋白以及糖转运蛋白等,其中功能注释为Na~+转运蛋白的基因有24个。K均值(K-means)聚类分析结果显示,1157个转运蛋白基因分布于20个K subcluster,其中在K6、K9、K15子聚类中的基因数量分布较多,分别为172、193、190个。在分布于K6子聚类的Na~+转运蛋白基因中,有一个编码NHX2蛋白的基因经盐胁迫处理后明显上调表达。采用RT-PCR克隆了Ap NHX2基因,Ap NHX2开放阅读框1626 bp,编码541个氨基酸。Ap NHX2蛋白是一个典型的跨膜转运蛋白,具有12个跨膜结构区。系统进化分析表明Ap NHX2与拟南芥At NHX2亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析显示,Ap NHX2基因在小拟南芥各组织中均有表达,但在花中表达量最高。为进一步研究该基因的功能,构建了过量表达载体35S∶Ap NHX2并转化农杆菌GV3101。本研究为进一步阐述转运蛋白基因在小拟南芥响应盐胁迫中的功能机制奠定了基础。     

AGO1基因对拟南芥叶边缘锯齿状发育的影响

在拟南芥和水稻中Argonaute(AGO)蛋白是RNA介导的沉默复合体(RISC)的核心组分,在植物叶极性的分化方面具有重要的调节作用。实验根据AGO1基因序列设计一对特异引物,提取野生型拟南芥RNA作为模板,采用反转录PCR方法扩增出AGO1基因,并插入到克隆载体pGEM-T中。筛选鉴定后将AGO1连接到植物表达载体pBI121上,构建起植物表达载体pBI121-AGO1。并且利用农杆菌介导的方法转化拟南芥,通过抗性筛选,获得转基因植株。然后对转基因植株进行表型分析及AGO1蛋白的RT-PCR检测。通过对转基因拟南芥表达分析发现,与野生型拟南芥相比超表达AGO1蛋白的转基因拟南芥叶片明显呈锯齿状,说明AGO1基因影响拟南芥叶片发育。     

转人Cu,Zn-SOD基因马铃薯的研究

采用RT—PCR技术从人肝总RNA中分离扩增了490bp的人铜锌超氧化物歧化酶(hCM，Zn—SOD)基因的cDNA序列，进行了序列测定，结果和文献报道的一致；构建了CaMv35S启动子驱动hCu，Zn—SOD基因的植物表达载体PBICuSOD；用三亲交配法将重组质粒PBICuSOD转化到农杆菌LBA4404，转化马铃薯得到转基因植株。PCR和Southern—blot分析证明，hCu，Zn—SOD基因巳整合到马铃薯基因组中。Western blot分析表明，hCu，Zn—SOD基因在转基因马铃薯植株中得到表达。用NBT光还原法测定转基因马铃薯植株中的SOD酶活力，叶的总酶活为1066．6U／g(湿重，下同)，块茎的总酶活为10llU／g。     

拟南芥外源ERG基因的阳性苗的初步筛选

近来关于Era蛋白(E.coli ras-like protein)及其同源蛋白的研究较多,但其在真核生物中的功能仍不明朗,尤其是植物中相关研究报道尚少。拟南芥中有两个ERG蛋白,大小分别为437个氨基酸和427个氨基酸,分别用ERG437和ERG427表示。本文通过构建ERG基因的真核表达载体,利用农杆菌浸花法侵染拟南芥植株,筛选出阳性植株,为进一步定位观察和功能研究提供了材料。     

AhHDA1异源表达影响拟南芥植株干旱性

将花生组蛋白去乙酰化酶1基因(Arachis hygogaea histone deacetylase 1,AhHDA1)转化拟南芥野生型Col-0和突变体had6,对获得的纯合转基因植株进行抗旱性分析,并对ABA合成及相关响应基因表达进行检测.结果表明:AhHDA1蛋白定位于细胞核,在干旱条件下,与hda6突变体比较,p35S%HDA1/hda6拟南芥植株的叶片相对含水量降低,气孔开度增大,干旱存活率降低,基本回复了Col的表型;体内ABA合成关键酶基因At NCED3和ABA信号途径重要转录因子At ABF3基因的表达降低,但RD29A基因表达提高.而p35S%HDA1/Col较p35S%HDA1/hda6和Col的抗旱性关键生理指标降低更加显著.说明hda6突变体表型回复确实由于外源AhHDA1的表达引起的,推测AhHDA1影响植物抗旱性与ABA的合成与信号通路相关.     

陆地棉GDSL脂肪酶增强拟南芥对黄萎病菌的抗性

为了分析脂肪酶对于黄萎病菌的抗性功能,本研究采用RT-PCR技术从陆地棉中克隆得到1个GDSL脂肪酶(GDSL Lipase,GLIP)基因Gh GLIP,ORF全长1068 bp。采用滴花法将重组表达载体35S::Gh GLIP转入哥伦比亚型拟南芥,通过筛选、鉴定和纯合得到T3代转基因拟南芥。利用黄萎病菌悬浮液分别对野生型和转基因拟南芥植株叶片进行局部处理后,发现转Gh GLIP基因拟南芥植株能够抑制黄萎病菌诱发的叶片细胞死亡及病菌在叶片感染处的生长繁殖。酶活性测定结果显示,转Gh GLIP基因拟南芥植株的抗氧化系统酶和病程相关酶的表达获得了显著的增强;RT-PCR分析结果表明,黄萎病菌处理1 d后,转Gh GLIP基因拟南芥叶片的病程相关基因和乙烯信号相关基因的表达获得了显著的增加。本研究结果表明,棉花Gh GLIP基因可能通过参与乙烯信号,以及促进抗氧化系统酶和病程相关基因的表达,进一步增强拟南芥对于黄萎病菌的抗性。本研究可为棉花Gh GLIP基因增强植物抗病性分子机制解析,以及进一步的基因工程利用提供一定参考。     

小拟南芥液泡膜H~+-PPase基因OpVP1的克隆、序列分析及表达

植物液泡膜质子转运无机焦磷酸酶(V-PPase)酸化植物液泡并为液泡的次级转运系统提供能量,在植物耐盐性起着重要的作用。为了克隆小拟南芥液泡膜H+-PPase基因,采用RT-PCR结合RACE的方法从小拟南芥叶片的cDNA中克隆了1个液泡膜H+-PPase基因,命名为OpVP1。OpVP1基因的cDNA全长为2698bp,开放阅读框(ORF)为2313bp,编码770个氨基酸。OpVP1蛋白与琴叶拟南芥、拟南芥相似性最高,分别为98.6%、98.4%。系统进化分析表明OpVP1基因属于Ⅰ型液泡膜质子焦磷酸酶基因。OpVP1蛋白的分子量是80745.9Da,等电点pI为5.13,含有14个跨膜螺旋结构。三维结构分析表明OpVP1蛋白是由2个单体组成的二聚体蛋白。qRT-PCR表明OpVP1基因在角果中表达高于根、茎、叶和花中的表达。     

拟南芥中一个镍离子转运蛋白的亚细胞定位

离子的跨膜转运是细胞获取养分的重要环节，亦是植物在组织和器官水平上进行养分吸收运移的基础．在植物中镍（Ni）元素主要以Ni^2＋的形式存在，并通过Ni^2＋转运蛋白将其跨膜转运至相应的组织器官，参与氢酶和脲酶的合成．生物信息学分析表明，拟南芥中一个Ni^2＋转运蛋白AT2G16800含有叶绿体定位信息．克隆该基因5’端编码转运肽的272bp片段，与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合后，在拟南芥中高效表达，对其进行了亚细胞定位的研究．转基因植株通过共聚焦扫描显微镜的观察，发现GFP荧光信号只存在于叶绿体中，该结果表明A他G16800为叶绿体蛋白．     

拟南芥（Arabidopsis thaliana）miR396分子对类神经酰胺酶基因表达的负调控

以拟南芥（Arabidopsis thaliana）miR396小分子为研究对象,分别克隆到了miR396小分子的两个前体（MIR396n,MJR3966）,得到转基因植株后,通过Microarray分析、Northern杂交以及遗传学分析的方法探讨了miR396与拟南芥类神经酰胺酶基因的关系。对miR396高表达转基因植株进行Microarray分析的结果表明,拟南芥类神经酰胺酶基因（Atceramidase-likel,Atceramidase-like2）在miR396高表达转基因植株中的表达与空载体转基因植株相比下降2倍以上,而4-alpha-乳糖基神经酰胺半乳糖转移酶则增加2倍以上。Northern杂交结果进一步验证了Microarray分析的结果,即在miR396高表达转基因植株中,拟南芥类神经酰胺酶基因的成员Atceramidase-likel和Atceramidase-like2表达水平均显著降低（分别减少6．8倍和2倍以上）,而Atceramidase-like3的表达水平在35S：MIR396a转基因植株叶中有所下降,在35S：MIR396b转基因植株叶中变化不明显。相反地,在35S：MIR396a和35S：MIR396b转基因植株叶中,miR396表达水平分别比空载体转基因植株增加2倍以上。上述研究结果说明拟南芥miR396能有效地负调控Ceramidase-likel和Ceramidase-like2等基因的表达水平。     

两类转基因烟草在实验和田间环境下的抗旱比较(英文)

尽管干旱应答基因在植物抗旱中的功能已得到广泛认可,但其在不同条件下对植物抗旱的贡献至今未见系统地比较和研究报道.本研究以转基因烟草为实验材料,对两类不同的基因,即干旱应答基因(如At DREB1B和At CBL1)及根系形态建成调节基因(如iaa M和At CKX3)的抗旱能力进行了比较.用根系特异启动子PYK10(P10)驱动At CKX3,35S:At CKX3和P10:iaa M进行烟草转化,结果表明其能明显促进转基因植株的根系生长和发育.虽然干旱应答基因(35S:At DREB1B,35S:At CBL1)以及35S:iaa M的转化植株在实验室可控条件下抗旱性明显提高,但是在田间条件下,这些转化植株对干旱胁迫却变得敏感.而根系形态建成调节基因(P10:At CKX3,35S:At CKX3,P10:iaa M)的转基因植株虽然在实验室环境下未表现抗旱,但在田间条件下能耐受干旱.该研究证明转基因植物的抗旱性会随着环境变化而改变,在田间自然条件下,操纵植物根系生长的基因对提高植物抗旱性更加重要.     

假俭草EoNLA基因克隆与其转基因拟南芥在不同磷水平下的表型鉴定

【目的】磷元素是植物必需的大量营养元素,在植物的生长发育中必不可少。NLA(nitrogen limitation adaptation)蛋白是一种RING型E3泛素连接酶,参与磷转运蛋白的泛素化调控,在植物体的磷素平衡调节方面发挥重要作用。以假俭草这类天然适应低磷土壤条件的植物为研究材料,通过研究假俭草EoNLA的磷高效转运分子机制,为草坪草适应酸性土壤生境的磷高效转运分子育种和栽培调控提供理论依据。【方法】通过RACE方法克隆获得EoNLA基因,应用生物信息学分析确定基因的全长序列及编码氨基酸序列,采用原生质体瞬时表达体系确定EoNLA蛋白膜定位;通过qRT-PCR方法分析EoNLA基因低磷诱导下的表达模式,并通过农杆菌介导转化拟南芥进行基因功能鉴定。【结果】EoNLA基因序列全长1 353 bp,编码一个长度为331个氨基酸的蛋白。该蛋白具有NLA蛋白典型的RING结构域和SPX结构域,EoNLA蛋白定位于细胞膜,EoNLA基因在根组织的表达量显著高于在茎和叶的表达。【结论】EoNLA基因具有根组织表达特异性,且基于拟南芥转基因植株进行的功能鉴定,进一步显示EoNLA基因具有磷素调控相关的功能。     

拟南芥AtJ2基因植物超量表达载体的构建

在胁迫条件下,分子伴侣可以稳定蛋白质结构,防止蛋白质凝聚变性,并修复受伤害蛋白.J蛋白是一类重要的分子伴侣.AtJ2是拟南芥(Arabidopsis thaliana)J蛋白中的一种.为研究该基因的功能,提取了拟南芥幼苗的总RNA,经过RT-PCR获得了AtJ2的全长.并将其构建入表达载体pMD中,得到重组质粒pMD/AtJ2.通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)将此重组质粒转化入拟南芥,得到了转基因植株,为后续该基因的功能研究奠定基础.     

龙眼DlIKU1基因的克隆与功能分析

拟南芥(Arabidopsis thaliana)IKU1基因突变可以产生较小的种子.根据植物IKU1同源基因的高度保守性,设计引物,PCR扩增获得龙眼(Dimocarpus longan Lour.)同源基因Dl IKU1的编码序列,其编码的蛋白含有VQ保守基序,与其他物种中同源蛋白的氨基酸序列存在较高的同源性;由于龙眼遗传转化的限制,构建Dl IKU1基因的超量表达载体并转化拟南芥iku1突变体,统计转基因植株子代种子的长宽变化,结果表明:龙眼Dl IKU1基因的超量表达可以显著增加拟南芥种子的大小,说明龙眼Dl IKU1基因可以影响种子发育.上述结果为研究龙眼种子发育机理提供了理论和实验依据,有助于龙眼产业的发展.     

棉花DELLA蛋白GhGAl4a基因在拟南芥中功能初步分析

为了探究棉花DELLA蛋白基因GhGAI4a在拟南芥中的功能,构建植物表达载体pBP35S：GhGAI4a和pBP35S：Ghgai4a,利用农杆菌介导的花滴法将其转入Col野生型拟南芥。结果显示,2个载体各自获得6个独立的转基因拟南芥纯合株系。分别统计48—96h种子萌发率,测量生长7d后幼苗的主根长度,与非转基因植株相比,过量表达GhGAI4a、Ghgai4a对拟南芥种子萌发及主根生长具有明显的抑制作用。1μmol／LGA处理转基因植株,GhGAI4a转基因植株主根长和萌发率均增大,而Ghgai4a转基因植株主根长度和萌发率均无显著变化。     

牡丹蔗糖转运蛋白基因PsSUT1的功能研究

蔗糖转运蛋白属于MFS家族，该家族是已知最大的转运体家族。本研究采用“TA”克隆技术，从‘洛阳红’牡丹中得到牡丹蔗糖转运蛋白基因PsSUT1,基因序列全长为1 846 bp,包含1 557 bp的开放阅读框，编码519个氨基酸。进化树分析显示该基因序列在进化过程中是保守的。蔗糖转运活性试验表明PsSUT1的表达使SUSY7/ura3酵母菌株能够在蔗糖为唯一碳源的培养基上生长，说明PsSUT1编码的蛋白具有蔗糖转运活性。亚细胞定位试验结果表明该蛋白定位于细胞膜。将PsSUT1基因异源转化拟南芥，结果表明PsSUT1转基因阳性苗与野生型拟南芥相比，地上部分干重平均增加了46.35%,株高增加了50.44%,种荚数增加了40.54%;拟南芥蔗糖耐受性检测中，PsSUT1转基因植株生长正常，根系明显比野生型拟南芥植株长，叶片发育也正常，没有花青素积累。本研究为改善盆栽牡丹生长与发育状况提供分子生物学方面的理论依据和技术支撑。     

棉花硫氧还蛋白基因GhWCRKC2-5参与开花调控的功能研究

目的 FLOWERING LOCUS T (FT)位于开花调控网络的中心,编码成花激素,不仅调控植物开花转变,还参与调控植物多方面的生长发育。硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)在植物的逆境胁迫中发挥着重要的生物学功能。方法我们前期克隆了一个棉花FT同源基因Gh FT1,利用酵母双杂技术筛选到一个与Gh FT1蛋白互作的硫氧还蛋白Gh WCRKC2-5。本研究采用RT-PCR技术从陆地棉中扩增了Gh WCRKC2-5基因的开放阅读框c DNA。该基因编码一个203个氨基酸的短肽,含有WCRKC保守氨基酸基序,为非典型的Trx。全基因组分析表明棉花中含有46个非典型的Trxs,系统进化分析显示Gh WCRKC2-5与Theobroma cacao的Tc WCRKC亲缘关系最近。q RT-PCR分析表明Gh WCRKC2-5基因在棉花根和花中表达较高,在茎、叶和顶端分生组织中表达较低;在纤维不同发育时期,Gh WCRKC2-5基因表达呈现出降低-升高-降低的趋势,在棉花开花后25 d时的纤维表达最高。结果在拟南芥中过量表达Gh WCRKC2-5基因,转基因拟南芥明显比野生型早花,并且转基因拟南芥的FT及开花通路中关键基因SUPPESSOR OF OVER EXPRESSION OF CONSTANS1 (SOC1)明显上调表达。利用病毒介导的基因沉默技术干扰Gh WCRKC2-5基因的表达,Gh WCRKC2-5沉默的植株比对照植株开花时间晚。结论 Gh WCRKC2-5基因在棉花的开花转变中起着重要作用,本研究为深入分析棉花开花调控机理奠定基础。     

拟南芥AtSuc3和AtSuc4基因的克隆及双价植物表达载体的构建

蔗糖转运蛋白在调节同化产物的分配过程中起重要作用。为了分析拟南芥蔗糖转运蛋白基因AtSuc3、At-Suc4的功能和协同作用,以哥伦比亚型拟南芥为材料,通过RT-PCR技术克隆了蔗糖转运蛋白基因(sucrose/H+cotransporters,SUCs)AtSuc3和AtSuc4的cDNA,利用甘薯贮藏蛋白基因(sporamin)的根部特异性启动子,构建了含有含有AtSuc3和AtSuc4 cDNA的单价植物表达载体pBI2301-q3-s3、pBI2301-q4-s4和双价植物表达载体pBI2301-q3-s3-q4-s4,为进一步分析该植物表达载体在调控库源关系中的作用以及在经济作物中的应用奠定基础。     

拟南芥中离子转运蛋白载体构建及烟草转化

植物修复是利用植物富集重金属离子及其化合物，并通过组织代谢去除环境污染物的环境修复技术．克隆了拟南芥中的两个金属离子转运蛋白基因ZAT1和IRT1并转化烟草，经PCR及GUS组织化学染色鉴定，ZAT1和ITRT1基因都已整合进表达载体，并获得了GUS染色阳性植株．这些工作为获得富集重全属离子的转基因烟草奠定了基础，将有效地促进植物修复技术的发展和应用。     

异源表达大豆GmNRT1-like提高拟南芥对低氮的耐受性

氮素是植物生长发育所需的重要元素,提高作物对氮素的利用效率可以减少化肥施用量并减轻对环境的污染,因此挖掘新的氮高效(NUE)基因成为了分子育种中的一项重要任务.在大豆中克隆到一个低氮上调表达的硝酸盐运输载体(NRT)家族成员Gm NRT1-like,进行了双元表达载体的构建并转化模式植物拟南芥,并在转基因拟南芥中对该基因功能进行了研究.研究结果表明,在低氮胁迫条件下,转基因植株产生更多的侧根,即其根系更发达.证明异源表达大豆Gm NRT1-like基因提高了拟南芥对低氮的耐受性.