葱蝇防御素基因的鉴定及针刺对基因表达的影响

【目的】分析葱蝇(Deliaantiqua)防御素基因家族的序列特征、分子进化和基因表达模式,了解防御素基因在滞育期的免疫应答特征。【方法】利用生物信息学方法,从转录组数据库中搜索防御素基因家族的序列,并进行基因鉴定、系统发育、选择压力及针刺刺激对基因表达的影响分析。【结果】共鉴定出3个防御素前体序列及由此形成的40个氨基酸残基组成的成熟肽Da Df1e ,Da Df2e 和 Da Df3e ,理论分子量分别为4.09,4.124.09k Da;等电点分别为8.71,8.69和8.35;它们具有昆虫防御素的典型的保守结构域,有3对分子内二硫键,均为外分泌型、稳定多肽。系统发育分析显示葱蝇防御素成熟肽Dadef1与新陆原伏蝇(Protophormiaterraenovae)、丝光绿蝇(Luciliasericata)和家蝇(Muscadomestica)防御素亲缘关系最近并聚为一枝,再与 Dadef2和 Dadef3聚为一枝。基因表达分析表明针刺能明显影响葱蝇防御素基因的表达。【结论】葱蝇防御素基因家族序列保守性高,具有典型的家族特征;它们的表达模式在冬滞育和非滞育蛹的不同发育时期存在明显差异,说明葱蝇冬滞育蛹和非滞育蛹的免疫应答存在差异。研究结果为进一步研究昆虫防御素类抗菌肽的结构特征、进化以及滞育条件下免疫活动提供理论基础。
     

葱蝇的实验室饲养、生物学特性及滞育诱导 （动物科学）

葱蝇是昆虫滞育分子机理、滞育期抗逆基因、冬滞育和夏滞育专化基因比较等研究的理想模式种,为开展昆虫滞育分子机理及抗逆基因研究,从日本引进葱蝇并设计了葱蝇的培养笼,首次在国内建立了稳定的实验室种群。基于早前的研究工作基础,对葱蝇最佳食物、人工饲养技术和条件、冬滞育和夏滞育诱导和终止条件作了进一步研究;并对各虫期、冬滞育和夏滞育期的生理和生物学特性作了进一步观察;成功地获得了供分子生物学研究需要的非滞育、冬滞育和夏滞育葱蝇各发育阶段的样品。特别重要的是,在本研究通过适度提高光照强度可以使所有实验蛹进入夏滞育。因此,本实验室能够获得100%的冬滞育和夏滞育蛹。本文报道和总结葱蝇的实验室饲养技术、各虫态主要生物学习性,以及冬滞育和夏滞育的诱导和终止策略。     

白菜防御素基因的预测及结构功能分析

采用生物信息学的方法,通过已知防御素基因家族基因氨基酸序列在线Blast相似性比对,对白菜(Brassicarapa)基因组中防御素基因进行了预测和鉴定,分析了防御素基因在进化过程中各部分结构,包括上游区域、启动子区域、外显子区域、内含子区域以及UTR区域的结构变异以及功能变异,对该基因上游序列顺式作用元件和表达模式进行了预测。分析结果表明,白菜防御素基因编码60～80个氨基酸短肽,编码氨基酸均具有8个保守的半胱氨酸;白菜防御素基因功能结构域保持相对稳定,但部分基因成员前端信号肽序列出现变异;内含子长度出现增长、缩短、消失等3种变异模式;该基因上游启动子区域核苷酸变异较其他区域显著,上游序列顺式作用元件大多与光应答、逆境胁迫应答和信号分子应答相关。该基因表达模式预测结果表明白菜防御素基因在进化过程中可能出现分化,主要体现在基因沉默和表达部位的差异。     

葱蝇非滞育蛹的全长cDNA文库构建

葱蝇具有兼性滞育的特性且与果蝇近缘,是昆虫滞育分子机理和冬滞育和夏滞育专化基因比较研究的理想模式种,本研究目的在于构建葱蝇非滞育蛹的全长cDNA文库,为进一步的滞育专化基因筛选、克隆和表达分析奠定基础。利用RNAiso试剂提取葱蝇非滞育蛹的总RNA,采用SMART技术合成全长cDNA,将限制性内切酶SfiⅠ消化后的cDNA克隆到质粒载体pDNR-LIB,转化入大肠杆菌(DH10B),获得原始文库。经过涂平板测定表明,原始文库的库容量为2.3×107个单克隆;随机挑取15个单克隆,通过PCR快速鉴定,插入片段大小在0.4~1.2 kb之间,平均大小在0.9 kb,重组率达100%。这些结果表明本研究所构建文库的代表性和重组片段的序列完整性达到了用于目的基因的分离筛选和克隆表达的建库要求。     

葱蝇己糖激酶基因的鉴定、特征分析及在滞育期的表达分析

基于转录组数据,首次鉴定了葱蝇(Delia antiqua)2条己糖激酶(Hexokinase,HXK)基因分别命名为Da HXK-1和Da HXK-2。Da HXK-1基因含有1 544 bp的开放阅读框,编码513个氨基酸,相对分子量和理论等电点分别为58.3k D和5.97;Da HXK-2基因的开放阅读框为2 512 bp,编码819个氨基酸,相对分子量和理论等电点分别为91.1 k D和9.19,二者编码的蛋白同为胞质型蛋白,具有该酶蛋白质典型的保守结构域,且与家蝇(Musca domestica)Md HXK-1和Md HXK-2蛋白的同源性分别为74%和78%;系统发育分析显示它们与其他双翅目(Diptera)昆虫的己糖激酶的进化关系最近,表明己糖激酶在进化过程中比较保守。基因表达分析显示Da HXK-1和Da HXK-2基因在夏滞育蛹中都下调表达;Da HXK-1基因在冬滞育蛹中的表达呈先上升后下降趋势,Da HXK-2基因的表达模式则相反。研究认为Da HXK-1和Da HXK-2基因的不同表达模式可能与组织特异性有关。
     

野蚕DH—PBAN基因启动子的克隆及序列分析

为研究昆虫滞育激素－性信息素合成激活肽基因在进化过程中的变化以及基因表达调控的异同，用ＰＣＲ方法克隆了野蚕的ＤＨ－ＰＢＡＮ基因的启动子并测序，     

葱蝇谷胱甘肽S - 转移酶基因的克隆与序列分析(动物科学)

谷胱苷肽S-转移酶(GST)是昆虫体内广泛存在的一类解毒酶,可以保护机体免受内源性或氧化物的损害。昆虫对一些杀虫剂的抗性与GST表达水平增高有关。GST的研究主要集中在杀虫剂抗性上,可将其作为昆虫的药物靶标,设计和开发新型的杀虫剂。采用RACE的方法,克隆了葱蝇(Delia antiqua)GST基因cDNA的全长序列(GenBank登录号:JQ625502),获得的cDNA全长874bp,其中阅读框ORF 627bp,编码208个氨基酸,推测其相对分子质量为23.9kD,等电点为5.83。通过该基因推导的氨基酸序列与其它物种的GST蛋白进行相似性比较和系统发育分析,发现葱蝇与丝光绿蝇(Lucilia cuprina)的谷胱甘肽转移酶氨基酸序列同源性最高。该结果进一步丰富了GST基因的基础数据,有助于葱蝇的杀虫剂抗性机理和发育机理的相关研究。     

古菌、细菌和真核生物纤维素酶的整体进化关系

【目的】纤维素酶在生物燃料、食品、造纸、制药和纺织工业应用广泛。许多生物都能产生纤维素酶,因此纤维素酶的进化关系非常复杂;加上人类用工程手段不断改造纤维素酶,使得纤维素酶的进化关系更加复杂化。因此,本研究对纤维素酶的整体进化关系进行大规模的系统发育和统计分析。【方法】选取来自116种古菌、1744种细菌和556种真核生物的2416种纤维素酶进行系统进化分析。通过计算平均成对p距离反映每个分类组中的序列差异;然后将差异分为组内差异和组间差异,从数值上反映基因的垂直转移和水平转移;最后,通过进化树展示基因转移的趋势。【结果】来自不同门、纲、目、科和属的纤维素酶,其氨基酸序列的平均成对p距离差异很大。在各个系统分类中,纤维素酶的组间差异和组内差异亦存在很大不同。大规模的系统发育分析显示,大多数纤维素酶的进化经历了不同的路径和分岔,并形成相互交织在一起的群簇。【结论】本研究从统计分析和系统发育的角度提供纤维素酶的整体进化关系,不仅包括纤维素酶基因的垂直遗传和水平转移,还包括多时间和多种属进化,展示了纤维素酶进化的全貌。统计分析不仅丰富系统发育的分析结果,还为利用生物技术设计所需要的纤维素酶提供补充信息。     

杨树GABA支路3个基因家族的鉴定和表达分析

【目的】 γ-氨基丁酸(GABA)与植物的生长发育有着密切的联系。结合前期对GABA抑制杨树不定根发育的研究,对GABA支路基因家族的特征和表达模式进行研究,为进一步解释其在不定根发育中的作用奠定基础。【方法】从银白杨(Populus alba)×P. glandulosa ‘84K’(‘84K’杨)基因组中鉴定出GABA支路的PopGAD、PopGABA-T和PopSSADH 3个基因家族成员,并利用生物信息学方法分析其特征,以及与其他物种相关基因家族的亲缘关系;利用qRT-PCR研究外源GABA及其降解抑制剂vigabatrin(VGB)对各基因表达的影响。【结果】①PopGAD、PopGABA-T和PopSSADH 3个基因家族成员数量依次为6、2和2个,启动子序列中主要包含与光、激素和环境等响应相关元件。②系统进化分析表明,PopGAD家族中PopGAD6与家族其他成员亲缘关系较远;PopGABA-T和PopSSADH家族中的两个基因成员亲缘关系较近。③基因表达分析表明,不定根生长过程中GABA支路基因总体上在根中表达量高于茎和叶。外源GABA或VGB处理对PopGAD和PopGABA-T两个基因家族成员在根、茎和叶中的表达量影响程度不同,但对 PopSSADH基因家族的表达则无明显影响。【结论】 GABA支路3个基因家族在‘84K’杨树响应光、激素和环境胁迫等方面具有重要作用。外源GABA和VGB处理对PopGAD和PopGABA-T家族成员的影响较大,并且均在根中表达量最高,表明这两个基因家族在不定根生长过程中发挥着重要调控功能。这为深入解析GABA在树木不定根发生中的作用机制奠定了基础。     

古菌、细菌和真核生物纤维素酶的整体进化关系（英文）

【目的】纤维素酶在生物燃料、食品、造纸、制药和纺织工业应用广泛。许多生物都能产生纤维素酶,因此纤维素酶的进化关系非常复杂;加上人类用工程手段不断改造纤维素酶,使得纤维素酶的进化关系更加复杂化。因此,本研究对纤维素酶的整体进化关系进行大规模的系统发育和统计分析。【方法】选取来自116种古菌、1 744种细菌和556种真核生物的2 416种纤维素酶进行系统进化分析。通过计算平均成对p距离反映每个分类组中的序列差异;然后将差异分为组内差异和组间差异,从数值上反映基因的垂直转移和水平转移;最后,通过进化树展示基因转移的趋势。【结果】来自不同门、纲、目、科和属的纤维素酶,其氨基酸序列的平均成对p距离差异很大。在各个系统分类中,纤维素酶的组间差异和组内差异亦存在很大不同。大规模的系统发育分析显示,大多数纤维素酶的进化经历了不同的路径和分岔,并形成相互交织在一起的群簇。【结论】本研究从统计分析和系统发育的角度提供纤维素酶的整体进化关系,不仅包括纤维素酶基因的垂直遗传和水平转移,还包括多时间和多种属进化,展示了纤维素酶进化的全貌。统计分析不仅丰富系统发育的分析结果,还为利用生物技术设计所需要的纤维素酶提供补充信息。     

中华按蚊AsBe3基因的克隆、生物信息学分析与分子对接

【目的】克隆中华按蚊(Anopheles sinensis)羧酸酯酶基因AsBe3,并对该基因进行生物信息学和分子对接分析。【方法】克隆AsBe3基因编码序列,并在AsBe3蛋白的理化性质、系统发生关系、二级结构、多重序列比对、系统发育关系等方面对进行了预测和分析;通过同源建模和分子对接,分析AsBe3蛋白与氟氯氰菊酯形成稳定复合物的关键氨基酸残基。【结果】通过克隆得到了编码AsBe3基因的序列,大小为1 302bp。在系统发育关系方面,AsBe3蛋白在8种不同物种中具有很高的保守性。AsBe3蛋白是疏水性蛋白,相对分子质量为48.45kDa,无信号肽和跨膜区。氟氯氰菊酯与AsBe3蛋白的结合自由能约为-42.3kJ·mol~(-1),理论上AsBe3蛋白能够代谢氟氯氰菊酯。【结论】研究结果为后续对AsBe3基因进行生物学功能研究奠定了基础,为下一步开展AsBe3蛋白代谢研究提供了基础数据,也为阐释羧酸酯酶代谢抗性的分子机制提供了理论依据。     

10种昆虫过氧化氢酶基因的全基因组鉴定与特征预测

【目的】在全基因组水平上鉴定10种具有代表性昆虫的过氧化氢酶(CAT)基因,并对鉴定所得CAT基因的基本特征和系统发育关系分别进行预测和分析。【方法】在NCBI数据库中下载CAT氨基酸序列作为询问序列,通过本地Blast方法在10种昆虫全基因组水平搜索和鉴定CAT基因并命名。通过生物信息学方法预测10种昆虫CAT家族基因的特征、氨基酸同源序列一致率、保守结构域等。通过MEGA-X软件用最大似然法推断10种昆虫的CAT基因的系统发育。【结果】共鉴定得到23个CAT基因,内华达古白蚁(Zootermopsis nevadensis)、东亚飞蝗(Locusta migratoria)、人虱(Pediculus humanus)、苜蓿蓟马(Frankliniella occidentalis)、茶翅蝽(Halyomorpha halys)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、家蚕(Bombyx mori)和意大利蜜蜂(Apis mellifera)基因组上分别有3,1,1,1,4,3,2,1,6和1个CAT基因,均具有全长的转录组序列,编码406～553个氨基酸,氨基酸分子量为46.0～63.7kDa,等电点为5.21～9.19。鉴定得到的CAT基因共有122个外显子,99个内含子,且外显子与内含子分布模式在物种间差异较大而种内的CAT基因结构相似。有7个CAT基因编码有信号肽,信号肽包含17～22个氨基酸残基。所有CAT基因编码的氨基酸序列的N端具有1个由17个氨基酸组成的CAT近端活性区域,而C端由9个氨基酸组成的CAT血红素配体区域所组成;其中家蚕的BmCat2基因中单独含有1个细菌胞外溶质结合区域。10种昆虫的CAT1基因具有1∶1的直系同源关系,家蚕出现特异性扩增独立形成支系,与CAT1支系互为姐妹群。【结论】研究结果提供了10个代表性昆虫CAT基因的基础信息,为进一步开展该基因的功能研究奠定了基础。     

棉铃虫滞育解除的相关基因鉴定

运用差异显示PCR(DD-PCR)方法分析棉铃虫滞育解除蛹差异表达的基因,结果得到了56个差异片段.通过RT-PCR和Real-time PCR的方法,鉴定了滞育解除过程中有3个基因表达量在下调,有4个基因表达量在上调.这7个差异表达基因中有3个和已知的基因有较高的同源性:FKBP12,esr16和NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex subunit 6.这些差异基因为今后研究滞育解除的分子机制提供了新的线索.     

蝽次目线粒体基因组特征及系统发育关系重建全文替换

目前GenBank数据库共收录122种蝽次目昆虫全线粒体基因组序列,比较分析其13个蛋白质编码基因的密码子使用情况、核苷酸进化速率及核苷酸序列信息位点等序列特征,归纳蝽次目tRNA基因的重排现象,同时基于蛋白质编码基因用贝叶斯法和最大似然法重建蝽次目系统发育树,最终为蝽次目昆虫的分子进化信息进行了分析和补充,为蝽次目的系统发育分析奠定了良好基础.两种方法构建的系统发育树结果基本一致,分支关系如下：(扁蝽总科+(蝽总科+(缘蝽总科+(红蝽总科+长蝽总科)))).     

3个茶树品种WOX基因家族的进化及密码子偏好性比较

【目的】WOX基因家族在模式植物组织培养中扮演着重要的分子调控角色。非模式植物WOX基因家族的系统发育和密码子使用偏好性研究有助于探索遗传进化规律和基因表达特征,进而为其转基因体系构建提供指导。【方法】利用生物信息学方法在3个茶树品种全基因组数据中鉴定WOX基因;通过ClustalX 2.1和MEGA X软件探索它们的进化规律。运用Perl语言、Codon W 1.4.2程序和SPSS 23.0等软件分析3个茶树品种WOX基因编码序列,探究它们的密码子使用偏好模式;基于ENc-GC_3s、PR2分析和中性分析结果解析影响密码子偏好的主要因素。【结果】共鉴定出42个WOX成员,其中‘云抗10号’(CSA)11个,‘舒茶早’(CSS)18个,‘云南野生古茶DASZ’(DASZ)13个,系统发育揭示3个茶树品种WOX基因在进化上存在较强的保守性。密码子偏好性分析揭示,3个茶树品种WOX基因密码子都偏好使用A/T和以A/T结尾;CSA和DASZ的WOX基因密码子使用模式相似,表明两者亲缘关系较近;以CSA和CSS作为转基因受体时,3个茶树品种WOX基因中个别密码子需优化;烟草是3个茶树品种WOX基因的最佳异源表达受体;ENc-GC_3s绘图、PR2分析和中性分析表明自然选择是影响3个茶树品种WOX基因密码子使用偏倚的主要因素。【结论】3个茶树品种WOX基因进化上较保守,密码子偏好使用A/T和以A/T结尾,且密码子偏好原因主要是自然选择;揭示出转茶树时密码子的优化信息和烟草为最佳异源表达受体的结果。     

杨树根特异性表达β-果糖苷酶抑制子的功能性验证

【目的】植物细胞壁转化酶(CWI)和液泡转化酶(VI)是分配碳水化合物、维持库器官强度和环境胁迫应答的重要因子。大量证据表明CWI和VI由β-果糖苷酶蛋白抑制子的翻译后调控机制介导。然而,关于C/VIFs家族的分子和遗传学基础以及生化特性研究目前还不清楚。【方法】应用生物信息学分析基因结构特征和系统进化关系,并利用实时荧光定量PCR研究转录本在组织中的丰富度。同时,结合烟草叶片瞬时和拟南芥遗传转化法的荧光表达,以及重组蛋白系统分别对PtC/VIF1亚细胞定位特征和体外抑制活性进行深入鉴定。【结果】共39个PtC/VIF候选编码基因家族被筛选出来。PtC/VIF1在根中具有高转录水平;共聚焦显微镜观察证实PtC/VIF1是分泌到细胞外空间。重组蛋白活性检测表明其对CWI蛋白具有特异的亲和抑制活性,说明PtC/VIF1是定位于质外体的β-果糖苷酶抑制子。【结论】对C/VIF编码基因家族生物信息学分析和PtC/VIF1在杨树中的功能性鉴定属于首次报道,可为后期进一步深入探索该基因的生理学作用和参与抗病防御路径以及环境胁迫响应的潜在功能提供理论基础和研究依据。     

野蚕DHPBAN基因启动子的克隆及序列分析

为研究昆虫滞育激素性信息素合成激活肽基因在进化过程中的变化以及基因表达调控的异同,用ＰＣＲ方法克隆了野蚕的ＤＨＰＢＡＮ基因的启动子并测序,这是第二个被克隆的昆虫ＤＨＰＢＡＮ基因启动子．与家蚕相比,在核苷酸水平上同源性达９４％．野蚕ＤＨＰＢＡＮ基因启动子的ＴＡＴＡ框的保守序列为ＴＡＴＡＴＡＡＡ,位于－４７—－４０处;ＣＡＡＴ框是ＧＧＣＣＣＡＴＣＴ,位于－８３—－７５处;野蚕与家蚕一样具有ＴＡＡＴ保守序列,这段序列是一类调控蛋白的结合核心位点,家蚕的位于－１８５—－１７６,野蚕的位于－１７６—－１６７．在－６４—－５６部位,核苷酸序列表现出较大的不同．     

大熊猫与北极熊基因组中V1R基因的分布与序列分析

【目的】对大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)和北极熊(Ursus maritimus)的犁鼻器受体基因V1R进行筛选和生物信息学分析。【方法】用已报道过的小鼠(Mus musculus)和大鼠(Ruttus norvegicus)全长V1R基因作为查询序列,分别检索大熊猫和北极熊基因组序列,并将得到的大熊猫和北极熊V1R基因序列与从NCBI下载已报道的狗(Canis lupus)、大鼠、小鼠和猫(Felis catus)的V1R基因序列一起用邻接法重建系统发育关系(Bootstrap值设为1 000)。【结果】大熊猫基因组中共有72个V1R基因,其中13个V1R基因序列包含完整的开放阅读框架;北极熊基因组中有24个V1R基因;大熊猫和北极熊V1R基因在整个基因组上分布并不集中,从系统发育树上看,不同物种之间V1R基因有很大分化。【结论】不同的物种之间的V1R基因存在一定的分化,大熊猫和北极熊在进化过程中均存在V1R基因的大量丢失情况。     

昆虫滞育相关激素调节的研究进展 (动物科学)

昆虫的生长发育离不开激素的调节。滞育作为昆虫特殊的发育状态,其特征是代谢活动显著降低,发育停滞。在滞育发育过程中,各类激素通常相互协调形成网络,发挥着重要的调节作用。在神经内分泌系统中,由神经细胞分泌的神经肽类激素通常作为上游调控激素,通过调节下游激素的合成和分泌从而影响昆虫的滞育发育;蜕皮激素和保幼激素作为下游激素参与到神经肽类激素的调控网络中。目前已克隆得到滞育激素-性信息素合成激活肽和促前胸腺激素的基因,并对二者在不同滞育型昆虫中的调节作用进行了深入研究。此外,激素受体的研究将为解释激素之间的相互作用提供重要依据;而通过滞育昆虫体内激素水平的调节将为有害昆虫生物防治提供新的方法。     

大熊猫与北极熊基因组中V1R基因的分布与序列分析

【目的】对大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)和北极熊(Ursusmaritimus)的犁鼻器受体基因V1R 进行筛选和生物信息学分析。【方法】用已报道过的小鼠(Mus musculus)和大鼠(Ruttus norvegicus)全长V1R 基因作为查询序列,分别检索大熊猫和北极熊基因组序列,并将得到的大熊猫和北极熊V1R 基因序列与从NCBI下载已报道的狗(Canis lupus)、大鼠、小鼠和猫(Felis catus)的V1R 基因序列一起用邻接法重建系统发育关系(Bootstrap值设为1000)。【结果】大熊猫基因组中共有72个V1R 基因,其中13个V1R 基因序列包含完整的开放阅读框架;北极熊基因组中有24个V1R 基因;大熊猫和北极熊V1R 基因在整个基因组上分布并不集中,从系统发育树上看,不同物种之间V1R 基因有很大分化。【结论】不同的物种之间的V1R 基因存在一定的分化,大熊猫和北极熊在进化过程中均存在V1R 基因的大量丢失情况。