气相色谱/质谱法检测壬基酚在大鼠睾丸支持细胞中的分布

壬基酚(NP)是一种环境内分泌干扰物,具有类雌激素作用,它的高稳定性和脂溶性的特点使其能够在有机体,特别是脂肪组织内聚集,对人类的生殖系统产生毒害作用,因其分子结构与细胞膜的磷脂分子很相似,故与磷脂分子有很高的亲和力.为了探讨NP对生殖细胞的毒理机制,了解其在细胞内的分布情况,建立大鼠睾丸支持细胞NP含量的高效气相色谱及质谱(即GC/MS)检测方法,观察NP在细胞中的分布.实验采用原代培养的大鼠睾丸支持细胞,通过带有CY3标记的抗体对其质膜上特异表达的卵泡刺激素受体(FSHR)进行免疫荧光染色,鉴定支持细胞.然后用10μmol/L和20μmol/L的NP分别作用细胞3 h6、h1、2 h2、4 h后,超声破碎,并对10μmol/L NP处理的样品用改进的三步离心法进行细胞质膜分离,GC/MS方法检测NP在细胞中的总含量,以及细胞膜中NP含量占细胞中的总含量的比例.结果显示培养的细胞均呈现绿色荧光,都表达FSHR.两步离心的质膜分离方法,膜纯度为33.22%,改进的三步离心法膜纯度为78.60%.另外,分别在10μmol/L和20μmol/L NP浓度下,随着作用时间的延长,NP在细胞中的总含量逐渐增加至12 h,在24 h时突然下降至3 h的水平.细胞膜中NP含量占细胞中的总含量的比例,随着作用时间的延长而降低.由此得出结论是:FSHR可以作为大鼠睾丸支持细胞的鉴定指标;三步离心的质膜分离方法得到的膜纯度远远高于两步离心法;虽然NP与磷脂分子有很高的亲和力,但随着作用时间的延长,NP并没有停留在细胞膜里,而是能够穿过细胞膜进入到细胞内,并主要分布在细胞内.     

DBP对大鼠睾丸支持细胞内Ca2+、线粒体膜电位及Caspase活性的影响

目的通过测定DBP对大鼠睾丸支持细胞内Ca2+、线粒体膜电位及Caspase活性的影响,探讨DBP是否通过影响线粒体膜电位而引起支持细胞凋亡.方法建立支持细胞原代培养体系,将细胞分为0.1%DMSO(对照组)、1 mg/L(低剂量组)、10 mg/L(中剂量组)、100 mg/L(高剂量组),分别处理细胞24 h;荧光分光光度计测定支持细胞内Ca2+的浓度,流式细胞仪检测线粒体膜电位,酶标仪测定Caspase-9和Caspase-3的活性.结果与对照组相比,高剂量组中Ca2+浓度明显升高,差异具有统计学意义(P0.05),而低、中剂量组与对照组比较无统计学意义(P0.05).DBP导致的线粒体膜电位升高在中、高剂量组中具有统计学意义(P0.05),随着DBP浓度的增加,Caspase-9与Caspase-3的活性升高,差异均具有统计学意义(P0.05).结论 DBP能显著降低支持细胞线粒体膜电位,改变线粒体膜的通透性,进一步升高Caspase-9及Caspase-3的活性,并最终导致睾丸支持细胞凋亡.     

山奈酚抑制人胆囊癌细胞增殖及其对mTORC1通路的影响

目的:探讨山奈酚对人胆囊癌细胞(SGC-996细胞)增殖的影响及其机制.方法:采用浓度为0、25、50、75、100、125、150、175μmol/L的山奈酚干预SGC-996细胞24、48、72 h后,CCK-8法检测SGC-996细胞的体外增殖能力;干预48 h后,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Western blot法检测P-S6K1及P-S6等哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)途径相关蛋白的表达.结果:干预24 h时,浓度为0～175μmol/L的山奈酚对SGC-996细胞增殖的抑制作用不明显;干预48 h时,浓度为75μmol/L及以上的山奈酚可明显抑制SGC-996细胞的增殖(P0.05);干预72 h时,浓度为50μmol/L的山奈酚也可显著抑制SGC-996细胞的增殖(P0.05).浓度为100μmol/L山奈酚干预48 h,可显著诱导细胞凋亡(P0.05),显著降低P-S6K1和P-S6蛋白的表达水平(P0.05).结论:在一定浓度范围内,山奈酚随浓度的增加和时间的延长而明显抑制SGC-996细胞的增殖,并诱导其凋亡,而对细胞增殖的抑制作用可能是通过影响mTORC1信号通路实现的.     

FSK88对UMR106细胞中cbfa1基因表达的影响

以大鼠成骨肉瘤细胞--UMR106为模型,应用RT-PCR方法,检测用不同浓度的FSK88药液(25,50,100μmol/L)、维甲酸(RA,10 μmol/L,阳性对照)以及FSK88 RA(等体积)混合药液处理细胞72 h后,细胞内cbfa1基因表达量的变化.3次重复实验显示:与对照组相比,经25,50,100μmol/L 3种浓度FSK88药液处理的细胞内cbfa1基因表达量分别增加35.5%,64.5%,124.0%.其中用100μmol/L的FSK88处理细胞后,cbfa1基因表达量有显著的上调(P＜0.01),并且上调作用强于10 μmol/L的维甲酸药液.证明FSK88能够通过直接或间接增强UMR106细胞中cbfa1基因的表达,从而促进肿瘤细胞向正常细胞逆转分化.     

双酚A类同系物的雌激素效应及对MCF-7细胞的毒性

双酚A(bisphenol A, BPA)及其类似物作为聚碳酸酯的主要合成原料, 一直是环境污染的重要问题, 其环境分布及人体暴露是当今科学研究的热点. 为评估环境中BPA 类物质的毒性效应, 采用MTT 比色法检测了7 种BPA 类同系物对人雌激素受体(estrogen receptor,ER)缺失乳腺癌细胞MCF-7(ER–) 增殖活性的影响. 通过检测细胞乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)露出率评估了目标物对MCF-7 细胞膜的损伤, 结果表明, 在0.01～1.00 μmol/L 浓度范围内, 受试化合物对MCF-7 细胞的毒性较小, LDH 少量露出; 而在10 和100 μmol/L 浓度下, 细胞增殖受到显著抑制, 细胞膜通透性显著改变, LDH大量露出. 同时采用ER 基因双杂交酵母实验检验了这几种BPA 类同系物的雌激素效应大小, 通过Logistic 模型对曲线进行了拟合, 并以模型估算的半数透导活性(EC50) 评估了7 种BPA 类同系物的雌激素效应活性, 其大小依次为TDP>BPAF>4Cl-BPA>BPC>BPA>BPE>BPAP. 这说明其雌激素效应机制可能是通过和ER 结合而产生的.     

虫草素对β-淀粉样蛋白诱导PC12细胞损伤的保护作用

目的应用Aβ25-35孵育PC12细胞制作细胞损伤模型,探讨虫草素对PC12细胞损伤的保护作用.方法将不同组别PC12细胞用Aβ25-35诱导48 h后,采用MTT法测定细胞活力,LDH法测定细胞膜通透性,化学比色法测定细胞中SOD活性和MDA含量,Western blot法检测PC12细胞中Caspase-3的表达.结果与模型组相比,两种剂量的虫草素均使细胞存活率显著增加,细胞培养上清中LDH含量显著减少,细胞中SOD活性显著升高,MDA含量显著下降,并明显降低PC12细胞Caspase-3的表达.结论虫草素对Aβ25-35诱导的PC12细胞死亡、氧化损伤和细胞凋亡有明显保护作用.     

山奈酚对人小细胞肺癌H446细胞凋亡的影响

研究山奈酚诱导人小细胞肺癌H446细胞凋亡的作用及可能的作用机制.采用MTT法检测山奈酚对小细胞肺癌H446细胞增殖的抑制作用;采用DAPI染色检测经山奈酚处理后细胞凋亡的形态变化;采用RT-PCR和Western-blot技术检测山奈酚处理前后H446细胞p53,bax,bcl-2 mRNA和蛋白的表达.结果显示,不同浓度的山奈酚能抑制人小细胞肺癌H446细胞生长,且随浓度增加抑制作用增强;H446细胞在山奈酚诱导下出现典型的凋亡形态;20μmol/L以上浓度的山奈酚处理后,p53,bax mRNA和相应蛋白表达均升高,而bcl-2 mRNA和蛋白表达降低.研究表明,山奈酚对H446细胞增殖有抑制作用,并能促进其凋亡.p53,bax和bcl-2在山奈酚诱导人小细胞肺癌H446细胞凋亡中起重要作用.     

依地福新抑制Jurkat细胞生长机制的研究

目的观察依地福新对体外培养的Jurkat细胞的生长抑制作用,并进一步探讨其作用机制。方法应用MTT法检测细胞增殖活性;流式细胞仪检测细胞周期分布;Annexin V—FITC染色法检测细胞凋亡率。结果不同浓度依地福新处理Jurkat细胞24～96h后,细胞增殖显著受到抑制,并呈现浓度及时间依赖性;1．0μmol／L、5．0ymol／L、10．0μmol／L依地福新处理72h后,Jurkat细胞G0／G1期细胞数量显著增加,S期细胞数量显著降低（P〈0．01）;各浓度组细胞凋亡率均显著增加（P〈0．01）。结论依地福新对Jurkat细胞具有生长抑制作用,其机制与阻滞细胞周期及诱导凋亡有关。     

葡萄糖浓度波动对人肝L02细胞损伤的实验研究

研究了葡萄糖浓度波动对于体外培养的人肝实质L02细胞的影响以及可能的机制.利用人肝实质细胞株L02进行传代培养.实验共分为4组:正常组(N)、持续高糖组(HG)、波动组(GF)和渗透压对照组(OP).各组细胞培养72 h后,测定培养液中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)活力,肝细胞内糖原含量,谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化酶歧化酶(SOD)、Na~+K~+-ATP酶和Ca~(2+)Mg~(2+)-ATP酶的活力,胞内游离钙离子([Ca~(2+)]_i)浓度以及细胞膜的流动性.高糖组和波动组细胞培养液中ALT,AST和LDH活力上升,细胞内GSH,SOD,Na~+K~+ATP酶和Ca~(2+)Mg~(2+)-ATP酶活性均下降,MDA和糖原含量上升,细胞膜流动性下降;高糖组和波动组与正常组比较均差异显著(p0.001),波动组较高糖组也有显著差异(p0.01).葡萄糖浓度波动能够导致细胞膜通透性的改变和细胞内酶的严重泄漏,同时对肝细胞有明显的氧化损伤和毒性作用,而且比单纯的高糖对肝细胞的损害更为明显和严重.     

三氮唑席夫碱衍生物诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡作用

用不同浓度的3-吡啶-3-基-4-[(4-羟基-3-甲氧基-苯亚甲基)氨基]-5-甲硫基-1,2,4-三唑(LH-37)处理细胞,观察其对人肝癌细胞SMMC-7721的凋亡诱导作用. 结果发现,LH-37可抑制细胞增殖,且抑制率随浓度的增加而增高,IC50为2.0×10-4 mol/L;药物浓度为1×10-5 mol/L时作用48 h,SMMC-7721细胞皱缩,呈现凋亡各期改变,Caspase-3阳性细胞明显增加,细胞凋亡率显著高于对照组的现象(P＜0.05).     

人参皂甙Rb1和Rg1对小鼠睾丸支持细胞增殖的影响

观察人参皂甙Rb1(ginsenodde Rb1,GRb1)和Rg1(ginsenoside Rg1,GRg1)对体外培养的小鼠睾丸支持细胞(sertoli cell)增殖的影响,探讨二者的药理作用机制.取原代培养传代一次第3天的支持细胞,加入不同浓度的GRb1和GRg1,利用MTT比色分析法和BrdU增殖细胞标记法,检测不同浓度GRb1和GRg1对体外培养支持细胞增殖的影响.结果显示,20 mg/L GRb1对支持细胞增殖有明显促进作用,而不同浓度的GRg1对支持细胞的增殖无明显影响.GRb1能维持小鼠支持细胞的存活,并在适当浓度范围内可以明显促进支持细胞的增殖,而GRg1对支持细胞的增殖无明显影响.     

人参皂甙Rb1对体外培养的小鼠支持细胞增殖作用的研究

观察人参皂甙Rb1(ginsenoside Rb1,GRb1)对体外培养的小鼠支持细胞增殖能力的影响,探讨其促进精子发生的作用机制.采用多次贴壁法纯化原代培养的支持细胞,取体外培养第2代第3天的支持细胞,利用MTT比色分析法和Brdu增殖细胞标记法,检测不同质量浓度GRb1对体外培养支持细胞增殖的影响.20 mg/LGRb1对支持细胞增殖有明显促进作用.GRb1能维持小鼠支持细胞的存活,并在适当质量浓度范围内可以明显促进支持细胞的增殖,从而为进一步探讨GRb1的药理作用及精子发生的机理提供一些研究基础.     

犬睾丸原发性特有肿瘤的病理学观察与分析

摘要: 目的对三类犬睾丸原发性特有肿瘤进行病理学诊断和分析,探讨犬睾丸原发性肿瘤的病理学特点,为诊断睾丸原发性肿瘤提供资料。方法中国农业大学国家动物海绵状脑病实验室收集来自动物医院的临床犬睾丸肿物病例,从2013 年至2015 年共35 例,制成切片,HE 染色,根据病理学特征进行诊断与鉴别诊断、比较肿瘤细胞形态特征、根据组织学特点鉴别细胞起源,总结三类肿瘤的病理学特点和鉴别诊断要点。结果观察比较犬精原细胞瘤、支持细胞瘤、间质细胞瘤的组织病理学特征,总结犬睾丸肿瘤的临床特征,为今后该类肿瘤的诊断与鉴别诊断提供有效资料。结论精原细胞瘤、支持细胞瘤和间质细胞瘤为睾丸常见的原发性肿瘤,常见于老年犬,恶性睾丸肿瘤的发病率低。由于肿瘤细胞来源不同,呈现出不同的组织病理学特征。     

北方山溪鲵精巢支持细胞的显微与超微结构观察

用光镜和电镜观察了山溪鲵精巢内支持细胞的显微和超微结构．结果表明，在精原细胞增生期，支持细胞间存在镶嵌连接，与精原细胞增生以及生精小囊的体积变大相适应；在精子形成期，支持细胞具有典型的类固醇激素分泌特征；精子成熟后，支持细胞退化．并对生精细胞和支持细胞的关系进行了讨论．     

雌二醇强化壬基酚雄性毒性机理研究

为了揭示壬基酚进入生物体内后对雄性的毒性作用机制,以典型天然激素雌二醇(E2)为代表,以大鼠睾丸支持细胞为对象,研究了壬基酚与E2共存时对雄性生殖细胞的毒性并考察了其作用机理.研究结果表明,壬基酚与E2均能促进睾丸支持细胞增殖,表现出较强的雄性毒性,混合后呈现明显的强化效应,比二者单独作用高.对细胞中特征蛋白-波形蛋白的检测发现,E2不影响波形蛋白的表达,壬基酚可提高其表达,而混合物可明显提高其表达.机理分析表明,在丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的3条通路中,ERK通路是E2强化壬基酚毒性的关键通路.壬基酚降低ERK蛋白的表达,E2轻微降低ERK蛋白的表达,混合后反而诱导ERK蛋白的表达.壬基酚能够显著诱导p-JNK蛋白、p38蛋白的表达,但与E2混合后,诱导作用减弱.转录因子分析表明,由于ERK通路被激活,壬基酚和E2混合物可极大地强化转录因子c-Myc蛋白和cyclinD1蛋白的表达.     

五指毛桃拮抗环磷酰胺诱发的遗传损伤效应

目的探讨五指毛桃对环磷酰胺所致小鼠遗传物质损伤的拮抗效应.方法 30只SPF级昆明种雄性小鼠,随机分为阴性对照组、阳性对照组及五指毛桃高（20g/kg）、中（10g/kg）、低（5g/kg）3个抗突变组.抗突变组用五指毛桃水提液灌胃,阴性对照组、阳性对照组灌以等量生理盐水,1次/d,连续15d.于第14 d,除阴性对照组外,各组小鼠腹腔注射环磷酰胺40mg/kg,24h后重复注射一次.用微核试验,检测五指毛桃水提液对环磷酰胺诱发小鼠骨髓嗜多染红细胞和睾丸生精细胞微核发生率的影响.结果抗突变组的骨髓嗜多染红细胞和睾丸生精细胞微核率均明显降低,与阳性对照组比较有统计学意义（P〈0.01）,并且随着五指毛桃液浓度的增高,微核率逐渐降低.结论五指毛桃可以拮抗环磷酰胺诱发的小鼠遗传物质损伤,提示五指毛桃有一定的抗突变作用.     

RT-PCR法检测大鼠组织中GLUT8基因表达特异性

采用半定量RT_PCR技术检测青春前期和成年大鼠的主要组织中GLUT8基因mRNA表达水平.实验结果显示,葡萄糖转运蛋白GLUT8基因在成年和青春前期大鼠的睾丸组织中都有高度表达,在心脏和肾脏组织中有少量表达,在肝、脾等组织中的表达是微量的;在成年大鼠睾丸组织中,Leydig细胞、睾丸生精细胞以及附睾的精子细胞中GLUT8基因都有大量的表达,其中以在Leydig细胞中的表达最丰富,而且GLUT8基因在睾丸生精细胞中的表达水平高于附睾的精子细胞.结果说明GLUT8蛋白主要分布在大鼠睾丸组织中,并且主要在Leydig细胞和精子细胞中参与葡萄糖转运和能量代谢与供应.     

生姜醇提取物诱导TM4细胞凋亡的研究

生姜醇提取物的应用已引起了广泛的关注,特别是在医药方面得到了人们的高度重视。本研究主要探讨生姜醇提取物对支持细胞系TM4体外生长的影响。通过采用形态学观察、MTT法和TUN-NEL法检测5个不同浓度的生姜醇提取物对小鼠支持细胞株TM4细胞生长和增殖的作用。结果表明,生姜醇提取物抑制TM4细胞的增殖并诱导其细胞凋亡,这种作用呈剂量依赖效应,当用40μM/mL的生姜醇提取物处理培养的TM4细胞时,MTT法测得的细胞生长抑制率和TENNEL法获得的细胞凋亡指数与对照组相比均有显著差异。这些结果说明,生姜醇提取物在预防和治疗睾丸癌方面有应用价值。     

槐属二氢黄酮G促进L6细胞内GLUT4的表达和转运

利用细胞葡萄糖摄取检测试剂盒检测苦参中槐属二氢黄酮G(Sophoraflavanone G,SFG) 对L6细胞葡萄糖摄取的影响,发现SFG能够增加大鼠成肌细胞 (L6) 的葡萄糖摄取;之后,使用Western blot检测发现SFG对L6细胞内GLUT4的表达有显著的促进作用;同时,在可稳定表达IRAP-mOrange荧光蛋白的L6细胞内,使用激光共聚焦显微镜监测SFG作用下葡萄糖转位蛋白4 (glucose transporter 4,GLUT4) 的转位,发现SFG对GLUT4的转位有显著的促进作用,而且SFG对GLUT4转位的促进呈浓度依赖性;另外,免疫荧光实验结果也显示SFG增强L6细胞中GLUT4与细胞膜的融合.这些结果显示利用SFG处理L6细胞后,L6细胞内GLUT4的表达、转运及与细胞膜的融合继而促进葡萄糖的摄取显著增强,说明SFG可能具备开发成一种新的降血糖药物的潜力.