猪卵母细胞体外成熟及电激活后发育能力的研究

探讨了不同的成熟培养液及外源激素对猪卵母细胞体外成熟培养及电激活后孤雌胚胎发育能力的影响. 结果表明：（1）改良M199（mM199）组猪卵母细胞成熟率显著高于M199组，且这两组又较NCSU-23组能极显著提高卵母细胞的成熟率. （2）孕马血清（PMSG）+人绒毛膜促性腺激素（hCG）+促卵泡素（FSH）组卵母细胞成熟率略高于FSH+促黄体素（LH）组，两者卵母细胞成熟率极显著高于尿促性腺激素（hMG）组. （3）含胎牛血清（FBS），猪卵泡液（PFF），表皮生长因子（EGF）的培养液较对照组在卵母细胞成熟率上无显著差异，但均能显著提高电激活后的卵裂率.添加EGF组桑囊率明显高于不添加组.但分别添加FBS和PFF组较对照组在桑囊率上均无显著差异. （4）卵丘细胞扩散与卵母细胞第一极体排出之间无直接相关性，但扩散程度好能提高电激活后的卵裂率.     

卵细胞体外成熟(IVM)在小鼠生物净化中的应用

目的 在小鼠生物净化中,从超排后未排卵的卵巢,取卵泡内未成熟卵采用卵母细胞体外成熟(in vitro maturation,IVM)使之在体外成熟并具备受精能力,以提高卵子利用率和作为常规促超排失败的一种补救措施。方法 在小鼠生物净化中,取注射PMSG和HCG后未排卵卵巢,在实体显微镜下划破卵泡挑选卵丘卵母细胞复合物(COCs),置于成熟液滴中在体外发育成熟。同时以注射PMSG和HCG后正常超排卵、只注射PMSG后取未成熟卵体外成熟和注射PMSG和HCG后取疑似成熟卵和裸卵体外成熟作为对照。经体外受精、体外胚胎发育后,将2-细胞胚移植到受体输卵管,使其在受体内发育成为成熟的个体。结果 注射PMSG和HCG后未排卵组(A组),卵细胞体外成熟率为87.0%±3.2%,二胞率为55.1%±12.3%,囊胚率为23.1%,移植41枚二细胞胚至2只受体鼠,出生5只幼崽,产仔率12.2%。只注射PMSG,48 h后取未成熟卵组(B组),体外成熟率为83.9%±3.9%,二胞率为51.8%±9.3%,囊胚率为38.5%±13.9%。注射PMSG和HCG正常超排组(C组),其二胞率为78.9%±0.6%,囊胚率为78.0%±3.8%。注射PMSG和HCG未排卵卵巢,取裸卵和疑似成熟卵(D组),体外成熟培养0 h,6 h和16～18 h,其成熟率、二胞率和囊胚率与其它三组相比均较低且有极显著性差异。A组和B组与正常对照C组相比,二胞率均有显著性差异,囊胚率均有极显著性差异。结论 卵母细胞体外成熟(IVM)可以作为小鼠生物净化中促超排失败的一种补救措施,并且可以提高珍稀品系小鼠的卵子利用率。     

体外培养时间和表皮生长因子对牦牛卵母细胞成熟及孤雌胚胎体外发育的影响

研究在成熟液中添加表皮生长因子（Epidermal growth factor,EGF）以及成熟时间对牦牛卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响,以确立牦牛卵母细胞体外成熟的最佳体系.结果表明,成熟液中添加EGF组的成熟率明显高于未添加组（P＜0.05）,并且牦牛卵母细胞的成熟率随着EGF添加的浓度增加也不断上升;随着体外培养时间的延长,成熟率逐渐增加,培养24 h后成熟率趋于稳定;胚胎体外培养液中添加EGF能显著提高孤雌胚胎的8-细胞和囊胚形成率（P＜0.05）.由此推测：在体外培养22-24 h,且添加40 μg/mL EGF最有利于牦牛卵母细胞体外成熟;胚胎培养液中添加40μg/mLEGF能显著提高牦牛孤雌胚胎的体外发育能力.     

小鼠腔前卵泡无血清体外培养的研究

目的:探索添加物维生素C和促性腺激素对小鼠腔前卵泡卵母细胞体外生长发育的影响及适合小鼠腔前卵泡体外生长发育的培养体系.方法:通过改良的TCM199无血清培养系统,在96孔细胞培养板中,每孔放入1个腔前卵泡等条件下体外培养腔前卵泡卵母细胞.结果:随着培养时间的延长,各组卵泡和卵母细胞的直径都不同程度的有所增长,其中FSH400+LH200组和VC50+FSH400+LH200影响均大于VC50和对照组,存在显著性差异(P0.05),但二者之间无显著性差异.FSH400+LH200质量浓度组卵泡存活率、发生GVBD率和第一极体排出率均最高,分别为68.6%、17.6%、9.8%.但VC50+FSH400+LH 200组卵泡成腔率最高,为48%.结论:在改良的TCM199无血清培养系统中,联合添加促性腺激素和抗氧化剂后,卵泡成腔率大有提高,卵泡存活率、发生GVBD率和第一极体排出率仅次于单独添加促性腺激素组.     

体外培养高产奶牛胚胎的研究

研究体外培养法培养效果及对体外受精胚胎发育的影响。体外受精胚胎分别在加输卵管上皮细胞单层和颗粒细胞单层（2×106个／ml）的体外培养体系的培养液中培养。结果发现,冷冻胚胎解冻后停留时间对胚胎培养效果影响极显著（P〈0．01）;冷冻胚胎解冻后胚胎等级对胚胎培养效果影响显著（P〈0．05）,解冻后A级胚胎存活率79％、囊胚孵化率56％,显著高于B级胚胎存活率60％和囊胚孵化率39％（P〈0．05）。体外培养体系囊胚形成主要集中在第8d,加体细胞的体外培养体系显著好于不加体细胞的简单体外培养法。     

促减数分裂甾醇（MAS）对猪卵母细胞体外成熟及其胚胎发育能力的影响

利用促减数分裂甾醇(MAS)合成代谢过程中的抑制剂AY9944累积FF-MAS的原理,在猪卵母细胞体外成熟过程中添加AY9944,间接地研究了内源性MAS对猪卵母细胞体外成熟质量的影响.猪卵丘卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes,COCs)培养在NCSU23成熟培养液中,并添加不同浓度(0,10,20,40μmol/L)的AY9944培养44h.培养结束后,成熟的卵母细胞进行孤雌激活和以胎儿成纤维细胞为核供体重构胚胎,分别于48和144h观察胚胎发育情况,统计卵裂率和囊胚率及囊胚/2-细胞胚比率.结果如下:(1)随着AY9944添加浓度的增加,退化的卵母细胞增多,40μmol/L AY9944处理的退化卵显著,卵母细胞成熟率显著下降.(2)成熟培养液添加20和40μmol/L AY9944处理的孤雌激活胚胎的囊胚形成率和2-细胞胚发育到囊胚的比率显著增加(P<0.05).(3)以对照组(0μmol/L AY9944)和20μmol/L AY9944处理的卵母细胞为胞质受体,发现20μmol/L AY9944处理的克隆胚的发育能力囊胚率和2-细胞胚发育到囊胚的比率有所提高,但无显著差异(P>0.05).以上结果表明,猪卵母细胞体外成熟过程中添加AY9944提高了猪卵母细胞体外成熟的胞质质量,胚胎的发育能力提高.     

灭活与未灭活发情母牛血清对牛体外受精卵发育的影响

通过在成熟培养液和发育培养液内添加灭活或未灭活发情母牛血清（ＯＣＳ）探讨了血清灭活与否对牛体外受精（ＢＩＶＦ）卵发育的影响，在卵母细胞成熟培养实验中，两个组分别添加１０％灭活、未灭活发情零日母牛血清（Ｄ＿０ＯＣＳ），另一组为不加血清的对照组。三个处理组的卵裂率分别为７４．８％、７６．５％和５０．２％（Ｐ＜０．０１）。囊胚发育率分别为２５．９％、１８．３％和４．８％（Ｐ＜０．０５）。前两个处理组间无显著差异，但二者的各项发育指标均显著高于对照组。在发育培养液内分别添加５％灭活或未灭活发情第五日母牛血清（Ｄ＿５ＯＣＳ）。两个处理组的卵裂率分别为７６．７％和７２．０％，囊胚发育率分别为２４．５％和２０．１％，二者间无显著差异，结果表明：牛卵母细胞的成熟过程中，血清的添加是必须的。未灭活ＯＣＳ同样可以促进ＢＩＶＦ卵的体外发育，但其效果仍不如灭活的ＯＣＳ．     

体外培养绵羊卵母细胞核质成熟的研究

实验通过研究卵母细胞的核相及皮层颗粒的分布,探讨按照卵泡大小和卵丘细胞层多少分类后的不同绵羊卵母细胞在体外培养过程中的核质成熟情况,结果表明：（１）小卵泡卵经体外２４ｈ后的核质成熟率分别为４５．９％和２８．２％,远低于大（９３．５％,６６．７％）、中（８５．１％,５１．０％）两类卵泡卵,２）大卵泡卵在体外培养２０ｈ已完成核质成熟,较中等卵泡提前４ｈ。３）ｇｋｐｈｅ ３ｎｆｃ ｃ ｈ ｇｃｆｔ ｐｎ     

胚胎的培养液平均拥有量和单独或群体培养对牛体外受精胚胎发育的影响

采用化学成分明确的培养系统,研究了胚胎的培养液平均拥有量以及单独或群体培养对牛IVF卵体外发育的影响.将牛体外受精(IVF)卵分别以每100、50和20μl培养液小滴内10枚卵子的形式进行发育培养,三个处理组的囊胚发育率分别为:6.0%、9.4%和14.3%,三者间无显著差异.在此基础上,选择培养效果较好的每枚胚胎2μl的培养液量,分别在20、10、4、2μl小滴内培养10、5、2、1枚胚胎,四个组的囊胚发育率分别为:10.0%、16.4%、10.0%、4.0%,5枚胚胎/10μl小滴处理组的囊胚率显著高于1枚胚胎/2μl处理组(p<0.05).研究结果表明:不同培养液拥有量以及单独或群体培养都可支持部分胚胎发育至囊胚阶段,降低培养液体积和群体培养更有助于牛IVF卵的体外发育.     

牛卵母细胞不同时间的成熟培养可提高核移植效率

：比较了成熟培养不同时间的卵母细胞的成熟率、去核率及用于核移植的效率,认为成熟培养21 h的卵母细胞虽然有较高的成熟率,但不适于采用盲去法去核.成熟培养19 h的卵母细胞核移植效率略高于成熟培养17 h.因此认为采用盲去法去核操作大批卵母细胞时,19 h的体外成熟培养时间是比较适宜的.     

小鼠腔前卵泡卵母细胞的体外培养、体外成熟和体外受精研究

小鼠腔前卵泡在体外生长过程中，于培养液中添加血清，以及ＦＳＨ和胰岛素均对小鼠腔前卵泡的体外生长、体外成熟、体外受精起促进作用，其中以胰岛素的效果最为显著，腔前卵泡的体外成熟率和体外受精率可达６９．４％和８０．６％，但是体外受精后的体外发育率低于添加ＦＳＨ的试验组，表明ＦＳＨ有益于卵母细胞生长过程中细胞质的成熟。单层培养的卵巢颗粒细胞对腔前卵泡的体外生长也具有促进作用。将体外受精后发育至２—细胞的胚胎移植入受体鼠，胚胎可以正常着床发育。同时，卵母细胞的核仁和线粒体在培养过程中也发生相应的变化。     

猪卵母细胞第一极体排出与否对其早期胚胎发育的影响

探讨猪卵母细胞第一极体排出与否对其体外受精和孤雌激活后早期发育的影响．从屠宰场收集猪卵巢卵母细胞,体外成熟培养42-46h后分为3组：排出第一极体组、没有排出第一极体组和对照组（不挑选第一极体卵母细胞）,进行体外受精或化学孤雌激活之后放入胚胎培养液进行体外培养,分别于第48h和第168h统计分裂率和囊胚率．①体外受精后,有极体组的卵裂率略高于无极体组和对照组的卵裂率（62．19％&#177;6．99％vs55．40％&#177;6．80％和56．33％&#177;8．17％）,各组间没有显著差异（P〉0．05）;囊胚率分别为4．87％&#177;3．77％,2．33％&#177;1．34％和3．50％&#177;2．96％,有极体组明显高于无极体组（p〈0．05）,对照组与其它两组没有显著差异（p〉0．05）．②化学激活后,有极体组的卵裂率高于无极体组和对照组（75．45％&#177;1．35％vs64．81％&#177;2．07％和69．64％&#177;2．51％,p〈0．05）;有极体组的囊胚率也高于无极体组和对照组（24．54％&#177;4．34％vs12．96％&#177;3．99％和18．75％&#177;1．87％,p〈0．05）．排出第一极体卵母细胞比没有排出第一极体卵母细胞的发育能力强,但没有排出第一极体卵母细胞经体外受精或人工激活后也可以发育到囊胚阶段．     

小鼠腔前卵泡卵母细胞的体外培养、体外成熟和体外受精研究

小鼠腔前卵泡在体外生长过程中，于培养液中添加血清，以及ＦＳＨ和胰岛素均对小鼠腔前卵泡的体外生长，体外成熟，体外受精起促进作用，其中以胰岛素的效果最为显著，腔前卵泡的体外成熟率和体外受精率可达６９．４％和８０．６％，但是体外受精后的体外发育率低于加ＦＳＨ的试验组，表明ＦＳＨ有益于卵母细胞生长过程中细胞质的成熟，单层培养的卵巢颗粒细胞对腔前卵泡的体外生长也具有促进作用，将体外受精后发育至２－细胞的胚胎     

卵母细胞的不同对牛体外受精效果的影响

为了进一步提高牛体外受精（ＢＩＶＦ）胚的发育率，探讨了来自不同大小卵泡、具有不同卵丘细胞层数以及细胞质形态不同的卵母细胞对牛体外受精效果的影响。结果表明：１）分别采自直径大于５ｍｍ、２￣５ｍｍ和小于２ｍｍ的卵泡的卵母细胞，经体外成熟、体外受精后，卵裂率分别为５４．５％（３０／５５）、６４．４％（８５／１３２）和５０．４％（６３／１２５）。其中，２￣５ｍｍ卵泡的卵母细胞的体外受精结果显高于小于２ｍ     

牛胚胎体外生产技术的应用研究

利用屠宰牛卵巢抽出的卵母细胞，以卵裂率和囊胚发育为标准，对牛胚胎体外生产过程进行了简化试验，结果显示：不加卵丘细胞的高密度卵母细胞体外成熟（１００－２００枚／平皿）可代替加卵丘细胞标准密度培养，其卵裂率和囊胚发育率没有显著变化，体外授精时间可从成熟培养后２２小时延长至２７小时，卵裂率和囊胚发育率均没有显著变化。卵母细胞体外成熟后可以不经洗涤直接移入受精滴，原成熟培养皿内残留孵丘细胞再培养４８小时形     

羔山羊的超数排卵及体外受精

以ＦＳＨ或ＦＳＨ－ＬＨ四种不同处理方法对２９只６８～１１０日龄羔山羊进行超排处理，结果共采集卵泡卵母细胞７０８枚，平均每只羔羊采卵２４．４枚．卵母细胞经体外培养２４ｈ后有８１．２％的卵发育为成熟卵．分别用经钙离子载体Ａ＿（２３１７８）或肝素进行获能处理的精子对体外培养成熟的卵子进行体外受精，结果精子穿入卵率分别为５４．８％和３４．４％，发育至２～４细胞胚的卵裂率分别为２８．６％和４１．９％．采用ＦＳＨ－ＬＨ（肌注）进行超排处理得到的卵子经体外受精处理后，其卵裂率明显高于采用其它超排方法得到卵子的卵裂率．     

促性腺激素对小鼠腔前卵泡及其卵母细胞体外发育的影响研究

通过使用改良的TCM199无血清培养系统,在96孔细胞培养板中,每孔放入一个腔前卵泡等条件下,探索促性腺激素(FSH、LH)对小鼠腔前卵泡卵母细胞体外生长发育的影响,旨在摸索一套适合小鼠腔前卵泡体外生长发育的培养体系.结果表明:随着浓度的增加,卵泡和卵母细胞的直径都不同程度的有所增长,在卵泡培养的同期相比,卵泡增长值最大组为FSH400+LH200组,而卵母细胞增长值最大组却是FSH400组.从添加物上看,各个实验组与对照组之间,卵泡直径和卵母细胞直径增长值都存在显著性差异(P0.05).随着培养时间的延长,FSH400+LH200组卵泡存活率、成腔率表现为最高,分别为68.6%,47%.从卵泡发生生发泡破裂率和第一极体排出率来看,FSH400+LH200组发生生发泡破裂率高于其他组,为17.6%,但第一极体排出率却低于FSH400组.因此,改良的TCM199无血清基础培养液中联合添加400mIU/mL FSH和200mIU/ML LH效果优于单独添加组的效果.     

广州地区普通级SD大鼠膀胱线虫的感染和观察

对20只普通级SD成年大鼠进行检测,在13只大鼠的膀胱中发现膀胱线虫,肾盂中未发现膀胱线虫。每只鼠中有3～14条,均为雌虫、虫长为10．31±0．36mm,宽为15．50±6。48μm;虫卵呈椭圆形。两端有给节,大小为（63．67±0．95）×（36.67±1．39）μm。将收集到的线虫放入生理盐水中产卵,并将产出的80个卵放入（生理盐水＋青霉素）培养液中进行体外培养。48h后存活60个;72h后存活40个;96h后只剩4个卵存活;120h后全部死亡。这表明虫卵即使在很简单的体外培养的条件下依然能存活较长的时间。     

猪卵母细胞体外成熟的研究

从屠宰场收集卵巢，用注射器从卵泡中吸出卵丘－卵母细胞复合体，对猪卵母细胞体外成熟的条件进行研究，根据卵母细胞体外成熟时的核成熟率、胞质成熟及体外受精时精子的穿卵速度，合适的体外成熟培养时间为４２～４５ｈ．卵母细胞周围卵丘细胞的多少及其排列紧密状态与卵母细胞的体外成熟率密切相关。卵泡大小与卵母细胞的体外成熟率有关，大卵泡卵优于小卵泡卵。ＰＭＳＧ促进猪卵母细胞体外成熟。     

牦牛,黄牛体外受精比较和分割胚的移植

采用常规方法对黄牛和牦牛卵母细胞的体外受精技术进行初步探索.实验采用相同的成熟液、受精液和培养液,并且两种卵母细胞成熟后均以黑白花冷冻精液进行受精.成熟培养时间为22～26.h.受精后48h移入颗粒单层培养滴中,第6、7、8天记录囊胚发育情况.结果表明：来自屠宰场的不同品种的卵巢在提供卵母细胞的数量上无显著差异（P＞0.05）.50个黄牛卵巢获得344枚可用卵母细胞、回收率为6.9枚／卵巢;30个牦牛卵巢获得206枚可用卵母细胞,回收率为69：16个黄牛加28个牦牛卵巢获得373枚可用卵母细胞,回收率为7.5受精后黄牛、牦牛的卵裂率（69.2％比44.1％）差异极显著（P＜0．01）而囊胚发育率（31.8％比25.0％）差异显著（P＜0.05）牦牛与黄牛卵母细胞共同培养时其卵裂率和发育率比较接近黄牛卵母细胞的发育水平（分别为61、2％和30.5％）挑选部分黄牛杂交胚胎进行分割实验,将其中的四对半胚非手术移入4头发情同步的受体牛．两个月直肠检查有3头妊娠（75％）,其中有两头受体足用分娩,其－产奶黄杂公犊－头,另－受体产一对奶黄杂双胎、－活－死（畸胎）实验表明：常规的体外受精技术用于牦牛是可行的,但其中仍有－些值得改进的地方,另外完全体外化的胚胎分割技术为提高优质良种胚胎的生产效率提供了便捷