地毯草ISSR反应体系的建立与优化

在利用ISSR技术对地毯Axonopus compessus(Sw.)Beauv.种质资源的遗传多样性进行研究的实验过程中,对影响PCR扩增效果的一些因素诸如DNA的提取、模板DNA质量浓度、Taq酶的选择及其用量、Mg2 浓度、dNTP的用量以及退火温度等指标进行筛选和优化,筛选优化出可用于地毯草ISSR-PCR分析最适宜的PCR反应条件:10μL PCR反应体积中,10×Taq酶配套缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,ph9.0,50mmol/L KCl,0.1%Triton X-100),0.75 U Taq DNA聚合酶(上海申能博彩),0.375 μmol/L引物,180μmol/L dNTP,1.5～2.0 mmol/LMgCl2,10ng模板DNA.     

海桐ISSR-PCR反应体系的建立与优化

利用ISSR技术对海桐的遗传多样性进行研究,对影响PCR扩增效果的一些因素诸如退火温度、Mg2 浓度、4×dNTP浓度、牛血清白蛋白浓度、模板DNA用量、引物用量以及Taq DNA聚合酶用量等指标进行优化,建立了可用于海桐ISSR分析最适宜的反应体系:10μL PCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10mmol/L Tris.HCl,pH值9.0,50 mmol/L KCl,0.1%Triton X-100),2.5 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L 4×dNTP,2.0 mg/mL牛血清白蛋白,10 ng模板DNA,6 pmol引物,0.3 U Taq DNA聚合酶.引物UBC807的最适退火温度为50.7℃.     

五条蚋ISSR-PCR反应体系的建立与优化

通过正交试验及单因素试验对五条蝻S.quinquestriatum ISSR-PCR反应体系中的引物、DNA模板、dNTP、Mg2+、BSA、Taq DNA聚合酶浓度6个关键因素进行优化,建立五条蚋ISSR最适反应体系:20μl反应体系中引物1.0 μmol/L、DNA模板50.0 ng/μl、dNTP 0.15 mmol/L、Mg2+ 1.50 mmol/L、BSA 2.00 mg/ml、Taq DNA聚合酶0.155U/μl.通过对24条备选引物进行温度梯度筛选,获得8条能够稳定扩增且多态性较好的引物.为今后利用ISSR技术进行五条蚋种群遗传多样性研究奠定了良好的技术基础.     

佛手RAPD扩增系统的建立

试验了模板DNA、引物、镁离子和Taq酶的浓度对佛手RAPD分析结果的影响,从而建立了适合佛手RAPD扩增的系统.具体条件为:25μL反应体系中模板DNA 100 ng(4 ng/μL),MgCl2 3.0～5.0 mmol/L,dNTP 200μmol/L,10-mer Primet 0.2 μmol/L及1 U Taq Polyrnerase.扩增程序为:93℃120 s;之后,93℃60 s,35℃60 s,72℃120 s,进行42个扩增循环;最后72℃延伸600s.     

赤松ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立赤松ISSR-PCR反应体系,利用正交试验分别对影响赤松PCR反应的dNTP浓度、Mg~(2+)浓度、Taq酶浓度、引物浓度、模板浓度进行了优化,并通过梯度PCR确定引物的最佳退火温度和循环次数.最终确定赤松ISSR-PCR最佳反应体系及扩增条件为:25μL反应体系中含2.5μL 10×PCR Buffer、3 mmol·L~(-1)dNTP、1.5 mmol·L~(-1)Mg~(2+)、0.5 U Taq酶、0.3μmol·L~(-1)引物、9 ng模板;扩增程序为:94℃预变性5 min,然后进行94℃变性30 s,55℃退火45 s(退火温度随引物不同而变化),72℃延伸2 min,35个循环,最后72℃延伸7 min.这一ISSR-PCR反应体系,为今后利用ISSR技术对赤松进行物种分类鉴定奠定了基础.     

贵州山核桃ISSR-PCR反应体系建立及优化

为建立贵州山核桃ISSR-PCR最佳反应体系,采用单因素试验的方法,对影响ISSR-PCR反应体系的模板DNA浓度、MgCl2浓度、d NTPs浓度、Taq酶用量、引物浓度等各因素进行了研究,确立了贵州山核桃ISSR-PCR的最佳反应体系。结果显示:最优反应体系的模板DNA浓度为40ng/u L、引物浓度为0.3umol/L、Mg2+的浓度2.9mmol/L、酶浓度0.3U、d NTPs浓度0.2mmol/L,退火温度为54℃。建立该反应体系可为贵州山核桃ISSR标记开发、物种分类鉴定、遗传图谱构建等后续分析奠定基础。     

均匀设计优化黑木相思ISSR-PCR体系

采用均匀设计,对影响黑木相思ISSR-PCR体系的引物、Mg2 、dNTP、Taq DNA聚合酶和模板DNA浓度等进行5因素5水平和5因素3水平两轮优化,建立了适合于黑木相思ISSR-PCR的体系:在20μL反应体系中,含引物0.30μmol.L-1,Mg2 3.00 mmol.L-1,dNTP 0.15 mmol.L-1,Taq DNA聚合酶0.75U,模板DNA 2.00 ng.μL-1.在此基础上对扩增程序中的循环次数、退火温度、退火时间进行筛选,获得的扩增程序为:94℃预变性5 min;接着进行33个循环:94℃变性35 s,52~61.5℃退火52 s,72℃延伸90 s;循环结束后,72℃延伸10 min.同时筛选得到10个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.     

两种荒漠小灌木RAPD反应条件优化与引物筛选

分析了模板DNA、引物、Taq酶、dNTP、Mg2+浓度对红砂和长叶红砂RAPD扩增的影响,筛选并建立了适合红砂和长叶红砂的RAPD扩增反应体系:反应体积25μL,内含20 ng模板DNA,0.16μmol/L引物,0.5 U Taq DNA聚合酶,2.5 mmol/L MgCl2,0.1 mmol/L dNTP,2μL10×buffer.用60个引物进行扩增,筛选出扩增效果好的18个引物,为进一步研究红砂和长叶红砂的遗传多样性奠定了基础.     

泽泻ISSR反应体系的建立与优化

以四川泽泻为实验试材,采用改进的CTAB法提取了泽泻的高质量总DNA模板,克服了泽泻中所富含的酚类物质的影响.对泽泻ISSR反应体系中各个主要影响因子进行了优化和筛选,建立了标记位点清晰、稳定、重复性好、可用于泽泻ISSR-PCR分析的最适反应体系,它们是:25μL PCR反应体系中,10×Taq酶配套缓冲液,1U Taq DNA聚合酶,1.8~2.0 mmol/L MgC l2,100μmol/L dNTP,0.3μmol/L引物,DNA模板约10~20 ng,退火温度在52~60℃;为进一步研究泽泻居群的ISSR分子标记鉴别奠定了基础.     

藜ISSR-PCR反应体系的优化

采用TaKaRa的PCR反应系统,以从藜(Chenopodium album L)幼叶中提取纯化后的总DNA为模板,进行UBC 859号引物的ISSR-PCR扩增实验,分别测试了镁离子、模板DNA和Taq DNA聚合酶含量对反应结果的影响,通过各因子的浓度梯度组合实验,确定了在25 mL体积的PCR反应中:酶配套缓冲液2.5μL,dNTPs0.2μmmol/L,引物0.2 mmol/L,Mg2+1.5 mmol/L,模板含量为40 ng,Taq DNA聚合酶为1.5 U是藜最佳的ISSR-PCR反应体系。