新月弯孢霉CICC40301催化4–烯–3–酮甾体化合物羟基化反应产物的鉴定

丝状真菌是工业上甾体微生物羟基化反应菌种的主要来源.本文首次报道新月弯孢霉(Curvularia lunata)转化孕酮、雄甾–4–烯–3,17–二酮和睾酮及其对应产物.利用高效液相色谱(HPLC)和核磁共振方法分析了相应的主要转化产物,鉴定结果为:C17α–羟基孕酮、C14α–羟基4AD、C15–羟基睾酮,其中新月弯孢霉CICC40301转化孕酮生成的产物C17α–羟基孕酮是用于合成氢化可的松等多种甾体药物的重要中间体,C14α–羟基4AD是合成抗肿瘤化合物C14α–羟基–3,6,17三酮的关键前体.     

转化左旋乙基甾烯双酮的微生物筛选及转化产物研究

为了满足甾体药物日益增长的市场需求,从南方采集的新鲜树皮中筛选出具有转化新型甾体化合物左旋乙基甾烯双酮活力的微生物米根霉.利用该菌对左旋乙基甾烯双酮进行生物催化,转化产物经纯化、重结晶后,通过单晶衍射鉴定为6,β–羟基–13,β–乙基–4–烯–3,17–二酮和10,β–羟基–13,β–乙基–4–烯–3,17–二酮.通过高效液相色谱对转化过程中的甾体化合物进行分析,发现转化24,h后,底物左旋乙基甾烯双酮、6,β–羟基化产物和10,β–羟基化产物的含量分别为28.4%、32.2%和35.7%.     

分支杆菌降解大豆甾醇侧链的发酵研究

对分支杆菌(MycobacteriumspJY 1)降解大豆甾醇(BS)侧链至4 烯 雄甾 3,17 二酮(4 AD)和1,4 二烯 雄甾 3,17 二酮(ADD)的培养基组成、种子培养时间、通气量、投料方式及时间等发酵条件进行了研究。在投料浓度为0.3%,转化时间为168h的条件下,使4 AD(D)的转化率由原来的37%提高到50%左右。     

雷斯青霉NADPH-细胞色素P450还原酶基因的克隆及生物信息学分析

工业上利用丝状真菌雷斯青霉(Penicillium raistrickii)转化生产高效避孕药孕二烯酮的关键中间体15α–羟基左旋乙基甾烯双酮.已知参与雷斯青霉甾体转化反应的关键酶为P450羟化酶,该羟化酶体系由细胞色素P450羟化酶和NADPH–细胞色素P450还原酶(CPR)组成,但有关其15α–羟基化反应的分子基础尚不清楚.根据转录组测序数据库,通过RT-PCR扩增克隆了一个雷斯青霉NADPH-细胞色素P450还原酶基因.该基因的开放阅读框为2,082,bp,编码694个氨基酸的多肽链,预测的蛋白相对分子质量为7.63×104,具有CPR蛋白的典型结构域(FMN结合域、FAD和NADPH结合域).NCBI BLAST结果显示雷斯青霉CPR与意大利青霉(P.,italicum)NADPH–细胞色素P450还原酶具有较高的同源性,一致性为93%.     

黑曲霉ATCC1015催化16α,17α–环氧黄体酮11α–羟基化及相关P450基因诱导表达

为了定向遗传改造黑曲霉菌种,研究了黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC1015转化甾体16α,17α–环氧黄体酮活性.转化产物经过薄层层析(TLC)、高效液相色谱(HPLC)以及氢谱、碳谱分析最终确定为11α–羟基–16α,17α–环氧黄体酮.确定了黑曲霉ATCC1015 11α–羟基化活性受底物16α,17α–环氧黄体酮的诱导.鉴于真菌的甾体羟化酶属于细胞色素P450酶,从黑曲霉ATCC1015的P450(CYP)基因数据库中筛选出57个具有编码甾体羟化酶潜力的CYP基因;利用实时荧光定量PCR确定了2个受甾体底物高度诱导的候选目标甾体羟化酶基因An A100和An A154.分别构建了An A100基因和An A154基因的重组酿酒酵母菌株p YES2-An A100和p YES2-An A154,甾体转化结果显示重组酵母菌p YES2-An100能够转化16α,17α–环氧黄体酮生成11α–羟基–16α,17α–环氧黄体酮.     

增加雷斯青霉15α–羟化酶基因拷贝数提高甾体转化效率

孕二烯酮是第三代高效避孕药的主要成分.雷斯青霉(Penicilliumraistrickii)ATCC10490催化甾体左旋乙基甾烯双酮的C15α–羟基化反应合成孕二烯酮的重要中间体C15α–羟基左旋乙基甾烯双酮.为了提高现有生产菌种的转化效率,本文研究了在雷斯青霉ATCC10490中增加甾体C15α–羟化酶基因(PRH)拷贝数对转化效率的影响.分别构建了PRH基因的诱导型和组成型过表达载体pPZP-p800-PRH和pPZP-TrpC-PRH,并通过同源重组的方法定点整合到雷斯青霉基因组.转化实验表明,在出发菌株中增加一个PRH基因拷贝显著提高了甾体左旋乙基甾烯双酮转化效率,重组菌PRH-P800和PRH-TrpC的摩尔转化率分别提高了13%和20%,同时转化时间均缩短了12 h.     

赭曲霉甾体11α–羟化酶基因AOH在毕赤酵母中的表达及功能分析

11α–羟基左旋乙基甾烯双酮(11α-OH-GD)是生产高效避孕药去氧孕烯的关键中间体.丝状真菌赭曲霉(Aspergillus ochraceus)TCCC41060可以转化左旋乙基甾烯双酮(GD)形成11α-OH-GD,但该转化反应特异性低,副产物偏高,限制了其工业应用.为了研究赭曲霉转化GD特异性偏低的机理,本文克隆了赭曲霉11α–羟化酶基因AOH并构建了表达载体p PIC3.5,K-AOH,获得了重组毕赤酵母菌株.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹实验(Western blot)分析表明,AOH重组蛋白相对分子质量为6.12×104,与预测结果一致.对转化产物进行薄层色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)分析结果显示,AOH重组菌株能够转化GD,形成目标产物11α-OH-GD以及3种副产物.以上结果表明:AOH基因编码的甾体11α–羟化酶对底物GD转化反应的特异性较差.     

分枝杆菌Mycobacterium sp.M1甾酮C1,2位脱氢酶活性的研究

分枝杆菌Mycobacterium sp．M1可以有效降解大豆甾醇侧链得到雄甾-4-烯-3，17-二酮（AD）和雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮（ADD）。通过该菌株细胞和细胞裂解液对底物AD的转化，表明了该菌株中存在甾酮C1．2位脱氢酶。利用酶活测定中活力高的细胞裂解液可以有效地降解大豆甾醇生成ADD。     

气相色谱法测定植物甾醇发酵液中雄甾烯酮和植物甾醇的含量

采用气相色谱仪建立了一个同时测定植物甾醇发酵液中雄甾-4-烯-3,17-二酮(Androst-4-ene-3,17-dione-4-AD)、雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(Androst-1,4-diene-3,17-dione,ADD)和植物甾醇含量的外标分析方法.发酵液经离心后,二氯甲烷提取,可直接进样分析.气相色谱务件为:FID检测器,SE-54型(15m×0.25mmx0.25um)毛细管柱;柱温260℃,进样口和检测器温度均为300℃;载气为高纯N2,流速1mL/min.在实验条件下,发酵液中各主要成分和杂质分离良好.结果表明:4.AD、ADD和植物甾醇各组分的浓度与Ai/As的线性范围4-AD为0.5-4 g/L(R=O.999 9);ADD为0.5-4g,L(R=0.9992);菜籽甾醇为0.09～0.86 g/L(R=0.9991);菜油甾醇为0.14～1.39 g/L(R=0.999 5);豆甾醇为0.03～0.27 g/L(R=1);谷甾醇为0.24～2.4 g/L(R:0.999 1),平均回收率4-AD、ADD和上述植物甾醇依次为(96.37±0.77)%,(95.64±1.01)%,(99.6±2.78)%,(98.66±2.19)%,(96.85±2.19)5,(97.52±2.9)%.该方法具有步骤简单、重现性好、准确度和灵敏度高的特点.     

利用谷氨酸棒杆菌转化法合成4–羟基异亮氨酸

4–羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine,4-HIL)具有葡萄糖依赖的促进胰岛素分泌的活性,在L–异亮氨酸(Lisoleucine,L-Ile)生产菌株谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)YILW中过表达来源于苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)TCCC11826的L–异亮氨酸羟化酶(L-isoleucine dioxygenase,IDO)编码基因ido,以期利用微生物转化法合成4-HIL,并研究α–酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)和Fe2+添加量对菌株合成4-HIL的影响.结果表明:构建的C.glutamicum YILW-IDO菌株能够表达出有活性的IDO,并能够利用菌体自身合成的L-Ile以及培养基中的α–酮戊二酸合成4-HIL.此外,α–酮戊二酸和Fe2+均能影响4-HIL的合成,在其添加量分别为40,mmol/L和4,mmol/L条件下,培养50,h,4-HIL产量达(35.7±1.0)mmol/L.本研究可为4-HIL及氨基酸衍生物的生物制造提供理论依据.     

甾体药物安宫黄体酮中杂质的分离和鉴定

应用柱色谱方法对安宫黄体酮多次重结晶母液中所含的杂质进行了分离和纯化,并应用NMR和MS等波谱方法确定了5个孕甾烷型杂质的结构:17α-氧乙酰基-6α.甲基孕甾一3,20-二酮、17α-氧乙酰基孕甾4-烯-3,20-二酮、17α-氧乙酰基孕甾4-烯.20-酮、17α-氧乙酰基-6β羟基-6α-甲基孕甾4-烯-3,20-二酮、17α-氧乙酰基-6α-羟基-6β-甲基孕甾4-烯-3,20-二酮.为安宫黄体酮的质量控制及代谢研究提供了依据.     

红车轴草化学成分研究

运用正相、反相硅胶柱层析和HPLC对红车轴草(Trifolium Pratense L.)的化学成分进行研究,并利用现代波谱技术鉴定化合物的结构.从红车轴草全草的乙醇提取物中分离得到5个化合物(图1),分别鉴定为豆甾-4-烯-3-酮(1),豆甾-4-烯-3,6v二酮(2)和α-豆甾-4-烯-3,6-二酮(3),齐墩果烯...     

青天葵石油醚部位的化学成分

本实验采用多种色谱手段及重结晶方法对青天葵石油醚部位的化学成分进行分离纯化,并根据波谱分析和理化常数等方法对化合物进行结构鉴定.共得到了10个化合物,分别为:β-谷甾醇(1)、豆甾醇(2)、6,9,10-三羟基-7E-烯十八烷酸(3)、麦角甾-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇(4)、豆甾-22-烯-3β,6β,9β-三醇(5)、麦角甾-7,22-二烯-3β,5α,6α-三醇(6)、3β-羟基豆甾-5,22-二烯-7-酮(7)、3β-羟基豆甾-5-烯-7-酮(8)、橙黄胡椒酰胺乙酸酯(9)、橙黄胡椒酰胺苯甲酸酯(10).其中化合物3、5～8、10为首次从青天葵植物中分离得到.     

雷斯青霉的复壮及水溶性离子液体对其15α-羟基化的影响

针对真菌培养过程中出现的退化问题,对雷斯青霉采用灭菌胡萝卜作为斜面培养基进行了复壮处理,并通过添加水溶性离子液体的方式提高底物的溶解与传递.结果表明:在相同培养条件下,采用胡萝卜复壮后的雷斯青霉羟基化左旋乙基甾烯双酮产15α-羟基化左旋乙基甾烯双酮.选用离子液体[EMIm][EtOSO3]代替有机溶剂作为促溶剂,促溶剂添加量为4%,底物左旋乙基甾烯双酮投料量为5,g/L,投料时间为30,h,转化时间为72,h时的产物转化率最高可达68.1%.     

微孔草种子化学成分的研究

从微孔草 (MicroulasikkimenisHemsl)种子中首次分离出 8个已知化合物 :β 谷甾醇 (1)、羽扇豆醇 (2 )、白桦脂醇 (3 )、豆甾 4 烯 3 酮 (4)、豆甾 4 烯 3 二酮 (5 )、羟基豆甾 4 烯 3酮 (6)、诺米林 (7)、如忒文 (8) .报道了这8个化合物的分离纯化和结构鉴定     

苦瓜茎叶化学成分分离及结构研究

通过层析法分离,利用UV,IR,MS,1H NMR,13C NMR和2D NMR等波谱技术及理化性质鉴定苦瓜茎叶提取物的化学结构. 分离鉴定了六个化合物：26,27二羟基羊毛甾-7,9(11),24-三烯-3,16-二酮（Ⅰ）,momordol（Ⅱ）,苦瓜皂苷Ⅰ（Ⅲ）,β-谷甾醇（Ⅳ）,羊毛甾-9(11)-烯-3α,24S,25-三醇（Ⅴ）和(24R)环菠萝蜜烷甾-3α,24R,25-三醇（Ⅵ）. 化合物Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ系首次从苦瓜中分离得到.     

黄盾盘菌的化学成分

从子囊菌亚门黄盾盘菌(Scutellinia ascoboloides)发酵液中首次分离得到8个化合物,其结构通过光谱学技术确定为:α-甜没药醇(1),pelandjauic acid(2),geranicardic acid(3),(4E,8E)-N-2'-羟基棕榈酰-9-甲基-4,8-sphin-gadienine(4),麦角甾-7,22-二烯-3-酮(5),麦角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮(6),麦角甾-5,7,22-三烯-3β-醇(7),麦角甾-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇(8).     

链霉菌H41-55发酵菌丝体的化学成分

目的:分离鉴定链霉菌属放线菌H41-55发酵菌丝体中化合物结构.方法:运用硅胶柱色谱、凝胶色谱、高效液相色谱等手段对链霉菌属放线菌H41-55发酵菌丝体进行化学成分分离,利用高分辨质谱、核磁等技术鉴定化合物结构.结果:从链霉菌属放线菌H41-55发酵菌丝体分离最终得到15个化合物,确定它们的结构分别是吲哚-3-甲醛(1)、5-羟基-3-(1-羟基-2-甲基丁基)-1-甲基-2 (5H)-呋喃(2)、环-(L-脯氨酰-L-亮氨酰)(3)、6-(3-甲基-2-丁烯基)-3-吲哚乙腈(4)、抗霉素A9 (5)、kitamycin A (6)、泛醌Q9 (7)、麦角甾-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇(8)、麦角甾-8 (14),22E-二烯-3β,5α,6β,7α-四醇(9)、豆甾-7,22-二烯-3β,5α,6α-三醇(10)、5α,6α-环氧-(22E,24R)-麦角甾-8,22-二烯-3β,7α-二醇(11)、5a,6a-环氧-(22E,24R)-麦角甾-8,22-二烯-3β,7β-二醇(12)、3β,5α,9α-三羟基-(22E,24R)-麦角甾-7,22-二烯-6-酮(13)、4,6,8 (14),22-麦角甾四烯-3-酮(14)、(22E,24R)-麦角甾-4,7,22-三烯-3-酮(15).其中化合物8、10、14和15为首次从海洋来源链霉菌属中分离得到.结论:采用MTT法筛选15个化合物的体外抗肿瘤细胞毒活性,发现均具有一定的活性.其中,化合物2、5、6、7和14表现出较好的生长抑制活性,其IC50质量浓度均小于30μg/m L.     

宽叶鼠麴草化学成分的研究

对滇产宽叶鼠麴草(Gnaphalium adnatum)枝叶粗提物进行化学成分研究,采用反复硅胶柱层析、重结晶的方法分离纯化得到14个化合物,通过现代谱学方法和理化常数测定鉴定了它们的结构,分别为:7-O-(2′-异戊烯基)-5-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮(1),7-O-(β-D-葡萄糖苷)-5-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮(2),5,7-二羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮(3),银椴苷(4),4-(3′,4′-苯甲氧基)-3-甲基-3-烯-2-酮(5),对苯二甲酸-(正丁基-异丁基)-二醇酯(6),3β-香树脂醇(7),4,22-二烯-3-酮豆甾烷(8),4,22-二烯-3-酮-6β-羟基豆甾烷(9),5,22-二烯-7-酮-3β-羟基豆甾烷(10),5-烯-7-酮-3β-羟基豆甾烷(11),二十四烷酸甘油酯(12),豆甾醇(13),胡萝卜苷(14).所有化合物均为首次从该植物中分离得到,其中化合物1～12为首次从该属植物中分离得到.     

软珊瑚Sinularia papillosa次生代谢物质研究

从采自海南三亚附近海域的短指软珊瑚Sinularia papillosa中首次分离得共轭甾酮,经波谱分析,鉴定它们分别为(5α)-孕甾-1,20-二烯-3-酮和孕甾-1,4,20-三烯-3-酮.