糖尿病运动疗法及其机理

糖尿病是一种严重危害人们健康的慢性疾病,在人群中有很高的发病率。研究表明：长时间规律的有氧运动能够预防和治疗糖尿病;运动可增加骨骼肌细胞内葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)基因表达水平,促进骨骼肌细胞内的GLUT4从内膜向细胞外膜转位,从而提高骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取和利用。本文综述了糖尿病的运动疗法及其机理,为大家提供最新的信息。     

葡萄糖转运蛋白1（GLUT-1）抑制剂BAY-876体内活性的正电子发射型计算机断层显像（PET）检测

目前,葡萄糖转运蛋白(glucose transporter,GLUT)不仅是细胞摄取葡萄糖的功能与物质保障,同时也是恶性肿瘤抗肿瘤药物治疗的新型干预靶点。建立GLUT抑制剂的体内活性评价方法具有重要意义。利用正电子发射型计算机断层显像检测仪(positron emission computed tomography,PET)对小动物肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)肿瘤模型进行PET检测,建立GLUT抑制剂的小动物体内活性检测方法。在HCC细胞系中检测GLUT-1的表达,选取GLUT-1表达水平最高的细胞系接种BalB/c免疫缺陷动物皮下,形成免疫缺陷动物皮下肿瘤模型。连续三日口服灌胃给药,给予动物5 mg/kg的GLUT-1抑制剂BAY-876后,进行PET检测。动物行尾静脉注射200μCi的核素探针~(18)F-FDG,约30 min后进行PET检测。在此基础上,使用盖革计数器检测动物肿瘤与血液的放射性强度比较。在所选细胞系中,MHCC-97H细胞中GLUT-1的表达显著高于其他细胞系,BAY-876治疗动物能够显著抑制MHCC-97H皮下肿瘤组织对18F-FDG的摄取。GLUT-1抑制剂BAY-876能够显著抑制HCC细胞对葡萄糖的摄取,成功建立了利用PET检测GLUT抑制剂动物体内活性的PET检测方法。     

利用CRISPR/Cas9技术构建GLUT4基因敲减的A549细胞系

目的:为探究GLUT4基因在肺癌细胞中的功能及影响.方法:在GLUT4外显子上设计了4个sgRNAs(S1、S2、S3、S4),分别与PX458载体连接形成重组表达载体后,借助转染试剂lipo3000将表达载体转入生长态势良好的A549细胞中,再利用流式细胞仪分选技术对转入重组载体发出绿色荧光的细胞进行单细胞分选.利用基因组测序筛选突变株,提取突变株的RNA和蛋白,进行Real-time PCR及Western Blot检测敲减效率,并利用激光共聚焦显微术检测突变株葡萄糖摄取量的变化.结果:突变株细胞在mRNA及蛋白水平均表现出GLUT4基因敲减效果,并在葡萄糖摄取上表现出明显的降低趋势.结论:利用CRISPR/Cas9系统成功建立了GLUT4基因敲减A549细胞系.     

果糖代谢相关蛋白GLUT5和KHK在肺腺癌中的表达及其生物学功能

目的:检测果糖代谢相关蛋白葡萄糖转运蛋白5(GLUT5)和己酮糖激酶(KHK)在肺腺癌中的表达及生物学功能.方法:利用http://kmplot.com/analysis/上的数据分析GLUT5和KHK的mRNA表达水平对肺腺癌患者生存预后的影响;免疫组织化学方法检测GLUT5和KHK蛋白在肺腺癌及相应癌旁组织中的表达水平;SPSS统计分析GLUT5和KHK表达水平与肺腺癌患者年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、临床分期、病理分级等临床病理指标之间的关系,以及对患者生存预后的影响;MTT和克隆形成实验检测无葡萄糖条件下果糖对肺腺癌细胞增殖和克隆形成的影响,以及沉默GLUT5和KHK对细胞生物学行为的影响.结果:GLUT5和KHK mRNA表达水平较高的肺腺癌患者,其总生存和无进展生存均较差;GLUT5和KHK在肺腺癌组织中的蛋白表达水平均高于癌旁组织(P0.01);GLUT5高表达与肿瘤大小、淋巴结转移和病理分化较差有关(P0.05);KHK高表达与肿瘤大小、临床分期和病理分化较差有关(P0.05);而且GLUT5和KHK高表达的患者预后较差(P0.05).果糖可促进肺腺癌细胞的增殖和克隆形成,沉默GLUT5和KHK后,细胞利用果糖的能力显著下降.结论:果糖可以促进肺腺癌细胞的增殖和克隆形成,果糖代谢相关蛋白GLUT5和KHK在肺腺癌组织中高表达,且与肺腺癌的恶性进展密切相关,GLUT5和KHK可作为治疗肺腺癌潜在临床靶点.     

地塞米松和胰岛素诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的分子机理

用地塞米松和胰岛素长期作用3T3—L1脂肪细胞产生胰岛素抵抗，用胰岛素增敏剂罗格列酮改善胰岛素抵抗，微量化GOD=POD法检测培养基中残存的葡萄糖，并检测细胞中葡萄糖转运子G1ut4基因和蛋白及胰岛素信号传递元件IRS—1的基因变化．探讨了地塞米松和胰岛素诱导3T3—L1脂肪细胞产生胰岛素抵抗的机理．结果发现：①地塞米松和胰岛素诱导3T3—L1脂肪细胞产生胰岛素抵抗，细胞对葡萄糖的摄取减少．罗格列酮改善抵抗后，葡萄糖的摄取较抵抗组增加．②抵抗时，葡萄糖转运子G1ut4基因和蛋白水平明显降低，改善后基因表达上调显著，蛋白水平升高，介于正常对照组与抵抗组之间．②IRS-1在抵抗时下调，用罗格列酮改善后，IRS—1的基因水平无明显变化．     

α-亚麻酸对胰岛素抵抗HepG2细胞脂类合成基因表达的影响

目的分析在α-亚麻酸(ALA,C18:3)干预后,胰岛素抵抗Hep G2(insulin resistance Hep G2,IR-Hep G2)细胞模型脂类合成关键基因表达水平的变化。方法 Hep G2细胞造模期分为两组,由无血清培养基培养的对照组(normal control group,NC)以及含有0.25 mmol/L软脂酸的无血清培养基培养的软脂酸组(palmitic acid,PA),培养24 h后鉴定细胞胰岛素敏感性并测定细胞内胆固醇(total cholesterol,TCH)、甘油三酯(Tryglyceride,TG)水平,然后用ALA替代20%的PA培养12 h,再次鉴定细胞胰岛素敏感性并检测细胞内TCH、TG水平,real time q PCR检测TG、TCH合成关键基因mRNA水平,Western blot检测TG、TCH合成关键基因蛋白表达量。结果 IR-Hep G2细胞模型建立成功,并且PA组TCH水平显著高于NC组(P=0.0016),出现了脂代谢紊乱;ALA干预IR-Hep G2细胞12 h后,细胞活性有所恢复,与PA组相比,ALA组胰岛素诱导基因(insulin induced genes,INSIGs)及脂类合成关键蛋白的mRNA表达无明显变化;与基因表达结果不一致的是,ALA干预后可以特异性提升细胞内INSIG-2蛋白相对表达量,但对INSIG-1蛋白相对表达量没有明显影响。同时,ALA可以显著抑制55k Da固醇调节元件结合蛋白-2(sterol regulatory element-binding protein-2,SREBP-2)、HMG-Co A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coen-zyme A reductase,HMGCR)及脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN)蛋白的表达,且ALA组细胞内TG水平显著降低(P=0.0119)。结论 0.05 mmol/L ALA干预IR-Hep G2细胞后,通过提升INSIG-2蛋白的表达,抑制SREBP-2从内质网到高尔基体的剪切成熟活化,降低细胞内55k Da SREBP-2水平及HMGCR的表达,并且抑制FASN表达,从而抑制了TG/TCH的合成。     

改构黄藤素对钙化细胞的作用机制

通过建立β-半胱氨酸磷酸盐诱导大鼠血管平滑肌细胞(RASMCs)钙化的模型,研究改构黄藤素在血管钙化中的作用.通过Von Kossa染色技术检测发现改构黄藤素可以显著降低钙化细胞内的钙盐沉积;利用实时定量PCR(Real-time Quantitative PCR)技术检测发现改构黄藤素可以将钙化细胞内的Nrf-2mRNA水平由原来的0.09±0.01显著升高到2.54±0.35;采用Western Blot技术检测发现改构黄藤素可以显著增强钙化细胞内的蛋白表达量;试剂盒检测活性氧(ROS)的含量发现改构黄藤素可以将钙化细胞内的荧光强度由原来的1.04±0.03显著降低到0.82±0.01;试剂盒检测一氧化氮(NO)的含量,发现改构黄藤素可以将钙化细胞内的NO含量由原来的5.73±0.05μmol/L显著降低到3.73±0.15μmol/L.     

RT-PCR法检测大鼠组织中GLUT8基因表达特异性

采用半定量RT_PCR技术检测青春前期和成年大鼠的主要组织中GLUT8基因mRNA表达水平.实验结果显示,葡萄糖转运蛋白GLUT8基因在成年和青春前期大鼠的睾丸组织中都有高度表达,在心脏和肾脏组织中有少量表达,在肝、脾等组织中的表达是微量的;在成年大鼠睾丸组织中,Leydig细胞、睾丸生精细胞以及附睾的精子细胞中GLUT8基因都有大量的表达,其中以在Leydig细胞中的表达最丰富,而且GLUT8基因在睾丸生精细胞中的表达水平高于附睾的精子细胞.结果说明GLUT8蛋白主要分布在大鼠睾丸组织中,并且主要在Leydig细胞和精子细胞中参与葡萄糖转运和能量代谢与供应.     

胰岛素增敏剂对卵巢颗粒细胞胰岛素抵抗的调控作用

以人工诱导卵巢颗粒细胞胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)细胞模型,观察细胞内关键信号分子的表达以及胰岛素增敏剂的体外作用。通过沃曼青霉素(Wortmannin,WT)特异性地抑制胰岛素传导途径中磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K)通路,作用于体外培养的猪卵巢颗粒细胞48h后,再加入曲格列酮、二甲双胍、小檗碱、隐丹参酮48h,观察对IR的改善情况。以葡萄糖氧化酶法检测细胞对葡萄糖的消耗量,以蛋白印记法(Western Blot)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和实时荧光PCR法,检测葡萄糖转运蛋白4(Glut4)、丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)、核转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)表达。结果表明:胰岛素糖代谢途径被WT阻滞,IR细胞对培养基中葡萄糖的摄取明显抑制。二甲双胍、小檗碱和隐丹参酮,都能使葡萄糖摄取增加,但稍逊于曲格列酮。IR细胞的Glut4的表达下降,MAPK和PPAR-γ表达升高;胰岛素增敏剂可以部分逆转IR细胞的上述信号蛋白的表达异常,以曲格列酮作用最为显著。总之,WT阻断PI-3K途径产生IR,胰岛素增敏剂能改善IR,隐丹参酮和小檗碱增敏的作用类似二甲双胍,而曲格列酮作用最为显著。     

小麦烷基间苯二酚对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗改善作用及机制

低度慢性炎症状态是肥胖导致机体胰岛素抵抗的重要原因之一。小麦烷基间苯二酚(alkylresorcinols, ARs)是全麦食品膳食的生物标记物和重要的活性功能成分。利用体外炎症因子诱导,建立3T3-L1成熟脂肪细胞胰岛素抵抗模型,通过检测脂肪细胞脂质分解和葡萄糖吸收与利用情况,探讨小麦ARs在炎症状态下对脂肪细胞胰岛素抵抗的保护机制。研究结果表明:不同浓度小麦ARs(5~20μmol/L)干预能够剂量依赖性地改善炎症因子诱导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗,脂肪细胞对葡萄糖利用率分别提升了4.3%、10.2% 和24.0%;小麦ARs可以显著缓解炎症因子导致的脂肪细胞脂质分解。进一步机制解析发现:炎症因子显著降低了脂肪细胞糖代谢两个关键蛋白Akt的磷酸化(p-Akt)及其下游GLUT4蛋白表达,导致其葡萄糖利用障碍,而ARs干预显著提升了这两个蛋白的表达;采用PI3K抑制剂(LY294002)预处理脂肪细胞后,ARs 对于脂肪细胞p-Akt及GLUT4表达的增加被抑制,相应的对于葡萄糖吸收的改善作用也被显著降低,脂肪细胞脂质分解增加,表明ARs通过特异性激活p-Akt/GLUT4信号通路改善了3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗。最后,研究了小麦ARs的5种主要单体成分分别对于脂肪细胞胰岛素抵抗的改善作用,结果表明,十七烷基间苯二酚是小麦ARs发挥生理功能的主要活性物质。     

白血病G6PD蛋白表达的研究

目的:观察白血病患者骨髓中白血病细胞葡萄糖-6磷酸脱氢酶(G6PD)蛋白的表达情况,探讨G6PD与白血病的关系。方法:应用免疫组化方法检测35例白血病患者和35例非恶性血液病患者骨髓组织标本中白血病细胞G6PD蛋白的表达,比较白血病患者和非恶性血液病患者G6PD蛋白表达率的差异。结果:G6PD蛋白在白血病骨髓组织白血病细胞中呈现弱阳性表达。35例白血病患者骨髓组织中G6PD蛋白阳性表达率为25.7%(9/35),而35例非恶性血液病患者骨髓组织中G6PD蛋白阳性表达率为2.9%(1/35),差异有统计学意义(P<0.05)。结论:白血病可能存在G6PD蛋白的表达上调,值得进一步研究。     

过氧化氢诱导前列腺癌PC3细胞HSP60表达和Akt蛋白磷酸化的研究

以不同浓度H_2O_2刺激PC3细胞24h,应用MTT法分析细胞活力变化,并采用蛋白印迹方法检测HSP60蛋白、Akt蛋白(总Akt蛋白)和磷酸化Akt蛋白的表达水平.结果表明,15.625μmol/L的H2O2可诱导PC3细胞内HSP60表达显著升高(p0.05),7.312μmol/L和15.625μmol/L的H_2O_2均会导致磷酸化Akt蛋白的量显著下降(p0.01),但该两种浓度的刺激对细胞内总Akt蛋白量并无显著影响(p0.05).     

转运葡萄糖苷类化合物的Caco-2细胞模型建立

建立转运葡萄糖苷类化合物的Caco-2细胞模型,为葡萄糖及葡萄糖苷类化合物肠道吸收研究提供基础。通过对Caco-2细胞最适培养基的选择、单层致密性的测定、单层通透性和细胞两侧碱性磷酸酶活性比的测定、单层亚显微结构的观察、细胞葡萄糖转运蛋白SGLT1和GLUT2的mRNA及蛋白表达水平的分析,建立可靠的细胞模型。研究表明:Caco-2细胞的最适培养基为添加体积分数15%血清的DMEM低糖培养基;Caco-2细胞在14～17d的跨膜电阻趋于稳定,苯酚红的表观渗透系数达到0.49×10-6~0.51×10-6cm·s-1,微绒毛分化成熟,细胞两侧碱性磷酸酶比值达到2.0以上。葡萄糖转运载体SGLT1的mRNA表达在14d时显著高于17d和21d,葡萄糖转运载体SGLT1和GLUT2的蛋白表达在14、17、21d无显著差异(P<0.05)。Caco-2细胞培养14～17d即可建立可靠的肠细胞吸收模型,用于葡萄糖及葡萄糖苷类化合物吸收的体外研究。     

改构黄藤素对钙化细胞的作用机制研究

通过建立β 半胱氨酸磷酸盐诱导大鼠血管平滑肌细胞（RASMCs）钙化的模型,研究改构黄藤素在血管钙化中的作用.通过 Von Kossa 染色技术检测发现改构黄藤素可以显著降低钙化细胞内的钙盐沉积;利用实时定量 PCR（Real time Quantitative PCR）技术检测发现改构黄藤素可以将钙化细胞内的 Nrf-2 mRNA 水平由原来的 0.09±0.01 显著升高到 2.54±0.35;采用 Western Blot 技术检测发现改构黄藤素可以显著增强钙化细胞内的蛋白表达量;试剂盒检测活性氧（ROS）的含量发现改构黄藤素可以将钙化细胞内的荧光强度由原来的1.04±0.03 显著降低到 0.82±0.01;试剂盒检测一氧化氮（NO）的含量,发现改构黄藤素可以将钙化细胞内的 NO 含量由原来的 5.73 ± 0.05 μmol/L 显著降低到3.73 ± 0.15 μmol/L.     

利用多克隆抗体检测纺锤体蛋白基因INAIAP在肝癌细胞中的表达

为探究纺锤体蛋白INMAP的功能及其在细胞恶性增殖中发挥的作用,制备INMAP多克隆抗体。利用0.1 mmol/L IPTG于16℃诱导His-INMAP融合蛋白进行原核表达,SDS-PAGE及免疫印迹检测蛋白表达。4.0 mol/L尿素处理包涵体获得可溶性融合蛋白,镍亲和柱分离纯化融合蛋白抗原并检测蛋白浓度及纯度。以所获抗原免疫4只Balb/c小鼠,收集心脏抗血清。以纯化前、后的原核表达产物作为抗原,检测INMAP多克隆抗体的特异性。通过免疫印迹分析INMAP在正常肝细胞系L-02及5个肝癌细胞系(PLC、Hep G2、SUN449、SMMC-7721和BEL-7402)中的表达差异。结果显示,His-INMAP融合蛋白主要以包涵体形式存在,经4.0 mol/L尿素处理可获得可溶性目的蛋白,且纯化后的抗原纯度较高(94.1%)。INMAP多克隆抗体能与INMAP抗原特异结合。INMAP在6种肝细胞中具有多态性,除PLC外,在其他肝癌细胞中其基因表达水平显著下调。本研究制备的INMAP多克隆抗体特异性高,为INMAP基因功能的进一步研究奠定了基础。     

双氢青蒿素和达沙替尼联合用药对肝癌HepG2细胞的抑制作用

目的:探讨双氢青蒿素(DHA)和达沙替尼(Das)联合用药对人肝癌细胞的抑制作用及其分子机制.方法:采用CCK8法、克隆形成实验、吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色法、流式细胞术分别进行细胞活性、细胞凋亡、细胞周期、线粒体膜电位、细胞内活性氧(ROS)含量进行检测评价双青蒿素和达沙替尼协同用药的药效,采用Western blot研究其作用机制.结果:(1)DHA和Das单独使用均抑制HepG2细胞的生长,两者在一定的浓度下联合发挥协同作用;联合用药结果显示细胞克隆数量少且集落小;(2)联合用药后,周期调控蛋白c-Myc、Cyclin E1和E2F1表达明显降低,细胞周期在G0/G1阻滞;(3)联合用药后细胞内ΔΨm明显下降且凋亡更加显著,抗凋亡蛋白Bcl-2和PARP表达明显减少,促凋亡蛋白Bim、Cleaved-Caspase 9和Cleaved-PARP的表达显著增加;(4)DHA应用可显著促进胞内ROS的产生,并且显著下调抗氧化蛋白Nrf2表达.结论:DHA和Das联合用药显著抑制HepG2的增殖活性,二者在一定浓度下发挥协同作用,促使周期阻滞,诱导细胞凋亡,分子机制与G1期周期阻滞及线粒体依赖的凋亡信号通路有关.     

PKCθ-EGFP融合蛋白在HeLa细胞中的表达及其对细胞形态的影响

目的:分析增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与蛋白激酶C-θ(PKCθ)的融合蛋白(PKCθ-EGFP)在HeLa细胞中的表达、亚细胞定位及其对细胞形态的影响。方法:用脂质转染胺(Lipofec-tAMINE 2000)为载体分别以pPKCθ-EGFP和pEGFP-N1转染HeLa细胞,流式细胞仪分析其表达率,激光共聚焦显微镜分析其亚细胞定位,同时分析二丁酸佛波醇酯(PDB)和小檗碱对其亚细胞定位和细胞形态的影响。结果:转染pEGFP-N1或pPKCθ-EGFP的HeLa细胞48 h后,表达绿色荧光的细胞百分率分别为(70.9±4.4)%和(45.8±2.3)%(P<0.05)。表达的PKCθ-EGFP融合蛋白均匀分布于细胞内,与EGFP蛋白在细胞内的分布相似。PDB刺激30 min后,表达PKCθ-EGFP的HeLa细胞的形态发生显著变化,即由原来的梭形变成圆形,荧光强度增强。但表达EGFP的HeLa细胞的形态及荧光分布均不受影响。小檗碱对PDB诱导的HeLa细胞的形态和EGFP-PKCθ融合蛋白的分布无明显影响。结论:表达PKCθ-EGFP融合蛋白的HeLa细胞在PDB作用下细胞形态发生显著变化。     

盐酸埃克替尼通过激活蛋白激酶C诱导Tca8113细胞表达iNOS和凋亡

体外培养Tca8113细胞,随机分为4组,(1)对照组;(2)埃克替尼处理组(20μmo1/L);(3)PKC抑制剂Ro31-8220(3μmol/L)处理组;(4)埃克替尼+Ro31-8220组(20μmo1/L Icotinib,3μmol/L Ro31-8220),不同干预因素处理细胞4h.Western blot检测不同处理组的胞膜内的PKC-α的表达水平,iNOS ELISA检测试剂盒测定细胞的iNOS含量,Griess方法测定Tca8113细胞产生的NO水平,用DNA fragmentation检测Tca8113细胞的凋亡情况.结果表明埃克替尼组DNA fragmentation细胞凋亡及上清液的iNOS,NO较对照组均明显升高;埃克替尼组细胞膜的PKC-α蛋白表达量明显增加.用埃克替尼与PKC的抑制剂Ro31-8220共同处理Tca8113细胞后,胞膜的PKC-α,iNOS的蛋白表达水平及产生的NO能被Ro31-8220显著抑制,且PKC抑制剂Ro31-8220能逆转埃克替尼引起的Tca8113细胞凋亡.埃克替尼能诱导Tca8113细胞iNOS表达和NO生成增加并能诱导Tca8113细胞凋亡;埃克替尼能促进细胞膜内的PKC-α表达增加;埃克替尼诱导的Tca8113细胞iNOS表达和凋亡与PKC有关.     

白屈菜碱对SGC-7901细胞Cdk1、cyclinB1表达影响

研究白屈菜碱对人胃癌SGC-7901细胞Cdk1、p-Cdk1(Thr14)、cyclinB1蛋白表达,探讨白屈菜碱诱导人胃癌SGC-7901细胞G2/M期阻滞的机制.采用Western blotting法测定白屈菜碱对SGC-7901细胞Cdk1、p-Cdk1(Thr14)、cyclinB1蛋白表达的影响.不同质量浓度的白屈菜碱可显著下调人胃癌SGC-7901细胞内Cdk1与cyclinB1蛋白表达水平,同时显著上调p-Cdk1(Thr14)蛋白的表达水平,并呈一定的剂量依赖性.白屈菜碱可下调SGC-7901细胞内Cdk1和cyclinB1蛋白的表达,上调p-Cdk1(Thr14)蛋白的表达,这可能是白屈菜碱诱导SGC-7901细胞G2/M期阻滞的主要机制之一.     

小鼠T细胞发育相关基因RS21-C6的表达谱及其编码蛋白的细胞内定位

研究了小鼠T细胞发育相关基因RS21-C6的表达谱及其在细胞内的定位.提取小鼠8种组织及处于5个发育阶段的胸腺细胞总RNA,逆转录成cDNA后,利用RS21-C6基因特异性引物,观察了RS21-C6基因的表达;同时构建pEGFP-N3/RS21-C6重组表达载体,在激光共聚焦荧光显微镜下观察了细胞内荧光分布.RT-PCR结果表明RS21-C6基因在所检测的组织和细胞中除骨骼肌和CD4SP胸腺亚群外均有不同程度的表达.激光共聚焦荧光显微镜观察结果表明,RS21-C6-GFP(绿色荧光蛋白)融合蛋白表达在胞浆内,RS21-C6-GFP融合基因的瞬间和稳定表达均获得了相同结果.