主动外排系统作为鲍曼不动杆菌耐环丙沙星重要机制的研究

目的探讨耐环丙沙星鲍曼不动杆菌的主动外排机制。方法试管稀释法检测56株临床鲍曼不动杆菌对环丙沙星的敏感性;用直接荧光法检测耐药株在有无外排泵抑制剂时鲍曼不动杆菌胞内药物聚集浓度;结合药敏和直接荧光法两项结果筛选出6株外排抑制剂存在时胞内药物聚集浓度明显升高的环丙沙星耐药株,对该耐药组及对照敏感组做胞内环丙沙星聚集浓度的线性测定;RT—PCR法检测两组菌株主动外排泵基因adeABC的表达水平;对adeABC自身启动子区域相关基因片段进行PCR扩增并测序。结果（1）56株鲍曼不动杆菌中,48株对环丙沙星耐药（MIC〉4rag／1）;0株对环丙沙星中介（1mg／1≤MIC≤≤4mg／1）;8株对环丙沙星敏感（MIC〈1mg／1）。（2）耐药组药物积累量不及敏感组,加入外排泵抑制剂叠氮化钠后积累量上升并接近敏感组。（3）耐药组主动外排基因adeB的表达水平（2．372±0．032）明显高于敏感组（1．654±0．040）（P〈0．01）。（4）自身启动子区域相关基因片段没有发现突变。结论鲍曼不动杆菌对环丙沙星的耐药现象非常严峻;外排泵基因adeABC的过度表迭是鲍曼不动杆菌对环丙沙星耐药的重要原因;adeABC基因自身启动子区域无导致adeABC过度表达的基因突变。     

泛素样蛋白蛋白酶体系统对单耐异烟肼结核杆菌耐药性的影响研究

为探讨泛素样蛋白蛋白酶体系统对单耐异烟肼结核杆菌耐药性的影响及其机制。采用刃天青显色法,比较单耐异烟肼结核杆菌(对照组)与4种基因(Pup基因、Dop基因、PafA基因、Mpa基因)过表达的单耐异烟肼结核杆菌菌株和4种相同基因缺失突变的单耐异烟肼结核杆菌菌株异烟肼最低抑菌浓度(MIC)值的差异;比较在应用外排泵抑制剂后,单耐异烟肼结核杆菌(对照组)与4种基因(Pup基因、Dop基因、PafA基因、Mpa基因)过表达的单耐异烟肼结核杆菌菌株和4种相同基因缺失突变的单耐异烟肼结核杆菌菌株异烟肼MIC差值间的差异。结果显示:(1)与单耐异烟肼结核杆菌相比,过表达PafA基因的该菌株异烟肼的MIC值增加了1.03μg/m L,过表达Dop、Mpa基因的该菌株异烟肼的MIC值分别降低了1.03μg/m L、0.68μg/m L,差异均无统计学意义(P0.05);与单耐异烟肼结核杆菌相比,过表达Pup基因的该菌株异烟肼的MIC值增加了8μg/m L,缺失Pup、Dop、PafA、Mpa基因的该菌株异烟肼的MIC值分别降低了4.82、4.98、4.99、4.9μg/m L,差异均有统计学意义(P0.05)。(2)与在应用外排泵抑制剂后单耐异烟肼结核杆菌相比,过表达Pup基因的该菌株异烟肼的MIC差值增加了8μg/m L,缺失Pup、Dop、PafA、Mpa基因的该菌株异烟肼的MIC差值分别降低4.65、4.81、4.83、4.75μg/m L,差异均有统计学意义(P0.05);与在应用外排泵抑制剂后单耐异烟肼结核杆菌相比,过表达Dop、PafA、Mpa基因的该菌株异烟肼的MIC差值分别降低了1、0.99、0.65μg/m L,差异均无统计学意义(P0.05)。由此可知,结核杆菌泛素样蛋白蛋白酶体系统对单耐异烟肼结核杆菌耐药性的产生有调控作用,其作用机制可能是通过调控单耐异烟肼结核杆菌外排泵的功能来调控其耐药性的产生。     

牛结核分支杆菌临床分离株rpsL，rpoB，KatG基因突变分析

采用噬菌体生物扩增法对本实验室分离鉴定的25株奶牛结核分支杆菌进行药敏分析,检测出14株耐链霉素、利福平、异烟肼菌株．用PCR扩增耐药株的rpsL基因片段（370bp）、rpoB基因片段（213bp）和KatG基因片段（458bp）,并对目的片段进行测序分析,其中5株耐链霉素菌株的rpsL基因在43位点发生突变,均由赖氨酸密码子（AAG）突变为精氨酸密码子（AGG）;5株利福平耐药株的rpoB基因在531位点、526位点、5¨位点发生突变,其中有3株分离株的rpoB基因在531位点发生点突变,1株分离株的rpoB基因在526位点发生突变,1株分离株的rpoB基因在531位点和511位点发生了较为少见的联合突变;4株异烟肼耐药菌株,其中2株在315位点发生碱基突变,2株在463位点发生碱基突变．     

四川地区利福平耐药结核分枝杆菌rpoB基因利福平耐药决定区突变分析

本文对268株结核分枝杆菌临床分离株(包括213株利福平耐药株、55株利福平敏感株)rpoB基因RRDR区进行测序并比较分析.结果表明,在213株利福平耐药株中有200株(93.90%)在rpoB基因RRDR区发生了突变,在55株利福平敏感株中RRDR均未发生突变.突变频率最高的类型依次为:531位点(55.87%),526位点(16.43%),516位点(10.33%)和511位点(8.92%),以上四个位点的突变菌株数占所有利福平耐药株的91.55%.四川地区利福平耐药株中511位点突变频率高于全国其他地区.     

重庆西南医院骨科感染金黄色葡萄球菌的分子分型及耐药性研究

目的:了解骨科感染中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的检出率,分析其分型特点和耐药特征,为临床治疗和流行病学研究提供依据.方法:从重庆西南医院骨科患者送检标本中分离出162株金黄色葡萄球菌,以mec A-fem B双重聚合酶链式反应(PCR)鉴定MRSA,应用葡萄球菌染色体mec耐药盒(SCCmec)对金黄色葡萄球菌A蛋白基因(spa)分型、多位点序列分型(MLST)方法确定菌株序列型别,并检测所有菌株对青霉素、苯唑西林、庆大霉素、利福平及四环素等13种抗菌药物的耐药情况.结果:162株金葡菌中共检出34株MRSA(20.99%),包括SCCmecⅠ型16株,SCCmecⅣ型17株,SCCmecⅤ型1株,未检测到SCCmecⅡ、Ⅲ型.spa及MLST分型结果显示,所有MRSA菌株共分为14个spa型,9个ST型.药敏试验显示菌株多重耐药现象较少,未发现耐万古霉素的MRSA.结论:西南医院骨科MRSA主要为SCCmecⅠ、Ⅳ型,ST59-MRSA-Ⅳ-t437为主要流行克隆,其对克林霉素、红霉素耐药率较高.     

结核分枝杆菌临床分离株链霉素耐药性的检测及耐药基因突变位点分析

为检测结核分枝杆菌链霉素(streptomycin,SM)耐药性,分析耐药基因突变,探讨DNA测序分析技术在结核分枝杆菌链霉素耐药性检测中的应用价值。采用方法:1、用传统的比例法药敏试验对49株结核分枝杆菌临床分离株进行链霉素耐药性检测。2、用DNA测序分析技术对49株结核分枝杆菌临床分离株进行链霉素耐药相关基因Rpsl和rrs的突变位点分析,筛查耐药相关突变位点。3、探讨DNA测序分析技术对结核分枝杆菌临床分离株进行链霉素耐药性检测的效率。结果:1、传统比例法药敏试验结果显示,49株实验菌株中16株为链霉素耐药株,33株为链霉素敏感株。2、Rpsl基因DNA测序。结果显示:Rpsl基因只存在一个突变位点,为第43位密码子AAG的突变,突变形式为AAG→AGG,氨基酸由赖氨酸(Lys)变为精氨酸(Arg)。rrs基因DNA测序结果发现:rrs基因共存在5个突变位点,分别为第513位碱基A突变为G、第523位碱基A缺失、第598位碱基A突变为G、第599位碱基A缺失、第612位碱基A缺失,其中第513位碱基突变只存在于链霉素耐药株中,其余4个突变位点在耐药株和敏感株中均存在。即初步认为Rpsl基因第43位密码子的突变及rrs基因第513位碱基的突变与结核分枝杆菌链霉素耐药性有关。3、分析Rpsl基因和rrs基因突变与结核分枝杆菌链霉素耐药性之间的关系,结果显示:16株链霉素耐药株中13株存在Rpsl基因第43位密码子的突变,1株存在rrs基因第513位碱基的突变。以传统的比例法药敏结果为参照,以DNA测序分析Rpsl基因或rrs基因发现Ppsl基因发生第43位密码子或rrs基因第513位碱基突变为判断菌株耐药的标准,DNA测序分析技术对结核分枝杆菌链霉素耐药性检测的敏感性为87.5%,特异性为96.97%。由此可知,初步认为Rpsl基因第43位密码子的突变及rrs基因第513位碱基的突变与结核分枝杆菌链霉素耐药性有关。用DNA测序分析结核分枝杆菌Rpsl基因和rrs基因链霉素耐药相关突变,判断结核杆菌链霉素耐药性具有较好的灵敏度和特异性,耗时短,在链霉素耐药结核病的快速诊断方面具有一定的应用价值。     

成都地区骨科患者伤口金黄色葡萄球菌感染的分子流行病学及耐药性分析

目的:分析四川成都地区骨科伤口感染金黄色葡萄球菌的分子流行病学特征与耐药现状.方法:收集2016年9月至2019年9月成都地区西部战区总医院骨科分离自伤口分泌物的金黄色葡萄球菌,进行耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)鉴定及其SCCmec分型、各菌株MLST分型和spa分型.聚合酶链式反应(PCR)检测20种金黄色葡萄球菌常见毒力因子,并对12种常用抗菌药物进行药敏分析.所有结果同时进行MRSA与甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)菌株间的比较.结果:195株细菌MRSA检出率为21.0%,MRSA以SCCmecⅠ(41.5%)、Ⅳ(36.6%)型为主, MLST型别主要为ST59 (58.5%)和ST630 (17.1%),spa型别主要为t437 (43.9%);MSSA的MLST主要型别为ST188 (22.1%)和ST6 (13.6%),spa型别主要为t189 (19.5%)和t701 (10.4%).MRSA菌株hlb(P0.01)和seb(P0.01)基因携带率较高,而cna(P0.01)和ebpS(P0.05)基因携带率较低,且这一结果与分子分型相关.耐药分析提示某些抗生素可在经验性抗金黄色葡萄球菌中优先选择.结论:成都地区骨科伤口感染金黄色葡萄球菌主要为ST59/ST630-t437-MRSA-SCCmecⅠ/Ⅳ和ST188-t189-MSSA.分子分型结果与毒力因子携带情况密切相关,本研究结果对本地区抗菌策略的制定有一定参考作用.     

InlA/InlB基因的双缺失对单增李斯特菌毒力的影响

为了探讨InlA/InlB对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)毒力的影响,本研究利用同源重组技术在LM△InlA菌株的基础上构建LMInlA/InlB基因双缺失株。通过小白鼠肝脾脑细菌计数、LD50和溶血实验,研究LM在InlA/InlB基因缺失后毒力上的差异。结果显示:LM△InlA/△InlB基因双缺失株与LM菌株相比,双缺失株的LD50升高2个数量级;与LM△InlA、LM△InlB菌株相比,双缺失株的LD50均升高1个数量级;双缺失菌株在小白鼠肝脏、脾脏和脑组织内的载菌量均显著减少(P0.05);但没有改变其溶血特性。结果提示,InlA/InlB基因双缺失后,LM菌株的毒力能够明显减弱,但不改变其溶血特性。     

舍曲林对金黄色葡萄球菌多重耐药性的逆转作用

以多重耐药金黄色葡萄球菌为研究对象,通过测定非抗生素类药物舍曲林与不同抗生素作用的最低抑菌浓度、生长速率、时间-杀菌曲线及实时荧光定量PCR定量检测耐药基因mecA和外排泵基因norA的转录水平,探讨舍曲林对金黄色葡萄球菌多重耐药性的逆转作用及逆转机制.结果显示:当舍曲林质量浓度高于1μg/mL时,对金黄色葡萄球菌有抑制作用;亚抑菌浓度(1/2 MIC)的舍曲林和四环素联用时对金黄色葡萄球菌具有杀菌作用;当舍曲林和四环素、环丙沙星、克林霉素联用时对金黄色葡萄球菌具有协同或相加抑制作用,可使其对3种抗生素的敏感性提高75%以上;低质量浓度的舍曲林可显著降低外排泵基因norA和SCCmec基因盒中mecA基因的表达水平.实验结果表明,舍曲林能通过抑制norA和mecA等耐药基因的表达来调控金黄色葡萄球菌的多重耐药性,通过联合抑菌部分逆转金黄色葡萄球菌对多种抗生素的耐药性.     

PCR-SSCP法用于结核分枝杆菌耐药基因检测的价值探究

探究聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)法用于结核分枝杆菌(MTB)耐药基因检测的价值。收集2017年7月～2018年6月从肺结核患者痰标本提取而来的89株MTB菌株,采用PCR-SSCP法检测katG、rpoB和rpsL耐药基因突变情况,并与药敏试验结果相比较分析。药敏试验结果显示耐药株72株(80.90%),其中耐链霉素(SM)39株(43.82%),耐利福平(RFP)61株(68.54%),耐异烟肼(INH)50株(56.18%),单耐药株11株(15.28%),耐2种药物株25株(34.72%),耐3种药物株36株(50.00%)。PCR-SSCP法检测显示72株耐药株中共检出64株,katG、rpoB和rpsL基因突变率分别为48.31%(43/89)、57.30%(51/89)、34.83%(31/89),单基因突变25株(39.06%),与药敏试验结果比较,符合率为63.64%(7/11),2种基因联合突变17株(26.56%),符合率为56.00%(14/25),3种基因联合突变22株(34.38%),符合率为61.11%(22/36)。PCR-SSCP法用于MTB耐药基因检测价值较高,可与药敏试验结果联合以指导临床用药。     

植物乳杆菌Y42无细胞培养上清抑制单增李斯特菌生物膜形成研究

为研究植物乳杆菌Y42无细胞培养上清对单核细胞增生李斯特菌(LM)生物膜形成的抑制作用,采用微孔酶标板刃天青显色法确定Y42上清的最小抑菌质量浓度(MIC),微孔酶标板结晶紫染色法检测Y42上清对LM生物膜形成的影响,软琼脂法测定Y42上清对LM爬行运动性的影响。结果显示Y42上清最小抑菌质量浓度为60mg/mL;当Y42上清作用质量浓度为MIC的1/32、1/16、 1/8、 1/4、 1/2时,LM的运动圈直径由81.15mm减小为78.31、 75.35、 69.51、 54.91、33.09mm,对LM生物膜形成的抑制率达到32.90%、 30.81%、 40.75%、 39.93% 、12.15%;普通光学显微镜在10×40倍放大倍数下,观察到Y42上清可显著减少LM在盖玻片上形成生物膜的量。Y42无细胞培养上清可通过抑制LM的运行性来抑制其生物膜的形成。     

海鱼中李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌的检测

检测了来自4个商场的20种海鱼,共120个样品,按3管MPN计数法每100 g鱼肉中李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌的平均值分别为396.72和214.78,平均出现率各为80.8%和43.3%,其中4月份的李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌数量远高于其它月份;按季节分,则各数值从大到小依次是春季、秋季、夏季和冬季;检测次数在3次以上的不同种类海鱼中都有李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌的检出,其数量和出现率与海鱼的种类密切相关,其中海鲶中的感染最严重;各个商场的海鱼都有李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌的检出;所分离的单核细胞增生李氏菌的血清型以1型和4型为主。     

一种有效的单核细胞增生李氏菌检测方法

将两种稀释度（10^-4和10^-7）的单核细胞增生李氏菌液加入鳕鱼增菌液中，加入到鳕鱼增菌液的菌数为55．5个／100ml，按最可能数计数法（MPN）能检测到的菌数为110个／100ml，增菌液DFB培养48h后，能检测到的最低浓度为0．055个／ml，说明所采用的DFB、FB两级增菌，EHA、PALCAM平板分离，再结合一系列的菌株鉴定特征，是一种有效的单核细胞增生李氏菌检测方法。     

苦参与环丙沙星合用对铜绿假单胞菌生物膜的影响

采用体外复制铜绿假单胞菌生物膜模型,研究了苦参水煎液与环丙沙星联合应用对铜绿假单胞菌生物膜的影响及协同杀菌效果,结果显示,1/16、1/4最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration MIC)的苦参水煎液可显著增加1/41、/2 MIC的环丙沙星对铜绿假单胞菌生物膜的抑菌活性,两药合用具有明显的协同作用.     

宣威火腿中抗菌肽的分离、纯化及鉴定

为探究干腌火腿中生物活性多肽的抗菌活性及其组成,选取产自中国云南省曲靖地区的宣威火腿为材料,通过缓冲液浸提的方法提取火腿中的多肽成分。以粗提多肽对单增李斯特菌和O157型大肠杆菌的生长抑制情况为指标进行抗菌性评价,同时结合离子交换色谱、尺寸排阻色谱等技术对宣威火腿粗多肽进行分离与纯化,并选取其中抑菌活性较强的组分进行氨基酸序列测定。抑菌实验发现宣威火腿粗多肽具有显著抑制单增李斯特菌和O157型大肠杆菌生长的效果；经过逐级分离纯化得到的各组分具有不同的抑菌活性。其中组分7活性最强,对大肠杆菌和李斯特菌的抑菌率分别为98%和56%。通过Nano-LC-ESI-MS/MS肽序列鉴定,最终得到抑菌活性较强的多肽序列,分别为QYYNGEEHVRFDSDVGEYR、LRNLPNLEVLDLGTNFI、FASFEAQGALANIAVDK。将鉴定得到的3条多肽化学合成后进行抑菌实验发现,合成多肽均具有较好的抑菌效果,对O157型大肠杆菌的生长抑制效果均显著高于单增李斯特菌。研究结果表明宣威火腿中含有抑菌效果的肽类成分,从而为阐释宣威火腿多肽的功能特征提供理论依据。     

铜绿假单胞茵主动外排系统与耐药性关系的研究

铜绿假单胞菌是一种重要的院内感染条件致病菌,常感染癌症患者、烧伤患者等机体免疫力低下的患者,它对多种不同理化性质的药物高度耐药,其主动外排系统在耐药性中起主要作用.主要研究了铜绿假单胞菌主动外排泵的类型、组成及对抗生素耐药性的影响.     

蒙脱石对喹诺酮类抗生素的吸附平衡及动力学特征

以蒙脱石为吸附剂进行水中2种喹诺酮类抗生素(环丙沙星和诺氟沙星)的静态吸附试验,考察初始浓度、pH值和阳离子强度对吸附性能的影响.结果表明,蒙脱石对环丙沙星和诺氟沙星的吸附过程均符合二级反应动力学方程,吸附速率常数分别为0.063和0.024 kg·mg-1·h-1.环丙沙星和诺氟沙星的吸附等温线均能较好地符合Freu...     

Detection of plasmid-mediated IMP-1 metallo-β-lactamase and quinolone resistance determinants in an ertapenem-resistant Enterobacter cloacae isolate

Objective: To investigate the mechanism of carbapenem resistance and the occurrence of plasmid-mediated quinolone resistance determinants qnr and aac(6′)-Ib-cr in a clinical isolate of Enterobacter cloacae. Methods: An ertapenem-resistant E. cloacae ZY106, which was isolated from liquor puris of a female gastric cancer patient in a Chinese hospital, was investigated. Antibiotic susceptibilities were determined by agar dilution method. Conjugation experiments, isoelectric focusing, polymerase chain reaction (PCR), and DNA sequence analyses of plasmid-mediated carbapenemases and quinolone resistance determinants were preformed to confirm the genotype. Outer membrane proteins (OMPs) were examined by urea-sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis (Urea-SDS-PAGE). Results: Minimum inhibitory concentrations (MICs) of imipenem, meropenem, and ertapenem for ZY106 were 2, 4, and 16 μg/ml, respectively. Conjugation studies with Escherichia coli resulted in the transfer of significantly reduced carbapenem susceptibility. ZY106 produced IMP-1 metallo-β-lactamase and CTX-M-3 extended-spectrum β-lactamase, and E. coli transconjugant produced IMP-1. Plasmid-mediated quinolone resistance determinant qnrS1 was detected in ZY106. Transfer of the qnrS1-encoding-plasmid into E. coli by conjugation resulted in intermediate resistance to ciprofloxacin in E. coli transconjugant. Urea-SDS-PAGE analysis of OMPs showed that ZY106 lacked an OMP of approximately 38 kDa. Conclusion: It is the first IMP-1-producing Enterobacteriaceae in China and the first report of a clinical isolate that harbors both blaIMP and qnrS genes as well. The blaIMP-1, blaCTX-M-3, and qnrS1 are encoded at three different plasmids. IMP-1 combined with the loss of an OMP possibly resulted in ertapenem resistance and reduced imipenem and meropenem susceptibility in E. cloacae.     

绵羊和青贮料中单核细胞增多性李氏杆菌的分离鉴定

本文结合国标方法(GB4789.30-94)对健康绵羊和青贮料进行LM的分离，用常规生化试验和分子生物学方法对分离菌进行互映鉴定。从155只绵羊的鼻腔中分离到7株LM，阳性率为4.5％；从47份青贮料中共分离到5株LM，阳性率为10.64％，且从2份霉变青贮料中检出1株LM，霉变青贮料中LM阳性率高达50％。     

基于ActA基因的单核细胞增多性李斯特菌的序列分型研究

根据单核细胞增多性李斯特菌ActA基因序列保守区设计一对引物，对21个菌株进行PCR扩增，得到长度为820bp的片段。PCR产物经过纯化后直接测序，并对其中的506bp进行同源性分析。结果表明单核细胞增多性李斯特菌分离株具有5个明显不同的克隆谱系，每个谱系的同源性均在95％～100％。16个单核细胞增多性李斯特菌奶相关和环境分离株可被分成4个谱系，其中2个谱系（C、D）均为奶相关分离株和成品奶分离株；加工厂地面污水分离株为独立的一个谱系。初步表明，成品奶中污染的单核细胞增多性李斯特菌来自于奶牛场，而非加工环境。