苦荞CCT基因家族生物信息学及表达分析

CCT转录因子在调控植物花期、生长发育及抗非生物胁迫等方面发挥着重要的功能。本研究以拟南芥AtCCT基因家族为参考序列,利用本地BLAST并结合保守结构域等生物信息学工具,筛选出苦荞FtCCT基因家族成员,并对其理化性质、染色体分布、基因结构、系统进化及表达水平进行分析。结果显示:从苦荞中共鉴定出35个FtCCT基因,含1-8个内含子;编码蛋白有117-753个氨基酸残基,等电点为4.96-9.51,均为亲水性蛋白。染色体定位分析表明,这些基因在8条染色体上均有分布。苦荞FtCCT基因家族含有10个保守基序和5个保守结构域,且都含有CCT保守结构域。系统进化分析表明,苦荞的FtCCT基因家族与拟南芥一样可分为3个亚家族,其中CMF亚家族的成员最多。35个FtCCT基因在苦荞根、茎、叶和花中的表达水平具有差异性,在叶和花中具有高表达量的成员较多,只有少数的成员在根和茎中高表达。本研究为进一步解析CCT基因调控苦荞花期及生长发育奠定基础。     

金鱼蛋白磷酸酶2A-B"家族Alpha和Gamma调节基因的cDNA克隆及mRNA表达

以金鱼卵巢组织作为材料,运用RT-PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆得到蛋白磷酸酶2A(PP2A)调节亚基B"家族中γ基因(G5PR)cDNA全序列和α基因(PR130)cDNA部分序列.结果显示γ基因cDNA全长1885 bp,编码一个含457个氨基酸的蛋白质.而α基因cDNA长1781 bp,编码的多肽共含426个氨基酸,系α亚基的部分蛋白序列.它们与已知其他物种对应的B"家族蛋白质均有着很高的同源性.结构预测分析发现,α和γ两条多肽均存在PP2A调节亚基B"家族成员共有的两个EF-HAND结构域.用RT-PCR的方法检测了这两个基因在金鱼不同组织和胚胎发育不同时期的mRNA表达水平.结果表明,γ亚基在金鱼多种组织和各个胚胎发育时期中均有较高表达且表达量比较平均,仅在卵巢和精巢组织中最为丰富.与γ亚基表达模式相比,α亚基表达呈现明显的组织和胚胎发育阶段差异性,在卵巢和肌肉组织中最高,在肾脏和鳃中最低,在原肠胚、神经胚、脑泡分化和体色素等胚胎发育时期的表达较弱,而在其他时期中的表达较强.据此,推测α、γ两调节亚基可能在金鱼不同组织和胚胎发育过程中起着特定的作用.此外,进一步的分析发现,α基因除参与PP2A全酶功能外还可能具有独立的功能.     

茶树NAC基因的鉴定及其在逆境反应中的表达调控分析

利用隐马可夫模型检索和同源比对的方法,从茶树基因组鉴定出108个NAC成员(CsNAC).理化特征、进化关系、基因结构和保守基序分析表明,CsNAC蛋白长度在134～1950个氨基酸之间,分子量介于15.4～222kD,等电点介于4.60～9.91,大部分为亲水性蛋白(除CsNAC97).其中,CsNAC3、8、14、23、32、74、82、90、106蛋白含跨膜结构域.进化分析将CsNAC家族分为18个亚类,ONAC022和NAP亚类成员最多,AtNAC3和OsNAC8亚类成员最少.CsNAC基因启动子区富含响应干旱、低温、盐胁迫以及病原菌侵染的序列元件.据转录组数据分析结果,CsNAC基因家族成员在不同组织和胁迫处理后呈现显著的表达差异.低温和干旱胁迫下的CsNAC共表达网络中,ABA参与调控其关键基因的表达;KEGG分析显示,信号传递、糖代谢、植物与病原菌互作等途径存在显著富集.     

金鱼蛋白磷酸酶2A—B＂家族Alpha和Gamma调节基因的cDNA克隆及mRNA表达

以金鱼卵巢组织作为材料,运用RTPCR和cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆得到蛋白磷酸酶2A（PP2A）调节亚基B＂家族中γ基因（GSPR）cDNA全序列和α基因（PR130）cDNA部分序列．结果显示γ基因cDNA全长1885bp,编码一个含457个氨基酸的蛋白质．而α基因cDNA长1781bp,编码的多肽共含426个氨基酸,系v亚基的部分蛋白序列．它们与已知其他物种对应的B＂家族蛋白质均有着很高的同源性．结构预测分析发现,α和γ两条多肽均存在PP2A调节亚基B＂家族成员共有的两个EFHAND结构域．用RT—PCR的方法检测了这两个基因在金鱼不同组织和胚胎发育不同时期的mRNA表达水平．结果表明,γ亚基在金鱼多种组织和各个胚胎发育时期中均有较高表达且表达量比较平均,仅在卵巢和精巢组织中最为丰富．与γ亚基表达模式相比,α亚基表达呈现明显的组织和胚胎发育阶段差异性,在卵巢和肌肉组织中最高,在肾脏和鳃中最低,在原肠胚、神经胚、脑泡分化和体色素等胚胎发育时期的表达较弱,而在其他时期中的表达较强．据此,推测α、γ两调节亚基可能在金鱼不同组织和胚胎发育过程中起着特定的作用．此外,进一步的分析发现,α基因除参与PP2A全酶功能外还可能具有独立的功能．     

茶树NAC转录因子家族的鉴定及生物信息学分析

利用生物信息学手段对茶树NAC转录因子家族的成员、系统发育、编码蛋白的理化性质和结构以及创伤胁迫处理后的表达进行分析.研究结果显示,茶树NAC转录因子家族包含49个成员,与拟南芥的106个NAC成员构建系统发育进化树,结果显示,茶树缺乏拟南芥NAC家族17个亚族中的第10和第14两个亚族.理化性质和结构分析显示茶树NAC蛋白质绝大多数是亲水氨基酸,二级结构以无规则卷曲为主,三级结构大部分相似.保守基序分析表明,茶树NAC成员共包含7个保守基序,其中基序3、4、2和5、1分别代表NAC结构域的A、B、C和D亚结构域,而基序7表示的是亚结构域E.第15,16和17亚族的大部分成员都缺失了第2和第4两个保守基序,而第15亚族成员具有一个特异的保守基序6.在机械创伤处理条件下表达模式分析表明,第11亚族的CsNAC33和CsNAC34两个成员虽然具有不一样的蛋白结构域组成,但在应对创伤处理时呈现相对一致的表达模式,而16亚族的CsNAC47和CsNAC48两个成员具有一致的蛋白结构域组成,但其表达模式出现分化.上述结果为后续进行茶树NAC基因家族功能的研究提供了理论依据.     

麻疯树(Jatropha curcas)毒蛋白curcin基因家族成员的分离和描述

麻疯树curcin基因家族中4个成员通过PCR扩增被分离．它们都不合有内含子，序列分析表明它们编码Ⅰ型核糖体失活蛋白（Ribosome-Inactivating Proteins，RIPs），证明curcin基因如同大多数RIPs一样由多基因家族编码．四个curcin基因家族成员和另两个已知curcin基因家族成员的开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）的序列比对结果显示curcin基因家族成员至少可分为两个亚类群，亚类群之间的氨基酸序列相似性低于88％．分别将这4个curcin基因家族成员命名为curA2、curA3、curB2、curB3．对四条基因启动子区和ORF生物信息学分析推测CurB2、curB3可能是被真菌及逆境诱导的curcin基因家族成员全长，而curA2、curA3可能是麻疯树胚乳贮存的curcin基因家族成员全长．Southern杂交结果显示，麻疯树基因组中至少有3个以上curcin基因家族成员．     

黑莓果实发育过程中蔗糖磷酸合成酶基因的表达分析

【目的】蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase, SPS)是调控植物蔗糖代谢合成的关键酶,在植物光合产物的积累与分配方面有重要作用。本研究旨在探讨黑莓3个SPS基因的系统发育关系、编码的蛋白特性、在不同发育时期、不同组织中的时空表达特性,并分析其与黑莓发育的关系。【方法】以黑莓栽培品种‘宝森’(‘Boysenberry’)为试材,从中克隆和鉴定了3个 SPS 基因家族成员,利用生物信息学和荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)等方法对3个黑莓SPS 基因RuSPS1、RuSPS2和RuSPS3的氨基酸序列、保守作用元件、编码的蛋白特性、蛋白结构及进化关系进行分析,并对这3个基因在黑莓中的时空表达情况与酶活性进行了相关性分析。【结果】多重氨基酸序列比对显示,黑莓SPS蛋白具有植物SPS家族特有的2个保守蛋白结构域及2个相对保守的蛋白磷酸位点;系统进化分析表明,RuSPS基因分为A、B两个亚族,其中RuSPS1和RuSPS3为A亚族成员,RuSPS2为B亚族成员;保守作用元件分析表明, 除RuSPS2含基本的蛋白保守元件外, RuSPS1和RuSPS3都存在不同程度的片段缺失;序列分析和比较揭示了黑莓SPS基因与其他家族的不同特征。qRT-PCR分析显示,3个RuSPS基因在黑莓各个组织器官中均有表达,其中RuSPS1在叶片和果实中表达量较高,在花中的表达量较低;RuSPS2在发育成熟的果实中有大量的表达,在其他器官中表达量较低;RuSPS3在各器官中的表达均较高,说明 SPS基因表达具有明显的组织特异性,3个RuSPS基因都随着果实发育进程在果实和叶片中表现了表达增加的趋势。果实和叶片中SPS酶活性的变化与RuSPS基因表达水平一致。相关分析表明,叶片中SPS活性与RuSPS2显著正相关(P<0.05),果实中SPS活性与RuSPS1显著负相关(P<0.05)。【结论】3个RuSPS基因与黑莓果实发育过程中的蔗糖合成与代谢关系密切,均参与了黑莓的生长发育调控,其中叶片中SPS活性的变化一定程度上是由RuSPS2调控,果实中SPS活性的变化则是由RuSPS1调控。     

非生物胁迫下小麦TaGAPCp1基因启动子的功能分析

探究质体形式的GAPCp (Plastidial glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)基因启动子响应干旱、盐和外源ABA等非生物胁迫的机理.首先从中国春小麦中克隆得到TaGAPCp1基因上游1 985 bp的核苷酸序列,经Plant CARE数据库分析表明,该启动子含有众多防御和逆境响应元件(defense and stress-responsive ele-ments,DSREs),激素响应元件(hormone-responsive elements,HREs)和光响应元件(light-responsive ele-ments,LREs).从小麦数据库下载Ta GAPCp亚家族基因启动子序列,序列对比分析表明,该亚家族成员启动子上功能元件种类相近但数量相差较大.构建含TaGAPCp1基因启动子的表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草并进行ABA (100μmol·L~(-1))、PEG8000 (20%)、Na Cl (250 mmol·L~(-1))和4℃低温处理,组织化学染色显示TaGAPCp1基因启动子能驱动GUS基因的表达但活性明显低于Ca MV35S,GUS活性分析显示TaGAPCp1基因启动子能响应非生物胁迫.通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥,经潮霉素和羧苄青霉素筛选及叶片PCR检测,最终获得稳定遗传的转基因拟南芥20株,并得知转基因拟南芥中的GUS基因能被干旱胁迫显著诱导表达.     

柳树NAC基因的克隆与表达模式分析

【目的】研究柳树重要抗逆转录因子基因家族,为揭示柳树抗逆分子机制提供理论依据。【方法】以‘苏柳2345’的转录组测序数据为基础,克隆了柳树NAC家族,并分析其序列结构、组织表达特异性以及不同胁迫条件下的表达模式。【结果】克隆的两个柳树NAC转录因子基因分别命名为SlNAC1和SlNAC2。生物信息学分析表明:SlNAC1序列全长为1 126 bp,编码产物含343个氨基酸残基,为稳定的亲水蛋白,定位于细胞核;SlNAC2序列全长为1 139 bp,编码产物含291个氨基酸残基,为稳定的亲水蛋白,定位于叶绿体。两个基因均具有典型的NAM结构域及A、B、C、D、E 5个亚结构域,还包括共同的LPPG、YPNG 和DEE保守基序及NAC抑制结构域。系统进化树分析显示, SlNAC1基因与木薯亲缘关系最近,SlNAC2基因与茄子亲缘关系最近。定量PCR结果显示SlNAC1和SlNAC2均在叶片表达,根中没有表达,为叶片特异性转录因子。定量PCR结果显示SlNAC1基因在脱落酸(ABA)和赤霉素(GA)处理24 h后显著上调,SlNAC2基因在聚乙二醇(PEG)、ABA和GA胁迫后显著上调。【结论】柳树SlNAC1基因在非生物胁迫下表达较为稳定,受ABA和GA胁迫诱导;SlNAC2受干旱、ABA和GA胁迫诱导,受影响明显高于SlNAC1,不受乙烯剂(ETH)胁迫影响。推测SlNAC1和SlNAC2参与GA、ABA信号传导,可能不参与ETH的信号途径。     

拟南芥AtWNK9基因的定位及表达分析

AtWNK9为拟南芥WNK（With no lysine kinase）激酶家族成员，其功能尚不清楚.采用生物信息学和生物学实验相结合的方法，对AtWNK9蛋白结构、亚细胞定位、启动子元件、基因表达模式进行了分析.研究发现，AtWNK9定位在细胞核中；该基因在拟南芥根中高效表达，其表达受ABA，NaCl、葡萄糖、热和冷等非生物胁迫处理强烈诱导.结果表明，AtWNK9为非生物胁迫反应相关基因，并可能参与根的生长发育.     

苦荞籽中黄曲霉毒素B1质量分数检测方法的研究

利用AFB1免疫亲和柱对苦荞籽进行前处理,使用高效液相色谱仪测定AFBl的质量浓度,建立了一种检测苦荞籽中AFB1质量分数的检测方法。采用该方法测定了凉山州不同区域苦荞籽中AFB1的质量分数。结果表明:新建方法的检测限为0.2 ng/ ml,精密度良好,添加回收率平均为85.87%。利用此法测定了凉山州不同区域的苦荞籽,在凉山州不同地区收集的苦荞籽中均未检出AFB1。     

Expression pattern of GASA,downstream genes of DELLA,in Arabidopsis

Separation and functional research of related components involved in gibberellins （GAs） signaling are important to clarify the mechanism of GA functioning. Research on the downstream components of DELLA, the key factor of the GA signaling pathway, is limited at present. GASA （GA-Stimulated in Arabidopsis） family contains 15 genes usually regulated by GA in Arabidopsis thaliana. All GASA proteins have a cleavable signal peptide in N terminus and a conserved GASA domain including 12 cysteines in C terminus. RT-PCR analysis revealed that the expression of GASA4 and GASA6 were down-regulated, but GASA 1 and GASA9 were up-regulated in the DELLA mutants, gai-t6 and rga-24, as well as the double mutant, consisting with the results that GASA4 and GASA6 were induced, but GASA1 and GASA9 were inhibited by exogenous GA3. In addition, the expression patterns of other GASA genes were regulated by GA and ABA, separately or cooperatively. Most of GASA genes were expressed in roots, stems, leaves, flowers and developing siliques. GUS gene driven by the promoters of GASA6, GASA7, GASA8, GASA9, GASAIO, GASA11 and GASA12were used as reporters and it was found that all GASA genes expressed in the growing and differentiating organs and abscission zones, suggesting the role of these genes in cell growth and differentiation. This study provided an important basis for functional study of the GASA gene family in the GA and ABA signaling pathway.     

Cloning of 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase （NCED） gene encoding a key enzyme during abscisic acid （ABA） biosynthesis and ABA-regulated ethylene production in detached young persimmon calyx

Unlike the typical climacteric fruits, persimmons （Diospyros kaki Thunb.） produce higher levels of ethylene when they are detached from trees at a younger stage. In order to obtain detailed information on the role of abscisic acid （ABA） in ripening, we cloned the DKNCED1, DKACS2, and DKACO1 genes from the calyx. Water loss was first noted in the calyx lobe, and DKNCED1 was highly expressed 1 d after the fruits were detached, coinciding with an increase in the ABA content. Then, the DKACS2 and DKACO1 genes were expressed after some delay. In the calyx, the ABA peak was observed 2 d after the fruits were harvested, and this peak preceded the ethylene peak observed on day 3. The fruit firmness rapidly decreased on day 4, and the fruits softened completely 6 d after they were harvested. The increases in the expressions of ABA, ethylene, and the genes in the calyxes occurred earlier than the corresponding increases in the pulp, although the 3 increases occurred on different days. Exogenous ABA treatment increased ABA concentration, induced expression of both ACS and ACO, and promoted ethylene synthesis and young-fruit softening; by contrast, treatment with NDGA inhibited the gene expressions and ethylene synthesis and delayed young-fruit softening. These results indicate that ethylene biosynthesis in the detached young persimmon fruits is initially triggered by ABA, which is induced by water loss in the calyx, through the induction of DKACS2 and DKACO1 expressions. The ethylene produced in the calyx subsequently diffuses into the pulp tissue, where it induces autocatalytic ethylene biosynthesis, resulting in an abrupt increase in ethylene production.     

基因组学在苦荞研究中的应用

苦荞是一种传统的、短季节的、药食同源的假谷物作物,具有重要的保健和营养功能。重点阐述了基因组学研究方法在苦荞基础遗传学、重要的农艺性状和生物活性产物相关的生物学基础研究中的应用。     

蛋白磷酸酶2C（PP2C）的表达、 纯化与催化活性

从小鼠肌肉组织中提取了总RNA, 经RT PCR, 扩增出蛋白磷酸酶2C（PP2C）基因, 并构建了pUCm T载体. 经核酸序列分析证明PP2C基因序列正确后, 将pUCm T中的PP2C基因插入pET28a载体中, 构建了表达载体pET28a PP2C, 并转化到E.coli BL21(DE3)进行表达. 经测定, 该菌株表达目的蛋白PP2C的最适条件为： 诱导物IPTG的终浓度为0.8 mmol/L, 37 ℃, 诱导时间为20 h. 在此条件下, PP2C实现了高 效表达, 表达的PP2C蛋白约占菌体总蛋白的18.2%, 其中在裂解上清液、 沉淀中分别占总蛋白的7.1%和11.1%. 经SDS PAGE分析, 表达产物分子量约为42 000. 应用Ni NTA柱实现了可溶性PP2C的纯化, 收率达805%, 纯化的PP2C比活力达34.5 U/mg.     

苦荞饮食对自发性高血压大鼠肠道菌群的影响

[目的]研究苦荞饮食对自发性高血压大鼠肠道菌群的影响。[方法]将10只自发性高血压大鼠(Spontaneously Hypertensive Rats,SHR)随机分成常规饮食对照组和苦荞饮食组,对照SHR(SHR-C)正常饮食,苦荞饮食组SHR(SHR-TBW)全荞麦饮食,第3、6和12周无菌收集SHR粪便样本,16S rDNA V3-V4区扩增,Hiseq高通量测序后进行比对和分类。[结果]SHR-C和SHR-TBW大鼠肠道菌群结构及组成多样性有显著性的差异。随时间厚壁菌门/拟杆菌门(Firmicutes/Bacteriodetes,F/B)值从0.22增加到1.89;未知不可分类的菌群从16.52%增加到50.65%;Allobaculum、丁酸弧菌属、毛螺菌属和变形菌菌属是SHR-TBW饮食的优势菌群。[结论]苦荞饮食能重构高血压肠道菌群,饮食干预可有效改善血压。     

拟南芥CARK3与RCAR12相互作用的研究

植物激素ABA是植物应对非生物胁迫的响应因子,广泛参与了植物生长发育的调控.ABA结合其受体后抑制PP2Cs的磷酸酶活性,释放SnRK2s,从而启动ABA信号转导途径.本文采用酵母双杂交系统,GST-pull down技术研究蛋白质激酶CARK3与ABA受体RCAR12在体外的相互作用,结果显示CARK3和RCAR12共转入酵母后,在三缺平板上能够正常生长;经His-Tag抗体检测,CARK3与RCAR12出现明显且单一的条带.同时,采用双分子荧光互补实验研究CARK3与RCAR12在体内的相互作用,结果显示CARK3与RCAR12共转化烟草后能观察到较强的荧光.体内外实验表明,CARK3与RCAR12存在明显的相互作用,CARK3可能通过直接磷酸化ABA受体RCAR12来调控ABA信号途径的生理应答.     

甘蓝型油菜BnbHLH92基因的克隆与表达分析

为研究甘蓝型油菜bHLH转录因子的功能,采用同源克隆技术从甘蓝型油菜中克隆了5个BnbHLH92基因全长cDNA序列,分别命名为BnbHLH92-1、BnbHLH92-2、BnbHLH92-3、BnbHLH92-4、BnbHLH92-5,其编码区长度分别为738,657,684,741,717bp.qRT-PCR实验表明,除BnbHLH92-1外,其它的BnbHLH92基因主要在抽薹期和花期的根中表达,BnbHLH92-1主要在抽薹期和花期的根以及二叶一心期的叶中表达.非生物胁迫显著影响BnbHLH92基因的表达,使其表达量升高.低温胁迫下,BnbHLH92基因分别在胁迫后4、6、6、6、6 h表达量达最高.高温胁迫下,5个BnbHLH92基因分别在胁迫后2、6、6、8、4 h表达量达最高.盐胁迫下,BnbHLH92基因分别在胁迫后6、6、24、24、24 h表达量达最高.在ABA诱导下BnbHLH92基因表达量也有不同程度的增加,分析发现BnbHLH92基因的启动子序列上存在ABA响应元件(ABRE).