HPV23 L1蛋白的表达、纯化及活性鉴定

为了制备人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)23亚型的L1蛋白,结合大肠杆菌密码子偏好性,经密码子优化合成HPV23的L1蛋白编码区序列,并将其分别克隆至原核表达载体,成功构建了4种原核表达载体pET28a-23L1、pET30a-23L1、pET32a-23L1和pESUMO-23L1,随...     

exendin-4表达载体构建及其在大肠杆菌中分泌表达

目的:研究新型抗糖尿病药物exendin-4的分子作用机制,为exendin-4的大规模生产奠定基础.方法:采用重叠PCR法扩增出exendin-4的完整序列,并将其克隆至表达载体pET22b上,得到重组质粒pET-Exn4.重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,超声破碎表达产物,Tricine-SDS-PAGE分析exendin-4表达.结果:PCR、酶切鉴定和测序结果证明成功构建了重组表达载体pET-Exn4,Tricine-SDS-PAGE结果表明ex-endin-4基因在大肠杆菌中获得了分泌表达.结论:成功构建了exendin-4的重组表达载体并在大肠杆菌中实现分泌表达.     

小鼠肥大细胞蛋白酶4的原核表达和多克隆抗体制备

文章构建小鼠肥大细胞蛋白酶4（mMCP-4）原核表达体系,获得原核表达蛋白,并制备兔抗mMCP-4多克隆抗体,提取小鼠脾细胞总 RNA ,运用 RT-PCR技术获得目的基因 mMCP-4,构建重组原核表达载体pET28a-mMCP-4,将其转化到大肠杆菌BL21中诱导表达。mMCP-4融合蛋白经Ni亲和层析法纯化后,作为抗原免疫兔子获得mMCP-4多克隆抗体。采用ELISA法测抗体效价,western blot检测抗体特异性。结果表明,构建重组表达质粒pET28a-mMCP-4,经大规模原核表达获得大量mMCP-4融合蛋白,制备的兔抗血清效价达1∶128000,并表现出较好特异性。研究结果为进一步研究mMCP-4生物学功能奠定了基础。     

伤寒沙门菌Mig-14蛋白部分密码子优化后的表达及多克隆抗体制备

通过原核表达Mig-14蛋白,制备相应多克隆抗体,用于后续Mig-14分子功能研究,为探寻Mig-14拮抗PB分子机制奠定基础.经密码子偏爱性分析显示mig-14基因含有8%的稀有密码子,综合考虑密码子偏好性、GC含量、限制性酶切位点等影响因素对密码子进行优化,重新合成mig-14基因,PCR获得周质空间部分,克隆至表达载体pET22b(+),并转入大肠埃希菌JM109中表达,KCl染色后切胶纯化的蛋白作为抗原免疫家兔,制备多克隆抗体.Mig-14蛋白多克隆抗体的制备为后续免疫共沉淀研究Mig-14的作用蛋白奠定了基础.     

番茄抗白粉病必需基因ShGSTU1原核表达条件优化

采用RT-PCR技术从番茄中扩增谷光甘肽转移酶基因ShGSTU1,构建该基因的原核表达载体pET28aShGSTU1和pET32a-ShGSTU1,并对重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达条件进行优化,主要对诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度进行分析.结果表明:重组蛋白在表达载体pET28a中的最佳表达条件为1mmol/L IPTG,37℃诱导4h;在表达载体pET32a中的最佳表达条件为1mmol/L IPTG,30℃诱导5h.     

米根霉L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

文章以米根霉基因组DNA为模板,根据已公布的米根酶L-乳酸脱氢酶基因(ldnL)序列设计引物,PCR扩增得到含有ldnL的DNA片段;PCR产物T/A克隆后再双酶切,将ldnL片段连接到大肠杆菌表达载体pET17b,得到重组表达质粒pET17b-ldnL;pET17b-ldnL转化大肠杆菌BL21(DE3),摇瓶培养诱导表达后的菌体经SDS-PAGE电泳分析,结果表明克隆的ldnL基因在大肠杆菌中实现表达。     

截短型HCV NS5B RNA聚合酶在大肠杆菌中表达纯化及鉴定

为构建HCV截短型ns5bΔ21基因的原核表达质粒;在大肠杆菌中表达NS5B蛋白并纯化,制备其抗体。运用软件设计引物,以BB7复制子为模板PCR扩增ns5bΔ21基因;克隆入原核表达载体pRSETA。将重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21转化BL21大肠杆菌,并诱导表达、可溶性分析及纯化;用纯化的NS5B蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。结果酶切鉴定和序列测定表明成功的构建了重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21;其经IPTG诱导后行SDS-PAGE可见新生表达条带,Western-blot证实了其特异性和抗原性良好;利用镍离子亲和层析和电洗脱方法获得了纯化NS5B蛋白;用纯化蛋白免疫小鼠制备出了多价抗血清。说明表达和纯化的截短型HCV NS5B RNA聚合酶可用于下一步筛选单链抗体。     

人Sox2基因的克隆表达和纯化

应用RT-PCR方法从人胚胎十细胞中扩增出Sox2基因,构建pET28b-Sox2表达载体.用IPTG诱导转化pET28b-Sox2表达载体的大肠杆菌BL21(DE3).并优化表达条件为37℃ 1PTG0.8 mmol/L诱导4 h.以Ni-NTA亲和层析法纯化Sox2重组蛋白,对变性蛋白进行柱上和透析复性,复性后蛋白得率为0.7 mg/g湿菌重.     

降钙素受体药物靶点区域的表达、复性及鉴定

本实验截取了人降钙素受体N端胞外结构域涉及药物靶点的第20~160位氨基酸残基区域对应的编码序列,根据大肠杆菌偏爱密码子优化后,人工合成相应的基因,运用分子克隆技术将所合成的基因克隆到pET22b(+)载体,重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中原核表达.结果表明,Nt-CTR蛋白质以包涵体形式表达,所得包涵体蛋白质通过高效的复性方法,最终得到了大量纯化的可溶性Nt-CTR蛋白质.融合蛋白质通过Western-Blot鉴定表达正确.本研究为CTR的结构研究和CTR相关疾病的药物筛选提供了基础.     

结核分枝杆菌H37Rv异柠檬酸裂解酶基因的克隆表达及活性

以结核分枝杆菌H₃₇Rv基因为模板, PCR反应扩增该菌株的异柠檬酸裂解酶基因（ICL）, 将其克隆入原核表达载体pET28b中, 并将pET28b I
CL转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达. 结果表明, ICL蛋白的最佳诱导表达条件为: 温度20 ℃, IPTG终浓度为025 mmol/L, 诱导表达4 h, 在此条件下 ICL实现了高效表达, 以镍离子螯合型琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化ICL蛋白, 纯化程度较高. 酶学性质鉴定表明, 实验获得了具有生物学活性的重组蛋白, 重组ICL的比活力为24 μmol/(mg·min).     

重组人碱性成纤维细胞生长因子类似物在大肠杆菌中的分泌表达研究

用带有大肠杆菌外膜蛋白信号肽序列的重组分泌型表达载体pSE-hbFGF，在大肠杆菌BL21中分泌表达了rhbFGF类似物。SDS－PAGE、免疫印迹结果表明，表达产物分泌到了细胞周质和培养液中，用间接ELISA测定出培养上清中的rhbFGF类似物为24.5mg/L，周质中为36.5mg/L菌液（O.D600nm=10)。同时探讨了发酵培养中影响rhbFGF表达的几个关键因素，如诱导时期的选择、诱导时间的长短、培养基的选择及诱导剂的浓度等。     

抗癌胚抗原纳米抗体与人Fc融合蛋白在毕赤酵母和HEK293细胞中的表达、纯化和性质比较

通过对不同系统表达的肿瘤标记物癌胚抗原(CEA)纳米抗体与人Fc融合蛋白(11C12-Fc)的表达、纯化及抗体性质等的比较分析,比较不同表达系统的特点及其对融合抗体性质的影响;从而为CEA融合纳米抗体在体内检测方面的应用提供理论依据。构建两种11C12-Fc表达系统(Pichia pastoris和HEK293)相应的表达载体和菌株,分别进行诱导表达、分离纯化;并对其纯化产物的生物学活性等进行初步研究。成功构建了毕赤酵母、HEK293细胞两种CEA纳米抗体融合蛋白(11C12-Fc)表达系统并实现11C12-Fc的胞外分泌表达;通过protein A柱及阴离子交换层析纯化,获得了较高纯度和浓度的11C12-Fc样品;通过突变糖基化位点的方式有效去除了毕赤酵母表达11C12的过度糖基化作用;并且其抗体亲和力较突变前未发生明显改变,与HEK293细胞表达的11C12-Fc都表现出较高的亲和力。毕赤酵母和HEK293系统均能够表达具有较高生物活性的11C12-Fc,后续的科研或生产可根据实际需要和条件来合理选择表达系统。为后续的纳米抗体融合蛋白规模化生产、体内诊断与靶向治疗的应用提供了理论和技术参考。     

Overexpression and export of Vibrio anguillarum metalloprotease in Escherichia coli

Vibrio anguillarum metalloprotease, an extracellular zinc metalloprotease involved in the virulence mechanism of Vibrio anguillarum, is synthesized from the empA gene as a 611-residue precursor and naturally secreted via Sec secretion pathway in Vibrio anguillarum. In this study, heterologous expression of the empA gene encoding metalloprotease and export of the recombinant metalloprotease in Escherichia coli were examined. The empA gene was subcloned into pBAD24 with arabinose promoter and sequenced. The sequence encoded a polypeptide (611 amino acids) consisting of four domains: a signal peptide, an N-terminal propeptide, a mature region and a C-terminal propeptide. The empA gene inserted in plasmid pBAD24 was overexpressed in TOP10 strain of E. coli after arabinose induction. The 36kDa polypeptide of the recombinant metalloprotease as the mature protease was further confirmed by SDS-PAGE and immunoblotting. It was found that recombinant metalloprotease with the EmpA activity and antigenicity was exported into the periplasm of Escherichia coli cells via Sec translocation pathway, whereas it was secreted into extracellular environments in V. anguillarum. The results imply that the expression, export and processing mechanism of the protein in E. coli are similar to those in V. anguillarum.     

柑橘香橙素生成途径关键酶黄烷酮-3-羟化酶特性分析及原核表达

香橙素是柑橘类黄酮的重要组成,黄烷酮-3-羟化酶是香橙素生成途径中的关键作用酶。对黄烷酮-3-羟化酶的特点进行总结与分析并在大肠杆菌中进行表达。首先从NCBI数据库筛选了来自柑橘、陆地棉、玉米、水母雪莲和欧芹的5种f3h,对其进行理化性质、蛋白质二三级结构、序列比对等生物信息学分析并以大肠杆菌为宿主进行表达。发现5种来源的f3h,其基因开放阅读框为1032~1119bp,编码343~372个氨基酸,蛋白分子质量为38.89~41.45kDa,理论等电点在5.43~5.96,且不同物种F3H的理化性质、结构域和蛋白质结构也有一定的相似性。通过构建大肠杆菌表达体系发现:黄烷酮-3-羟化酶均能进行原核表达,除去来源于水母雪莲的F3H未检测到香橙素的生成,其余4种F3H均能将柚皮素转化为香橙素且产物生成量不同,其中ZmF3H生成量最高达20.12mg/L。     

丙型肝炎病毒(HCV)截短型E2的原核表达和蛋白纯化

对丙型肝炎病毒(HCV)截短型包膜糖蛋白E2-661基因进行原核表达和纯化.利用PCR法扩增出661 bp的截短型HCV E2区基因片段,并将测序正确的E2-661基因克隆入原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行分析和鉴定.结果表明目的蛋白分子量约为35 kDa,主要以包涵体形式大量存在.Western-blot结果显示目的蛋白与抗His标签单抗及HCV阳性血清均具有良好的反应原性.并通过镍离子亲和层析方法获得纯化的重组蛋白.以上结果为HCV E2功能的进一步研究奠定了基础.     

6个氨基酸小C肽人胰岛素原类似物基因的构建和表达

用片段置换法，从在Ｃ肽两端具有酶切位点的双突人胰岛素原因中，将Ｃ肽基因替换成含Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ６个氨基酸小Ｃ肽基因。将这个小Ｃ肽岛素原类似物基因重组到具有Ｔａｃ启动子的质粒中，并与部分牛凝乳酶原基因融合，在Ｅ．ｃｏｌｉ中得到了高效表达。表达的ＢＣ＇Ａ融合蛋白占菌体总蛋白的１６％。表达产物以包含体形式存在，经ＣＮＢｒ裂解及磺酸，再经复性后，具有对胰岛素的放射免疫活性。     

重组大肠杆菌生产rhG-CSF发酵工艺的研究

在5L发酵罐中，研究了溶解氧(DO)、诱导时机、接种量等因素对重组大肠杆菌DH5α／pBV220生产rhG-CSF的影响．结果表明，在ω(D0)≥50％，茵体光密度D600≈4．50，42℃诱导表达4h的条件下rhG-CSF的茵体干重可达6．61g／L，表达量为38．1％．     

甜菜坏死黄脉病毒新疆分离物外壳蛋白基因的原核表达载体和植物表达载体的构建

将克隆入ｐＧＥＭ７ｚｆ（＋）的甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）新疆分离物外壳蛋白（ＣＰ）基因的ｃＤＮＡ的ｐＧＥＢ３，用ＸｂａＩ切下，Ｋｌｅｎｏｗ补平，再用ＢａｍＨＩ切下ｃＤＮＡ片段。用ＮｄｅＩ切开原核表达载体ｐＪＷ２，用Ｋｌｅｎｏｗ补平，再用ＢａｍＨＩ切去小片段。将该ｃＤＮＡ与ｐＪＷ２大片段用Ｔ４连接酶连接，构建了ＢＮＹＶＶＣＰ基因的表达载体ｐＪＷＢ４，转化到大肠杆菌ＤＨ５α。经培养和高温诱导，ｐＪＷＢ４成功地表达出了ＢＮＹＶＶ的外壳蛋白。将ｐＧＥＢ３和ｐＢＩ１２１用Ｘｂａｌ和ＢａｍＨＩ酶切Ｔ４连接酶连接，构建了ＢＹＶＶＣＰ基因的植物表达载体，转化到ＤＨ５α，筛选出正向连结的阳性克隆ｐＢＩＢ３，转化入农杆菌ＬＢＡ４４０４（ｐＡＬ４４０４），经用ＰＣＲ扩增和γ３２Ｐ标记的探针杂交约证实为阳性克隆。往甜菜植株中转化工作正在进行中。     

结核分枝杆菌H37Ra FadD3基因克隆与表达研究

为探索FadD3在结核分枝杆菌胆固醇分解代谢中的作用,从结核分枝杆菌H37Ra的全基因组中克隆了FadD3基因,并在大肠杆菌BL21中表达.根据NCBI公布的结核分枝杆菌全基因组序列设计一对引物,PCR扩增FadD3基因.PCR扩增产物与克隆载体pGEM3Zf(+)进行拼接,得到重组基因FadD3-pGEM3Zf(+),再转化到大肠杆菌DH5ɑ得到克隆.PCR检测阳性克隆,再与表达载体pYUB28b拼接,得到重组质粒FadD3-pYUB28b.阳性重组质粒亚克隆到大肠杆菌BL21宿主菌进行自体诱导表达.经过表型筛选及鉴定分析,已成功构建了重组表达质粒FadD3-pYUB28b.SDS-PAGE和Western blotting证实,重组基因FadD3-pYUB28b在大肠杆菌BL21中有表达产物.实验结果表明,以pYUB28b为表达载体,FadD3重组基因在大肠杆菌表达体系于温度分别为18,28 ℃有包涵体形式的表达蛋白,在37 ℃无表达产物.