核盘菌交配型基因mat1-1敲除载体的构建及转化

利用根癌农杆菌介导真菌遗传转化方法对核盘菌的交配型基因mat1-1进行基因同源重组的敲除对比实验,获得了缺失mat1-1基因的转化菌株.先利用PCR方法获得mat1-1基因的左右两侧片段,将测序正确的两个侧翼片段分别重组到农杆菌转化载体PBI-G3C中,并将新霉素抗性标记引入农杆菌转化载体PBI-G3C中,构建成农杆菌介导转化核盘菌的打靶载体ΔPBI-G3CN-mat1-1,再将ΔPBI-G3CN-mat1-1质粒转化至根癌农杆菌EHA105中.利用核盘菌菌丝进行转化,将得到的转化菌株,利用PCR方法进行验证,证实有敲除菌株存在.通过对敲除菌株进行生理表型的测定发现,缺失mat1-1基因的敲除菌株其生长速度与野生核盘菌菌株相比无明显差异,但敲除菌株不能产生菌核与子囊盘.     

同源重组法敲除酵母snoRNA基因的初步探讨

以3个粟酒裂殖酵母核仁小RNA为对象,通过同源重组法构建相应的基因缺失株,并对影响同源重组效率的因素进行分析.结果显示:载体骨架的切除可以显著提高同源重组效率;增加两侧同源片段的长度也能提高同源重组效率;另外,利用粟酒裂殖酵母野生型单倍体菌株进行snoRNA 基因敲除是可行的.     

重组葡萄糖脱氢酶的表达及辅酶再生应用研究

为解决异源表达酮还原酶域EryKR1的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(pET28a-eryKR1)催化环己酮还原时消耗的氢供体NADPH再生的问题,构建了克隆枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因gdh的重组菌E.coli BL21(pET28a-gdh),其中的gdh基因经Nucleotide BLAST功能分析显示与枯草芽孢杆菌9902的gdh基因序列(登录号为EF626962.1)的一致性达到100%。SDS-PAGE检测显示该重组菌经IPTG诱导后可以高效表达出葡萄糖脱氢酶(GDH),其表达量占全菌可溶性蛋白质的64%。GDH粗酶液的比酶活为137.90U/mg。通过气相色谱检测添加了E.coli BL21(pET28a-gdh)的E.coli BL21(pET28a-eryKR1)环己酮还原反应体系中的环己醇含量,结果显示加入重组GDH的双重组菌耦合反应体系中环己醇的产率为82.21%,是未添加GDH的反应体系对应值的3.23倍,表明重组GDH可以为EryKR1还原环己酮系统解决辅酶再生问题。     

产甘油重组大肠杆菌的构建及其耐高渗透压性能的测定

克隆了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 中的3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油酯酶基因,通过融合PCR构建了双基因共表达载体,将酵母细胞内应答渗透压变化的甘油合成途径引入大肠杆菌（Escherichia coli）。以葡萄糖为底物对重组大肠杆菌进行摇瓶发酵培养,该重组菌的甘油产量为1g/L。渗透压胁迫测试证明该重组菌的耐渗透压性能较出发菌株有明显提高。     

Tup1基因缺失对酿酒酵母耐高糖性状的影响

研究Tup1基因对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞耐高糖性状的影响。利用Cre/loxP系统对单倍体细胞中的转录因子Tup1基因进行敲除,单倍体细胞复倍后研究基因缺失菌株的性状变化。结果表明,Tup1基因缺失虽然减弱了菌株的呼吸能力,但却增强了菌株在高浓度葡萄糖培养基中的生长和发酵能力。Tup1基因可能通过调节酿酒酵母细胞呼吸强度来调控细胞的高糖应激反应。     

表达结核杆菌抗原的重组酿酒酵母免疫小鼠研究

近年来研究显示全细胞重组酿酒酵母疫苗具有治疗性疫苗潜能.为了研究重组酿酒酵母结核病候选疫苗的免疫效果,将IFN-γ基因与结核杆菌抗原蛋白Ag85B、ESAT6的基因融合,利用pHR酿酒酵母表达系统和同源重组方法,成功构建了以酿酒酵母Y16为宿主的表达融合蛋白IF-γ-Ag85B和IF-γ-ESAT6-Ag85B的重组酿...     

酿酒酵母PDEs基因缺失对蓝莓果酒抗氧化及挥发性物质的影响

比较野生型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)与环核苷酸磷酸二酯酶PDE1和PDE2基因敲除的突变菌株(PDE1/Δpde1、Δpde1/Δpde1、PDE2/Δpde2和Δpde2/Δpde2)对蓝莓果酒发酵特性及品质的影响。测定了蓝莓果酒发酵醪液总糖、酒精度、总酸、pH值、DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、总酚、总黄酮和花青素等指标。采用顶空固相微萃取技术(HS-SPME)与气相色谱-质谱联用(GC-MS)相结合的方法对蓝莓果酒挥发性物质进行比较。探究了PDE1和PDE2基因对酿酒酵母的发酵特性的影响。结果表明:Δpde1/Δpde1菌株能有效提高蓝莓果酒发酵速度,酿造的蓝莓果酒活性物质含量最高,抗氧化能力最强;PDE1和PDE2基因的缺失会降低发酵蓝莓果酒的抗氧化能力,且敲除PDE2的酿酒酵母酿造的蓝莓果酒的抗氧化能力比敲除PDE1的更弱,而Δpde1/Δpde1突变菌株酿造的果酒中香气成分含量较多。     

石家庄市猪链球菌分离鉴定及快速诊断方法研究

从石家庄市地区各县市猪场送检的疑似病例中分离得到72株猪源链球菌,选择其中具有一定区域、特定致病类型的代表性菌株18株,进行了病原分离和分群鉴定,并与标准株进行了对比试验.初步证实本地区流行菌株仍以兰氏分群C群及D群居多,以C群链球菌为主占50%,但D群有上升趋势占33.3%,此外还出现1株G群占5.6%,另有2株未定群的猪链球菌,其分布无明显的地域性.为检测石家庄地区SS分离株的毒力因子,选取了猪链球菌8种主要毒力因子基因,设计并合成8对引物,用PCR方法进行检测.结果显示:已知21株SS2菌株中90.5%表现为cps2/gdh+/gapdh+/ef+/mrp+/sly+/fbps+/orf2+;送检的疑似SS2的病例中,仅有10%左右表现为cps2/gdh+/gapdh+/ef+/mrp+/sly+/fbps+/orf2+.可见,石家庄地区的猪链球菌与国内其他地区SS2分离株的基因型不同,表明石家庄目前SS2的主要流行菌株是具有部分毒力因子的弱毒菌株.     

酿酒酵母α-半乳糖苷酶基因重组菌株的表达分析

PCR扩增里氏木霉(Trichoderma reesei)2个α-半乳糖苷酶基因agl2和agl3,将其分别与表达载体pY-ES2连接,电转化酿酒酵母(Saccharom yces cerevisiae)INVScl菌株.从重组菌株提取载体进行单酶切凝胶电泳检测,证实agl2和agl3分别在重组菌株AGL2和AGLs表达.以葡萄糖和棉子糖为碳源培养菌株,2株重组菌的生长速率均显著高于原始菌株,提前8h菌数达到最大,其中以AGL3的生长速率提高较为明显,重组还使菌株在液体培养基由原来的部分絮凝转变为完全游离状.2株重组菌株均不能利用蜜二糖为碳源生长.     

酿酒酵母YBR019C基因缺失突变的分析

【目的】研究目的基因YBR019C缺失对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株糖代谢和乙醇发酵的影响。【方法】以酿酒酵母野生菌NF1002为出发菌株,选择2号染色体上的基因YBR019C为目的基因,以质粒pUG6和pUG66为模板进行PCR,构建带有Cre/loxP系统的酿酒酵母YBR019C基因敲除组件,并转化酿酒酵母NF1002,利用筛选标记Kan r和Ble r与YBR019C基因进行同源重组,筛选YBR019C双倍体缺陷型菌株。利用蔗糖和甘蔗糖蜜为碳源,对突变菌进行发酵特性的研究。【结果】成功获得YBR019C双倍体缺陷型菌株NFybr。碳源同化实验表明,突变株和野生菌均能利用葡萄糖和蔗糖,不能利用乳糖和木糖;但相比野生菌,突变株利用棉子糖和麦芽糖的能力有所下降,而且完全不能利用半乳糖。蔗糖发酵实验表明:突变株NF-ybr与野生菌株相比,在发酵终点乙醇浓度提高10.7%,发酵周期有所延长。按目前甘蔗糖蜜乙醇生产的发酵工艺,突变株在30℃发酵72h的醪液乙醇含量为12.52%,低于野生菌的13.89%。【结论】YBR019C基因的缺失影响了菌株对糖份的利用,导致乙醇发酵能力不及野生菌。本研究为菌株高效快捷的基因改造提供了参考。