利用拮抗细菌防治棉花黄萎病

本项目研究中,从植物根围、根表和植物内部分离到1345株细菌,并测定了他们对棉花黄萎病菌的抑菌性。118株细菌表现较强的抑菌性,抑菌率≥50％。其中25个菌株的抑菌率≥。70％,93个菌株的抑菌率为50％～70％。另外从棉花黄萎菌的微菌核际分离到57株细菌,其中30株细菌能显著地抑制棉花黄萎菌微菌核的菌落生长(5个菌株完全抑制微菌核的萌发和生长,15菌株的抑菌率为40％～97％)。这些拮抗菌的培养滤液也能抑制棉花黄萎菌的生长。室内盆栽实验证明,应用拮抗菌处理棉花种子,有10个拮抗细菌能极显著地防治棉花黄萎病,其中4个菌株(ICB-18、NCD-2、CS-25和CS--27)的防病效果极好,防病效果为72．3％～81．4％,3个菌株(C-94、C-28和NCD-25)的防病效果为55．7％～61．9％。1999～2000年的2年田间小区试验中。NCD-2菌株对棉花黄萎病防治效果显著,并且显著优于国外商品化生防制剂TF,该菌株连续两年的防病效果平均为85．4％;另外4个菌株(ICB-18、CS-25、C-94和C-28)亦能显著防治棉花黄萎病,但防病效果与国外商品化生防制剂TF相当。在田间示范中,应用生防细菌NCD-2制剂拌种后直接播种技术防治棉花黄萎病,防病效果达到51．2％。同时应用生防细菌NCD-2制剂拌种育苗移栽技术防治棉花黄萎病,防病效果达到52．6％并且增产22．85％。本文同时测定了NCD-2对主要大田作物的安全性,证明其对小麦、玉米、棉花、马铃薯、黄瓜、茄子和大豆等7种作物没有致病性,并且对这些作物的出苗、生长和发育没有不良影响。     

棉花黄萎病拮抗菌的筛选及抑菌谱测定

采用稀释平板法,从健康棉花根部土壤中分离得到细菌、放线菌及真菌分离物1723个。通过室内平板筛选获得25株对棉花黄萎病菌具有强拮抗作用的细菌菌株。温室盆栽防治黄萎病实验结果表明：3株拮抗细菌在防治棉花黄萎病中表现较好的防病效果,其中868菌株的防治效果为67.3%,3个拮抗细菌对病原真菌棉花枯萎菌、立枯丝核菌、番茄叶霉病菌、大豆黑斑病菌、大麦条纹病菌、大豆疫霉有较强的抑制作用,抑菌谱较广。     

短小芽孢杆菌Y106对棉花黄萎病的防治作用

短小芽孢杆菌Y106(Bacillus pumilus Y106)是从土壤中筛选分离得到的一株对黄萎病菌具有拮抗作用的细菌菌株.平板对峙实验结果显示,Y106和黄萎病菌共同培养至10d时,处理组的黄萎病菌菌落直径为3.82cm,比对照组减小了38.7%,说明Y106菌株对棉花黄萎病菌有较强的拮抗作用;在液体PDA中共同培养Y106菌和带有绿色荧光蛋白基因标记的棉花黄萎病菌Vd-gfp77,随着Y106菌浓度增加,Vd-gfp77菌液在发射光波长为530nm处的荧光吸收值从217.43下降至97.49,说明黄萎病菌液浓度减小,黄萎病菌的生长受到抑制.土壤中拮抗实验结果显示,对照组长出菌落数目约为79个,处理组长出菌落数目随着Y106浓度的增加而减少至44个,比对照组菌落数目减少44.3%,表明在土壤中Y106菌株对棉花黄萎病菌的增殖有抑制作用.进一步的实验表明,Y106菌株可使盆栽棉花黄萎病发病率从76.47%下降至52.94%.因此,短小芽孢杆菌Y106对棉花黄萎病菌有较强的抑制作用,可用于棉花黄萎病的生物防治.     

放线菌LG-9发酵液对棉花黄萎病菌的抑菌活性及防效测定

为了研究放线菌LG-9发酵液对棉花黄萎病菌的抑菌作用,本文使用菌丝生长速率法、孢子萌发抑制法测定了放线菌LG-9发酵液对黄萎病菌菌丝生长、产孢量、孢子萌发和抗氧化功能的影响。结果表明,拮抗菌LG-9发酵粗提液5倍稀释液对棉花黄萎菌菌落生长抑制率最大,为76. 77%,产孢抑制率为84. 35%,孢子萌发抑制率为80. 00%;发酵粗提液5倍稀释液处理诱导棉花黄萎病菌抗氧化相关酶酶活降低和丙二醛(MDA)含量上升。田间试验结果表明,拮抗菌LG-9对棉花黄萎病的防治效果显著,培养滤液3次灌根处理,对棉花黄萎病的田间防效达到49. 07%。     

棉花黄萎病生防细菌NCD-2抑菌物质提取研究

应用微生物控制植物病害是非常有效的方法。枯草芽孢杆菌是最著名的产生抗生作用的拮抗细菌。本文所使用的防治棉花黄萎病生防细菌NCD-2是枯草芽孢杆菌菌株,对16种植物病原真菌具有抑制作用,并且对棉花黄萎病具有较高的田间防病效果。通过发酵培养、有机溶剂萃取和盐析和透析提取了该菌株的胞外分泌产物,经抑菌作用测定证明该菌株分泌的有效抑菌成分为耐热蛋白。     

6株拮抗细菌对致病疫霉抑制作用的比较

比较在前期获得的明显抑制致病疫霉菌丝生长的6株细菌的抑菌性能及其防病潜力,为开发生防制剂防治马铃薯晚疫病提供依据.采用对峙培养法和打孔法测定6株细菌活体、菌液和无菌体发酵液对病菌菌丝生长的抑制作用,利用块茎切片法评价拮抗菌菌液对晚疫病的离体防治效果.结果表明,6株菌的菌液对菌丝生长的抑制作用均明显优于活体和无菌体发酵液,抑菌带宽度均在27mm以上,且均可引起菌丝体畸变,其中以WL2菌株的抑菌作用最强,活体、菌液和发酵液的抑菌带宽均在26mm以上,致畸作用也最强;此外,6株菌的菌液在离体块茎切片上的防病效果也以WL2菌液处理最好,病情指数最低(13.7),相对保护率最高(80.5%).这表明菌株WL2比其他5个菌株在防治马铃薯晚疫病方面有更大应用潜力.     

加工番茄促生拮抗菌的筛选及其抑菌效果测定

针对新疆加工番茄病害发生普遍且为害严重的问题,进行了促生拮抗菌的分离筛选及其促生和抑菌效果的研究.从新疆各加工番茄主产区采集健康加工番茄植株根际土壤164份,共分离纯化得到细菌及放线菌分离物1029个,经室内一次筛选和二次筛选得到54株对番茄立枯丝核菌具有强拮抗作用的细菌菌株.促生试验表明,这54个细菌菌株中有6株细菌能提早加工番茄种子的发芽时间和提高加工番茄的发芽率,并对发芽后植株的株高、株鲜重和地上部干重的提高都具有明显的促进作用.盆栽接菌试验表明,有5株拮抗菌防治立枯病的效果较好,其中SL-23菌株的防治效果为46.96%,优于五氯硝基苯拌种的防治效果.5株拮抗细菌都对病原真菌立枯丝核病菌（Rhizoctonia solani）、早疫病菌（Alternaria solani）、枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici）、疫霉病菌（Phytophthora capsici）、菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）和病原细菌番茄细菌性疮痂病菌（Xanthomonas vesicatoria）有较强的抑制生长的作用,抑菌谱较为广泛.     

土壤拮抗细菌对茄病镰孢菌的抑制作用和防治研究

:从云南、贵州、河北、吉林、黑龙江、北京、天津等地采集土样 2 8个 ,采用常规平板稀释法分离获得的细菌菌株 4 14个。以茄病镰孢菌为主要靶标菌 ,对分离菌株进行抑菌测定 ,筛选出强拮抗菌13株 ,并用附着在茄子、番茄等上 9种病原菌对其进行拮抗作用测定 ,发现所获拮抗细菌具有广谱抗性。筛选出具广谱拮抗作用的生防菌株 B0 73、B153,其发酵液中活菌在温室内人工接种条件下进行温室接种防病试验 ,对茄病镰孢菌防治效果分别达 71.1%和 6 1.8% ,并兼具治疗作用     

线虫共生菌对水稻纹枯病和稻瘟病的抑菌活性

用菌块移植法初步测定了38株昆虫病原线虫共生细菌对水稻纹枯病菌和稻瘟病菌的抑菌活性,从中选出9株对纹枯病菌,7株对稻瘟病菌有较强抑菌作用的菌株,再用稀释平板法分别测定了这2组菌株的发酵液对纹枯病菌和稻瘟病菌菌丝生长、菌核或分生孢子萌发的抑制活性,筛选出对纹枯病菌和稻瘟病菌都有较强抑菌活性的YNa111和YNd173等菌株.YNa111菌株的发酵液对纹枯病菌的生长有强烈的抑菌活性,稀释40倍的发酵液24 h的抑菌率为100%,160倍时为82%.菌株YNd173的发酵液对稻瘟病菌的生长有较强的抑菌活性,稀释5倍和10倍时的抑制率分别为88%和76%.     

大丽轮枝菌拮抗芽孢菌株的分离、鉴定及两株菌抑菌特性研究

从新疆和硕连作棉田根际土壤中分离到146株芽孢细菌.29株对大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)具有拮抗作用的菌株中有9株拮抗性极强.经鉴定,9株拮抗性极强的菌株中有2株属短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),7株与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)相近.抑菌特性实验表明:J-02和J-15的抑菌高峰分别出现在衰亡期和稳定期,对pH的耐受范围分别为5~9和7~9;J-02的热稳定性较好,J-15对温度较敏感,但100℃处理后仍有抑菌活性;J-02能够抑制大丽轮枝菌芽管伸长形成菌丝,J-15可导致大丽轮枝菌菌丝畸形,失去产孢能力.盆栽实验表明,J-02和J-15这2株拮抗菌对棉花黄萎病有明显防治作用.综合结果表明J-02和J-15均有作为棉花黄萎病生防菌的潜能.     

棉花变黑轮枝菌的鉴定及致病性的测定

自湖北棉区有黄萎病症状的棉叶中分离到能产生厚垣孢子的褐色菌,取2个供试菌株V12和V24,经形态特征、生物学特性和ITS分析,鉴定为变黑轮枝菌(V.nigrescens).对其致病性进行测定,发现其对棉花致病力极弱.推测该菌是一种植物衰老期或植物生长势呈下降趋势时的病原菌,常与大丽轮枝菌混生.     

棉花黄萎病菌遗传转化载体构建和农杆菌转化

载体构建是建立真菌遗传转化体系的基础。本研究以pCAMBIA1305.1双元载体为基本骨架,构建棉花黄萎病菌遗传转化T-DNA质粒双元载体,通过限制性内切酶酶切、补平、连接以及去磷酸化等措施将pCAMBIA1305.1上Hygromycin抗性基因的CaMV 35S启动子替换成构巢曲霉的trpC启动子。经大肠杆菌转化后对转化子进行酶切验证,并将新构建的载体1305-3分别转入农杆菌菌株LBA4404和EHA105。为农杆菌介导的黄萎病菌遗传转化体系的建立和优化提供了存在于不同农杆菌菌株中的供试载体。     

Logistic方程在蜡蚧轮枝菌液体发酵中的应用

分析了蜡蚧轮枝菌Verticillium lecanii(Zimmermann)Viegas在19L发酵罐液体发酵培养过程中的菌体生长和产孢量增长变化趋势，提出可以应用Logistic方程模拟该增长变化趋势，运用实验数据计算出方程的参数，建立了蜡蚧轮枝菌液体分批发酵中生物量和产孢量的动态变化模型。仿真计算结果表明：Logistic模型预测值与实验数据拟合度较好，能很好的反映蜡蚧轮枝菌液体分批发酵的过程。     

新疆棉花黄萎病菌营养体亲和性的研究

从新疆各地的棉花黄萎病株上共分离到30 个野生型棉花黄萎病菌菌株,以及陕西省植保所提供T9 、VD8 、安阳菌株及泾阳菌株,经在WAC 培养基上诱发培养,34 个菌株共获得431 个突变体,其中114 个为NitM,占26 .45 % ,317 个为Nitl,占73 .55 % 。经营养体亲和性配对测试,32 个菌株可分为2 个营养亲合群(VCGs) ,T9 与VD8 属于亲合群Ⅰ(VCG1) ,其余30 个菌株属于亲合群Ⅱ(VCG2) ,落叶型菌株与非落叶型菌株分属于不同的营养亲合群,新疆棉花黄萎病菌基本属于亲和群Ⅱ(VCG2) 。     

棉花黄萎病菌VdSgel基因的克隆与序列分析

为了探索棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae Kleb）是否存在转录调节因子VdSgel，本研究以新疆棉花黄萎病菌强致病力菌株V592为材料，通过设计引物，对棉花黄萎病菌进行了VdSgel基因的克隆和测序。获得VdSgel基因全序列为1533bp，不含内含子，只编码1个含510个氨基酸的蛋白（VdSgel）。VdSgel的N端含有真菌特异的TOS9结构域（COG5037）和Gti1—Pac2基因家族结构域（Pfam09729）。此外N端还含有一个推测的蛋白激酶磷酸化位点（^66KRWTDG^71）及一个核定位信号（^94PGEKKR^100）。系统进化分析结果表明，VdSgel与番茄枯萎菌、荚膜组织胞浆菌、小麦赤霉菌和葡萄孢菌的同源调节因子进化关系较近。本研究为进一步研究VdSgel的功能奠定了基础。     

有机改良剂对棉花黄萎病的防治效果及其对根际微生物区系的影响

用7种不同有机改良剂处理土壤,在盆栽和田问小区试验条件下分别研究了它们对棉花黄萎病的防治效果。调查结果表明：几丁质(蟹壳粉)处理对棉花黄萎病的防治效果最好,在盆栽和小区试验中病情指数分别比对照降低了72．21％和62．26％;豆秸粉和绿肥(新鲜油菜叶腐熟物)也有较好的防效,在盆栽和小区试验中均达到50％以上。田问小区的试验结果与盆栽试验结果基本一致。对根际微生物区系分析结果表明,不同有机改良剂处理土壤后根际微生物群体数量显著增加,种类增多,区系组成更加复杂,而且对棉花黄萎病菌具有抑制作用的真菌和放线菌比率也高于对照。     

棉花黄萎病毒素在早期抗病性检测中的应用研究

用棉花黄萎病（Ｖ．ｄａｈｌｉａｅ）毒素,处理不同抗性品种二叶期幼苗,结果表明,黄萎病毒素对棉花幼苗有明显致萎作用,其萎蔫指数与田间病情指数呈显著正相关,同时发现黄萎病毒素对种子发芽也有明显的抑制作用     

棉花黄萎病菌VdSge1基因的克隆与序列分析

为了探索棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae Kleb)是否存在转录调节因子Vd Sge1,本研究以新疆棉花黄萎病菌强致病力菌株V592为材料,通过设计引物,对棉花黄萎病菌进行了Vd Sge1基因的克隆和测序。获得Vd Sge1基因全序列为1533 bp,不含内含子,只编码1个含510个氨基酸的蛋白(Vd Sge1)。Vd Sge1的N端含有真菌特异的TOS9结构域(COG5037)和Gti1_Pac2基因家族结构域(Pfam09729)。此外N端还含有一个推测的蛋白激酶磷酸化位点(66KRWTDG71)及一个核定位信号(94PPGEKKR100)。系统进化分析结果表明,Vd Sge1与番茄枯萎菌、荚膜组织胞浆菌、小麦赤霉菌和葡萄孢菌的同源调节因子进化关系较近。本研究为进一步研究Vd Sge1的功能奠定了基础。