SEA对PML-RARα多肽体外诱导外周血单个核细胞TCRζ链表达的作用

目的:了解金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)联合PML-RARα融合多肽体外诱导正常人外周血T细胞活化TCRζ链基因表达情况.方法:利用T细胞液体培养法分别与正常人外周血淋巴细胞加入PML-RARα融合多肽、SEA和SEA联合PML-RARα多肽诱导培养T细胞,其中SEA刺激包括培养初始或培养第5天加入SEA两组(PS、PSI),并设空白对照组(不加多肽及SEA).分别收集各组培养20 d后细胞提取mRNA并合成cDNA,采用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和相对定量检测TCRζ链在不同组别T淋巴细胞中的表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,根据相对定量公式:2<'-△△Ct>分析TCRζ链表达差异.结果:与空白组相比,联合诱导组在培养初始加入SEA及第5天加入SEA的培养T细胞中TCRζ链表达上升,而单独SEA诱导组的TCRζ链表达下降.结论:超抗原SEA联合PML-RAR α多肽体外诱导T细胞可使TCRζ链基因表达水平升高,有望为研制急性早幼粒细胞白血病疫苗提供新的切入点.     

SEA联合K562细胞体外诱导正常人脐带血单核细胞TCRζ链表达的作用

目的:研究金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)对K562细胞体外诱导脐血T细胞活化TCRζ链基因表达情况。方法:常规分离4例脐带血单核细胞,分别与抗CD3单克隆抗体、单纯K562细胞、SEA以及SEA联合K562细胞共培养,诱导T细胞活化增殖,并设空白对照组。刺激培养48 h后收集各组细胞提取mRNA并合成cD-NA,采用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR和相对定量检测TCRζ链在不同组别T淋巴细胞中的表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,根据相对定量公式:2-ΔΔCt计算TCRζ链表达差异倍数。结果:抗CD3单抗组、K562细胞组、SEA组、SEA联合K562细胞组诱导培养T细胞中TCRζ链表达差异倍数分别是(4.52±0.96)、(1.65±0.26)、(1.43±0.44)、(3.41±0.30),表明各组均有活化T细胞的作用,但各组TCRζ链表达水平有差异,其中SEA联合k562细胞组的T细胞ζ链基因表达均明显高于单纯k562组及单纯SEA组(P0.01)。结论:超抗原SEA有助于增强K562细胞体外诱导T细胞活化作用。     

再生障碍性贫血和真性红细胞增多症患者TCRζ链基因表达情况

目的:析再生障碍性贫血(AA)和真性红细胞增多症(PV)患者外周血T细胞中TCR ζ链基因表达水平,从而了解患者T细胞活化过程的相关变化情况.方法:利用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR,相对定量检测25例AA患者、12例PV患者及30例正常人的外周血单个核细胞(PBMCs)的TCR ζ链基因表达情况,β2微球蛋白基因(β2M)为内参照,根据相对定量公式:2- △△Ct计算患者与正常人TCR ζ链基因表达差异倍数.结果:与正常人相比,TCR ζ链基因表达水平有40% AA(10例)和41.7% PV(5例)患者呈表达上调,其它的(60?和58.3%PV患者)则呈表达下调情况,TCR ζ链基因表达水平的变化与患者年龄无相关性.结论:AA和PV患者可能存在T细胞活化相关的信号通路紊乱的情况,TCR ζ链基因表达模式改变的意义仍需进一步研究.     

CML细胞抗原相关TCR Vα13／Vβ21和Vα18／Vβ21寡克隆T细胞及其CDR3序列特点

目的:分析慢性粒细胞白血病(CML)病人的克隆性增殖T细胞及其CDR3序列的特点。方法:利用RT-PCR和基因扫描分析1例CML患者外周血单个核细胞中的TCR Vα和Vβ基因的互补决定区(CDR3),了解各Vα和Vβ亚家族的限制性表达情况和T细胞克隆性增殖特点,寡克隆的PCR产物再进行序列分析。结果:该病人外周血T细胞表达18个TCR Vα和12个TCR Vβ亚家族,其中Vα13、Vα18、Vβ1和Vβ21亚家族呈寡克隆性。CDR3序列分析获得3个TCR克隆基因序列,分别为Vα13NJα49、Vα18NJα50和Vβ21NDβNJβ2.7。结论:获得1例CML病人外周血克隆性增殖αβ T细胞的3个TCR基因CDR3序列,提示病人可能存在与CML细胞抗原相关的Vα13/Vβ21或Vα18/Vβ21T细胞克隆。     

RNA干扰下调PPP2R5C对T-ALL TCR Vβ亚家族分布和克隆增殖的影响

目的:基于前期利用靶向PPP2R5C基因的小干扰RNA(PPP2R5C-siRNA)抑制白血病T细胞增殖的结果,进一步了解PPP2R5C-siRNA对T-ALL样本中TCR Vβ亚家族基因谱系及其克隆性增殖情况.方法:利用PPP2R5C-siRNA转染2例初发未治疗T-ALL病人外周血单个核细胞(PBMC),设无关序列对照组(SC)和空白对照组(NC);利用实时定量PCR检测PPP2R5C基因表达水平.利用RT-PCR扩增各组样本中24个TCR Vβ亚家族基因的互补决定区3(CDR3);阳性产物进一步经基因扫描分析CDR3长度,了解其Vβ亚家族T细胞克隆性.结果:PPP2R5C-siRNA处理后明显下调PBMC中PPP2R5C基因表达水平.2例初发T-ALL外周血中分别可检测到10和17个Vβ亚家族,多数Vβ亚家族T细胞为多克隆性,病例1中Vβ9和Vβ17为寡克隆性,而病例2中,Vβ14和Vβ16呈寡克隆性;经过RNA干扰处理后,TCR Vβ亚家族表达率降低,仅检测到3和4个Vβ亚家族,分别为Vβ2,Vβ3,Vβ16和Vβ17.其中2个Vβ家族的寡克隆性模式发生改变,病例1中,Vβ17转为多克隆,而病例2中,Vβ16也转变为多克隆.结论:RNA干扰下调白血病T细胞PPP2R5C基因表达抑制细胞增殖时,在一定程度上影响TCR Vβ亚家族T细胞增殖和克隆模式变化,对正常T细胞功能可能存在一定影响.     

淋巴细胞白血病患者CD3基因表达模式的变化

目的:了解T细胞受体信号传导分子CD3γδεζ基因在T和B细胞白血病病人中的表达特点.方法:采用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和相对定量分析法检测32例淋巴细胞肿瘤病人:急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)12例、慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)9例、急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)11例及10例健康人外周血...     

原发性血小板减少性紫癜患者胸腺近期输出功能状态

目的:了解原发性血小板减少性紫瘢(ITP)患者胸腺近期输出功能的状态,评价其T细胞潜能.方法:采用实时定量PCR(TaqMan)方法检测15例ITP患者外周血单个核细胞(PBMCs)中T细胞受体重排删除DNA环(TRECs)的含量,17例正常人作为对照.结果:正常人外周血中每1 000个PBMCs中TRECs拷贝数为(3.76±3.42),ITP患者TRECs水平变化较大[每1000个PBMCs中TRECs拷贝数为(2.60±2.99)],4例病人未能检测到TRECs,病人平均TRECs水平与正常人的差异没有显著性(P＞0.05),女性病人TRECs水平略高于男性(P=0.499),但无统计学意义.结论:多数ITP患者外周血初始T细胞水平和胸腺近期输出功能保持正常水平.     

Elf-1基因在急性髓细胞性白血病中的表达情况

目的:建立实时定量PCR检测Elf-1基因表达水平的方法,了解急性髓细胞性白血病(AML)患者外周血Elf-1基因表达水平.方法:采用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和相对定量分析法检测33例AML患者:M2型17例、M3型6例、M5型10例和20例健康人外周血的单核细胞的Elf-1表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,采用公式2~(-△Ct)×100%计算Elf-1基因表达水平.结果:AML组Elf-1表达水平(13.518±19.197)%明显高于健康对照组(2.044±1.321)%(P<0.01),不同AML亚型之间Elf-1的表达水平没有显著性差异(P=0.52),但各亚型AML的Elf-1的表达水平均与健康对照组比较均有显著性差异(P<0.01).结论:建立SYBR Green Ⅰ荧光实时定量PCR分析外周血Elf-1表达水平的方法,检测急性髓细胞性白血病Elf-1基因高表达情况.     

葫芦素E对人外周血单个核细胞体外活化及细胞因子表达的影响

目的:分析葫芦素E(Cuc E)对二丁酸佛波醇酯(PDB)和离子霉素(Ion)刺激的人外周血单个核细胞(PBMC)活化及促炎因子表达的影响,探讨其潜在的抗炎效应及作用机制.方法:利用流式细胞术分析人外周血PBMC活化抗原CD69和CD25表达,用流式微球陈列检测白介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和干扰素γ(IFN-γ)表达的变化.结果:Cuc E能明显抑制PDB和Ion刺激引起的CD3+T细胞早期活化标志分子CD69和中期活化分子CD25的表达;同时,Cuc E以剂量依赖方式抑制PDB和Ion诱导的IL-2、TNF-α和IFN-γ的表达.结论:Cuc E对人外周血CD3+T细胞的活化具有明显抑制作用,同时减少炎症相关细胞因子的表达,提示其通过对适应性免疫的调控发挥抗炎效应.     

感染日本血吸虫小鼠CD4~+,CD8~+T细胞凋亡相关基因转录水平

目的:探讨日本血吸虫感染过程中.宿主CD4~+和CD8~+T细胞凋亡的相关基因TGF—β(转化生长因子—β.Transforming growth factor—β)在转录水平上的变化.方法:用地高辛标记的探针作原位杂交.观察促凋亡基因TGF—β在CD4~+和CD8~+细胞的TGF—βmRNA的表达随感染时间的延长而升高,感染后第10周起CD4~+T细胞TGF—βmRNA的表达明显高于CD8~+T细胞,差异有显著性意义.结论:在日本血吸虫感染过程中,CD4~+细胞凋亡比率超过CD8~+细胞.提示CD4~+和CD8~+细胞t比值下降与TGF—β基因的活化有关.     

淋巴瘤白血病患者TCR Vβ亚家族T细胞的分布及其克隆性

目的:了解B细胞淋巴瘤白血病(LL)患者TCR Vβ亚家族T细胞的分布及其克隆性.方法:利用RT-PCR分别扩增3例LL患者外周血单个核细胞的 TC R Vβ 24个亚家族基因的CDR3,以了解患者各Vβ亚家族的利用情况,然后将阳性的PCR产物进一步经荧光素标记和基因扫描分析产物的CDR3长度,了解T细胞克隆性.结果:患者中仅存在2～6个Vβ亚家族T细胞.基因扫描分析显示,2例患者外周血中的Vβ1 、Vβ 3或Vβ4亚家族出现克隆性增殖T细胞. 结论:LL患者外周血存在倾斜性分布和克隆性增殖的Vβ亚家族T细胞,这可能是机体T细胞受白血病细胞相关抗原的刺激作用而引起机体产生相应的特异性抗白血病的免疫反应.     

非小细胞肺癌中转化生长因子βⅠ型受体基因的缺陷表达

转化生长因子β(TGF-β)信号转导通路的紊乱可使细胞逃避TGF-β介导的生长抑制效应,从而导致多种肿瘤的发生.本研究探讨了转化生长因子βⅠ型受体(TGFβRⅠ)在非小细胞肺癌(NSCLC)发生中的作用.采用免疫组化进行TGFβRⅠ基因的表达分析:采用单链构象多态性(SSCP)分析TGFβRⅠ基因结构的变异.结果发现37.2%NSCLC中TGFβRⅠ的表达下降,表明TGFβRⅠ在NSCLC发生中起着重要的作用.同时在TGFβRⅠ基因的第7号内含子中发现了一个单核苷酸多态性(SNP),该SNP与TGFβRⅠ的表达下降无显著关系(P>0.05).     

T细胞CD3ζ3'-UTR区域突变类型的特点

目的:分析CD3ζ3'-UTR区域的突变/SNP的类型情况,深入了解中国汉族健康人CD3ζ3'-UTR的突变/SNP特点.方法:利用RT-PCR,T载体克隆以及核苷酸测序等技术分析20例健康人外周血单个核细胞中CD3ζ3'-UTR突变/SNP突变类型等情况.结果:20例健康人外周血单个核细胞中CD3ζ3'-UTR区域共检出21种突变/SNP.CD3ζ3'-UTR区域的腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶均发生不同频率的突变,依次为37.36%,16.48%,40.66%和5.50%.腺嘌呤的突变频率显著高于胸腺嘧啶和胞嘧啶(P均为0.00);鸟嘌呤的突变频率显著高于胸腺嘧啶和胞嘧啶(P均为0.00);胸腺嘧啶的突变频率显著高于胞嘧啶(P=0.02).CD3ζ3'-UTR区域缺失、转换和颠换突变检出频率依次为21.98%,35.16%和42.86%,缺失突变的频率显著低于转换和置换突变(P=0.05,P=0.02),转换/颠换比值为0.82.结论:首次报道中国健康人外周血单个核细胞中CD3ζ3'-UTR区域突变类型特点,TC转换突变在中国汉族健康人CD3ζ3'-UTR区域的高频出现影响转换/颠换比.     

体外激活CD8~+T细胞表达CD69及γ-干扰素的研究

目的 :研究正常人外周血CD8+T细胞体外活化表达早期活化标志CD69分子及γ -干扰素 (IFN -γ)的规律 方法 :以佛波醇酯 (PDB) +离子霉素 (Ion)或植物血凝素 (PHA)体外活化人外周血单个核细胞 (PBMC) ,利用流式细胞术分析CD8+T细胞表达CD69及IFN -γ的情况 结果 :PDB +Ion和PHA活化CD8+T细胞CD69的表达率 ( % )分别为 78.4± 5.3和 2 7.4± 4 .4 ( x±s) ,明显高于对照组 ( 1.5± 0 .6) (P <0 .0 5) 当monensin存在时以PDB +Ion及PHA刺激 4h后IFN -γ阳性CD8+T细胞的百分比分别为 2 9.7± 6.5及 5.9± 1.8,均明显高于对照组 ( 0 .7± 0 .2 ) (P <0 .0 5) ,其中前者表达率高于后者 (P <0 .0 5) 结论 :PDB +Ion和PHA均可刺激CD8+T细胞表达CD69以及IFN -γ ,前者的刺激作用明显强于后者     

NLRP3、AIM2、IFI16炎症小体在慢性乙型病毒性肝炎患者PBMC中的活化水平和与HBV感染的相关性分析

目的:探讨乙肝病毒(HBV)是否激活了慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者外周血单个核细胞(PBMCs)内核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)和干扰素诱导蛋白16(IFI16)炎症小体,分析HBV影响炎症小体活化的可能机制.方法:收集感染内科临床确诊CHB患者35例.同时选取健康住院医师28例为对照.以常规淋巴细胞分层液密度梯度离心法分离健康对照组和CHB患者组静脉血得到PBMCs,采用逆转录、实时荧光定量PCR检测CHB患者组和健康对照组PBMCs NLRP3、AIM2、IFI16、凋亡相关的斑点样蛋白(ASC)、半胱天冬酶1(CASP1)、IL-1β、IL-18 mRNA表达水平,ELISA法检测两组血清中IL-1β蛋白分泌水平.结果:CHB患者组和健康对照组PBMCs ASC、NLRP3、AIM2、IL-1β、IL-18 mRNA表达水平及两组血清IL-1β蛋白分泌水平无显著性差异.CHB患者组PBMCs IFI16、CASP1 mRNA表达水平显著上调,且IFI16 mRNA表达水平与患者血清HBV DNA载量显著正相关(r=0.699 8,P0.01).结论:慢性HBV感染未导致CHB患者PBMCs NLRP3、AIM2炎症小体的活化;尽管HBV DNA可能诱导了CHB患者IFI16炎症小体的高表达,但通过抑制pro-caspase-1的活化、IL-1β的表达,HBV阻断了IFI16炎症小体的活化效应.     

T-bet和Gata-3基因在脐带血中的表达特点

目的:了解转录因子T-bet和Gata-3基因在脐带血中的表达情况.方法:采用实时定量RT-PCR检测21例脐带血单个核细胞(CBMC)中转录因子T-bet和Gata-3基因的表达水平,21例健康成人外周血单个核细胞(PBMC)作为对照.结果:T-bet基因和Gata-3基因在CBMC和PBMC中均存在一定表达,Gata-3基因在CBMC中的表达水平(0.43±0.35)%与PBMC(0.42±0.27)%相比无明显差异(P=0.925),而T-bet基因在CBMC中的表达水平(0.47±0.48)%则明显低于健康成人组(2.12±1.48)%(P=0.000).结论:CBMC中T-bet基因表达低下,可能与脐带血移植后GVHD发生率低下以及发生程度较轻有关.     

肿瘤患者外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞TCR Vβ基因克隆化分析

目的探讨肿瘤患者T细胞抗原受体(TCR)Vβ基因克隆化改变特征.方法应用多引物巢式PCR技术检测肿瘤患者外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞TCR Vβ基因22个亚家族的克隆化改变,与正常对照组比较,分析肿瘤患者TCR单克隆改变的特点.结果 CD8+T细胞TCRVβ基因亚家族单克隆改变的数量多于CD4+T细胞;肿瘤患者的CD4+T细胞中,只有Vβ2,Vβ7和Vβ8三个亚家族单克隆改变高于正常对照组(P0.01或P0.05),其他Vβ亚家族单克隆改变与正常对照组无明显差异.肿瘤患者的CD8+T细胞中,有14个Vβ亚家族单克隆改变均高于正常对照组(P0.01或P0.05);4组肿瘤患者中,CD4+T细胞和CD8+T细胞的TCR Vβ7亚家族的单克隆改变均明显高于正常对照组(P0.01或P0.05).结论通过检测TCR Vβ基因克隆化改变,可以初步了解T细胞对肿瘤的免疫应答状况.     

IFN-α治疗对慢性丙型肝炎患者CD8~+T细胞亚群Tim-3表达水平的影响

为探讨应用IFN-α治疗和未治疗的慢性丙型肝炎患者外周血CD8+T细胞亚群细胞频数及各亚群上Tim-3表达的变化。采用流式细胞术检测IFN-α治疗和未治疗的慢丙肝患者外周血中CD8+T细胞及各亚群频数及膜表面Tim-3表达水平的方法;q T-PCR检测血清中HCV-RNA水平;Spearman相关性分析CD8+T细胞频数、Tim-3表达与HCV-RNA之间的相关性。结果显示,慢丙肝患者外周血CD8+T细胞频数较健康对照组、IFN-α治疗组显著降低(P0.01)。初始T细胞明显增加(P0.01)。TCM、TEM细胞分布频率降低(P0.01)。经IFN-α治疗后,CD8+T细胞百分率上升(P0.05),初始T细胞数量下降(P0.01),TCM、TEM细胞频数均升高(P0.01)。三组人群TEMRA细胞频数无统计学差异。与健康对照组、IFN-α治疗组相比,慢丙肝患者CD8+T细胞及各亚群Tim-3表达水平均有上调(P0.05)。经抗病毒治疗后,CD8+T细胞、Naive细胞、TEM细胞、TEMRA细胞亚群Tim-3表达明显降低(P0.05),TCM细胞亚群中Tim-3表达也有降低,但无统计学差异。Spearman相关性分析发现:慢丙肝患者外周血CD8+T细胞百分率与病毒载量呈反比(r=-0.3775,P0.01),而Tim-3表达水平与病毒载量正相关(r=0.6230,P0.0001)。由此可知,HCV感染慢性化时可出现CD8+T细胞亚群分布异常及各亚群Tim-3过表达。IFN-α通过调节各CD8+T细胞亚群分化状态,及下调各群细胞表面Tim-3的表达,促进HCV免疫清除。     

CML相关抗原诱导正常T细胞增殖的TCR Vα基因选用和克隆性研究

目的：了解慢性粒细胞白血病（CML）相关抗原体外诱导T细胞的TCR Vα亚家族限制性表达和克隆性增殖情况。方法：采用混合淋巴细胞和肿瘤细胞培养（MLTC）方法，利用CML细胞、K562细胞和bcr3-abl2多肽体外诱导脐血或正常人的T细胞增殖，用RT-PCR和基因扫描分析MLTC后T细胞的29个TCRVtx亚家族基因的互补决定区（CDR3），了解各Vd亚家族的限制性表达情况和T细胞克隆性增殖特点。结果：经CML抗原刺激后增殖的T细胞仅表达部分Vd谱系基因（1—14个亚家族），两例脐血均出现有Vα3亚家族T细胞克隆性增殖趋势；正常人外周血出现寡克隆增殖的Va5、Vα14亚家族T细胞。结论：CML相关抗原体外诱导脐血和正常人T细胞出现抗原相关的TCR Vα优势利用和克隆性增殖。     

PDIA3对人Jurkat T细胞TCR信号通路的调控

为了研究蛋白质二硫键异构酶A3前体(protein disulfide isomerase A3 precursor, PDIA3)在T细胞受体(T cell receptor, TCR)信号通路中的具体功能,利用电穿孔法将T 细胞内的PDIA3蛋白水平敲低,通过Western blotting检测ζ-链相关蛋白70(zeta-chain associated protein 70, ZAP70)的磷酸化修饰水平, 酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)实验检测细胞因子IL-2的分泌情况,流式细胞术分析分化抗原簇69(cluster of differentiation 69, CD69)表达水平及荧光素酶报告基因检测NF-κB信号通路.结果显示:T细胞中PDIA3蛋白下调后导致ZAP70蛋白的磷酸化水平、CD69表达和IL-2的分泌都明显降低,并且影响了NF-κB信号通路,表明PDIA3蛋白对T细胞的活化有促进作用,参与T细胞TCR信号通路的调控,为进一步深入研究PDIA3与TCR下游一些功能蛋白的相互作用打下了基础.