ER-α36在2种人胶质瘤细胞中的表达比较及与Tamoxifen抗药性关系初探

为了探讨新型雌激素受体ER‐α36在他莫西芬（Tamoxifen ,TAM ）抑制人胶质瘤细胞增殖中的作用,以人神经胶质瘤细胞系 U 87‐M G 和 U 251为实验材料,采用MTT、实时定量PCR、蛋白质免疫印迹等方法,观察ER‐α36的表达水平以及与TAM 抗药性的关系．结果显示：（1）2种细胞中均有ER‐α36的表达,但U87‐MG细胞中ER‐α36的表达水平明显高于U251细胞（P＜0．01）;（2）Tam均对2种细胞增殖产生抑制作用,且呈剂量依赖性．但U87‐MG对Tam的抗药性强于U251．提示新型雌激素受体ER‐α36的表达水平可能影响神经胶质瘤对TAM 的抗性．     

雷氏大疣蛛毒素对神经胶质瘤U87的抑制作用

直观的观察雷氏大疣蛛毒素促进神经胶质瘤U87凋亡的形态学变化。首先用蛋白印迹法检测合适的雷氏大疣蛛毒素浓度处理U87细胞,再用该浓度毒素处理U87细胞不同时间;用100pg/m L的雷氏大疣蛛毒素作用48 h诱导神经胶质瘤U87细胞凋亡,然后用倒置相差显微镜,Gimsa染色法,吖啶橙/嗅化乙锭(AO/EB)双重荧光染色法以及流式细胞法,从最直观的形态学上观察雷氏大疣蛛毒素促进神经胶质瘤U87凋亡的形态学变化。实验组的细胞出现很明显的凋亡小体,细胞膜不会破裂,细胞质不会流出,细胞核含有固缩核片段等细胞凋亡的形态学上的特征。雷氏大疣蛛毒素作用神经胶质瘤U87细胞后的形态学的变化,基本包括了细胞凋亡的主要的形态学特征。说明雷氏大疣蛛毒素是通过促进神经胶质瘤U87细胞凋亡从而抑制细胞的增殖。     

汉黄芩素对人神经胶质瘤细胞U251的凋亡诱导作用

研究汉黄芩素对人神经胶质瘤细胞U251增殖和凋亡的影响,用不同浓度的汉黄芩素作用于U251细胞系,通过核染色观察形态变化,MTT检测细胞增殖抑制率,流式分析检测细胞的凋亡情况.结果显示,药物作用后的细胞,DAPI核染色呈致密浓染,并伴有凋亡小体的出现;MTT法测得U251细胞的增殖得到明显的抑制,抑制率随浓度和作用时间的增加而上升,其中作用24 h的IC50为145.87 μmol/L; Annexin V-FITC /PI流式细胞检测证实汉黄芩素确实可以诱导U251细胞凋亡,并有剂量依赖的性质;通过比色法证明在药物处理过的细胞中,凋亡标志性酶Caspase-3被激活,且活性随着药物浓度的升高而增强.研究表明,汉黄芩素能明显抑制U251细胞增殖,诱导细胞凋亡,具有抗神经胶质瘤的作用.     

钾通道阻断剂对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响

为了检测电压门控钾通道阻断剂4-氨基吡啶(4-AP)、四乙胺(TEA)和ATP敏感钾通道阻断剂格列苯脲(Glibenclamide,Gli)对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响,选用人胶质瘤细胞系U87和U251,其中钾通道阻断剂4-AP、TEA及Gli处理作为实验组,未处理的作为对照组.采用划痕实验和Transwell小室法检测钾通道阻断剂对U87和U251细胞迁移和侵袭能力的影响; Western blot检测药物处理后细胞高迁移率蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)表达水平.结果表明:5 mmol·L^-1的4-AP、40 mmol·L^-1的TEA及400 μmol·L^-1的Gli可以显著抑制胶质瘤细胞的迁移、侵袭,并降低HMGB1表达水平.电压门控钾通道和ATP敏感钾通道对胶质瘤细胞迁移和侵袭具有重要调控作用,3种钾通道阻断剂对胶质瘤细胞迁移和侵袭有不同程度的抑制作用,可能通过调控HMGB1相关通路实现.     

腺病毒介导的BmK CT基因抑制神经胶质瘤U251细胞迁移及诱导凋亡的研究

以腺病毒为载体介导东亚钳蝎氯离子通道神经毒素(BmK CT)感染人脑神经胶质瘤细胞株U251,研究其对细胞迁移及凋亡的影响,并探讨可能的作用机制.首先以含BmK CT基因的腺病毒Ad-BmK CT及对应的腺病毒空载体转染U251细胞筛选出最佳感染浓度,随后利用Boyden Chamber实验和划痕实验检测了BmK CT对U251细胞迁移能力的影响,MTT检测了细胞存活能力,用Annexin V-Cy5和PI双标记流式检测分析细胞凋亡情况,并通过Western-blot检测凋亡相关蛋白分析可能的凋亡机制.结果显示,U251细胞感染Ad-BmK CT 48h后,迁移能力受到明显抑制;细胞变圆漂浮,Western-blot检测发现细胞色素c开始释放,caspase-3表达上调.     

下调ATF5基因表达对神经胶质瘤细胞增殖及巨细胞病毒复制的影响

采用慢病毒介导的小RNA干扰技术,靶向干扰神经胶质瘤U87细胞中ATF5基因的表达,构建ATF5基因下调稳定表达的细胞株,并用Real-time PCR检测ATF5基因的下调表达效率。CCK8实验检测下调ATF5基因表达后对U87细胞增殖的影响;Semi-quantitative RT-PCR及Western-blot分别在mRNA、蛋白水平上检测下调ATF5的表达后对感染的HCMV复制的影响。研究结果显示,下调ATF5基因的表达可以抑制U87细胞的增殖,并且可以分别在mRNA、蛋白水平上抑制HCMV的复制。抑制U87细胞的增殖可以减慢神经胶质瘤的增长速度,抑制HCMV的复制可以减慢或者阻止神经胶质瘤恶性转化过程。由此可以推断出,下调ATF5基因的表达不仅可以直接抑制神经胶质瘤细胞的生长,还可以间接的抑制神经胶质瘤的发生发展。因此,下调ATF5的表达可能成为治疗神经胶质瘤的新的方法。     

聚酰胺-胺介导反义寡核苷酸转染增强脑胶质瘤细胞化疗敏感性

以树形大分子聚酰胺-胺（PAMAM）为载体,与靶向表皮生长因子受体（EGFR）的反义寡核苷酸（ASODN）静电复合形成平均粒径为5lnm的复合体,以U251胶质瘤细胞为肿瘤细胞模型,研究了PAMAM介导ASODN体外瘤细胞转染效果．荧光倒置显微镜观察表明,纳米复合物可以被胶质瘤细胞吞噬．RT—PCR和免疫荧光结果表明,ASODN在瘤细胞内高效转染,使EGFR表达下调至9．04％,显著低于对照组92．32％．但是,EGFR表达下调只能使胶质瘤细胞有限凋亡．以ASODN／PAMAM预先处理胶质瘤细胞,再与卡氮芥联用,可明显增强BCNU对胶质瘤细胞的抑制效果,在同等瘤细胞抑制条件下,卡氮芥用量可降低5倍．     

HCMV感染对恶性胶质瘤U87细胞迁移及侵袭能力的影响

研究人巨细胞病毒(HCMV)感染对恶性神经胶质瘤U87细胞迁移及侵袭能力的影响。采用HCMV(MOI=5)感染神经胶质瘤U87细胞,Transwell体外迁移实验、Transwell体外侵袭实验检测HCMV感染对U87细胞迁移侵袭能力的影响;Western-blot检测肿瘤迁移、侵袭的标志性蛋白局部粘着斑激酶(FAK)及pTyr397FAK的表达变化。Transwell结果显示,HCMV感染U87细胞后迁移侵袭到小室膜下的细胞数量明显高于未感染组(P0.05);Western-blot结果显示,HCMV感染组及对照组均出现FAK、pTyr397FAK蛋白的表达;HCMV感染组pTyr397FAK蛋白相对表达量高于对照组(P0.05)。HCMV感染U87细胞通过促进FAK,Tyr397的磷酸化而促进胶质瘤U87细胞的迁移及侵袭。因此,抑制HCMV感染细胞后的FAK蛋白的磷酸化可以成为恶性胶质瘤预防及治疗的新靶点。     

α-caesalpin抑制CSPG4通路诱导胶质瘤细胞线粒体功能障碍引发凋亡的机制

胶质母细胞瘤对常规治疗耐受,寻找新的药理学靶点和有效的治疗剂,对治疗替莫唑胺抗性神经胶质瘤尤为重要。通过测定呋喃二烯酮类(α-caesalpin,α-CAE)对耐药型胶质瘤细胞的促凋亡作用和α-CAE对线粒体功能和凋亡通路的调控,研究α-CAE诱导替莫唑胺耐药的胶质瘤细胞凋亡的药理学作用和分子信号通路。研究表明α-CAE能够抑制CSPG4-AKTERK1/2通路,上调IGFBP3表达,并且引起了线粒体凋亡蛋白AIF和Bax的活化以及Drp1的募集。研究结果揭示了靶向CSPG4通路治疗化疗抵抗性胶质瘤的可能。     

龙血竭对Lewis肺癌小鼠放疗模型的辅助治疗效果

 龙血竭具有一定的防辐射作用。通过在C57/BL 小鼠右前腋窝皮下注射Lewis 肺癌细胞, 对小鼠进行4 Gy 全身一次性γ辐射建立Lewis 肺癌小鼠放疗模型, 并给予小鼠龙血竭, 进行肿瘤生长、肿瘤转移和血象变化检测, 研究了龙血竭对Lewis 肺癌小鼠放疗模型的血象及肿瘤生长的辅助治疗效果。实验发现, 龙血竭不会促进放疗Lewis 肺癌小鼠的肿瘤生长和转移, 并能够有效保护放疗Lewis 肺癌小鼠的血小板。研究表明, 龙血竭应用于肿瘤的放射治疗可以对辐射引起机体的血象损伤起到保护作用。     

铁死亡调控机理及其在肿瘤治疗中的应用

 铁死亡（ferroptosis）为最近鉴定出的一种新的细胞程序性死亡模式,越来越多证据表明铁死亡在肿瘤的发生发展中扮演了重要角色。综述了近年来铁死亡的调控机制研究进展,包括经典和非经典的铁死亡诱导过程、活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）及非编码RNA在铁死亡调控中的作用。论述了铁死亡与肿瘤的关系,包括肿瘤抑制因子、缺氧诱导因子、NRF2和细胞间质化状态参与铁死亡敏感性的调控,以及利用铁死亡来靶向治疗肿瘤,介绍了研发出的4类铁死亡诱导剂：I、II、III和IV型。总结了可能的肿瘤细胞抵抗铁死亡的机制,为靶向这一新的细胞死亡模式提供分子依据,从而提高肿瘤治疗效果。     

新生儿坏死性小肠结肠炎中细胞死亡机制的研究进展

坏死性小肠结肠炎(Necrotizing Enterocolitis, NEC)是由多因素作用导致的肠道急性炎症性疾病，是早产儿主要的死亡原因之一。以往的研究认为，细胞凋亡是NEC中肠上皮细胞最主要的死亡形式。但近年来的研究发现，程序性坏死(Necroptosis)、细胞焦亡(Pyroptosis)及铁死亡(Ferroptosis)等非凋亡形式的程序性细胞死亡(Programmed Cell Death, PCD)也可能参与到NEC的发病机制中，不同形式的细胞死亡的信号调节通路不同，可能会相互影响或存在共同的调节机制如细胞广泛凋亡小体(PANoptosome)等。本文综述了非凋亡形式的不同类型程序性细胞死亡方式及其信号调节通路，以及其在NEC中的作用机制，并提出NEC诊断生物标志物或防治的新靶点，以期为临床NEC的预防和管理提供思路。     

RAS-RAF-MEK-dependent oxidative cell death involving voltage-dependent anion channels

Therapeutics that discriminate between the genetic makeup of normal cells and tumour cells are valuable for treating and understanding cancer. Small molecules with oncogene-selective lethality may reveal novel functions of oncoproteins and enable the creation of more selective drugs. Here we describe the mechanism of action of the selective anti-tumour agent erastin, involving the RAS-RAF-MEK signalling pathway functioning in cell proliferation, differentiation and survival. Erastin exhibits greater lethality in human tumour cells harbouring mutations in the oncogenes HRAS, KRAS or BRAF. Using affinity purification and mass spectrometry, we discovered that erastin acts through mitochondrial voltage-dependent anion channels (VDACs)--a novel target for anti-cancer drugs. We show that erastin treatment of cells harbouring oncogenic RAS causes the appearance of oxidative species and subsequent death through an oxidative, non-apoptotic mechanism. RNA-interference-mediated knockdown of VDAC2 or VDAC3 caused resistance to erastin, implicating these two VDAC isoforms in the mechanism of action of erastin. Moreover, using purified mitochondria expressing a single VDAC isoform, we found that erastin alters the permeability of the outer mitochondrial membrane. Finally, using a radiolabelled analogue and a filter-binding assay, we show that erastin binds directly to VDAC2. These results demonstrate that ligands to VDAC proteins can induce non-apoptotic cell death selectively in some tumour cells harbouring activating mutations in the RAS-RAF-MEK pathway.     

The molecular mechanism of different sensitivity of breast cancer cell lines to TRAIL

Although Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) selectively induces apoptosis of various cancer cells, some caner cell lines are resistant to TRAIL-induced cell death. To investigate the molecular mechanisms underlying TRAIL-resistance, two human breast cancer cell lines, MCF-7 (resistant to TRAIL) and MDA-MB-231 (sensitive to TRAIL), were used as a model system to analyze the different sensitivities to TRAIL cytotoxicity. PKCδ inhibitor rottlerin, but not MEK and ERK1/2 inhibitor U0126 nor PI3K inhibitor LY294002, was shown to enhance TRAIL-induced apoptosis in MCF-7 cells significantly, suggesting that PKCδ might play an important role in the resistance of MCF-7 cells to TRAIL. In contrast, rottlerin, U0126, and Ly294002 had no effect on MDA-MB-231 apoptosis induced by TRAIL under the same conditions. Further experiment showed that the combination of rottlerin and TRAIL cleaved PARP in the MCF-7 cells synergistically, but not in the MDA-MB-231 cells. The role of PKCδ in TRAIL-resistant MCF-7 cells was confirmed by knocking down the endogenous PKCδ expression using RNAi technology. Furthermore, caspase-3 reconstitution in MCF-7 cells was unable to alter PKCδ expression, suggesting that innate caspase-3 deficient in the cells does not cause PKCδ high expression. These data provide evidence for the first time that PKCδ plays a critical role in breast cancer cell lines to TRAIL cytotoxicity.     

神经生长因子125I偶联物诱导人胶质瘤U251细胞G2期阻滞

 观察¹²⁵I-NGF(神经生长因子)对U251细胞DNA的损伤作用,探讨¹²⁵I-NGF的抗肿瘤作用机制。应用微核测试和单细胞电泳等方法观察U251细胞DNA的变化,Western Blotting法检测细胞蛋白水平的变化,RT-PCR法检测Cyclin B1 mRNA水平的变化,微核测试和单细胞电泳等方法观察到¹²⁵I-NGF对U251细胞DNA的损伤作用。细胞周期检测及MPM-2/PI复染实验表明¹²⁵I-NGF诱导了U251细胞G₂期阻滞。Western Blotting检测表明,¹²⁵I-NGF可能通过活化ATM和ATR途径发挥抗肿瘤作用。¹²⁵I-NGF以剂量依赖性的模式减少了U251细胞Cyclin B1蛋白表达水平,但没有改变其mRNA的表达水平。在U251细胞中,磷酸化Chk1、Chk2和Cdc25c蛋白水平提高,而p53和p21水平保持不变。阐明了¹²⁵I-NGF通过对U251细胞DNA的损伤作用活化ATM和ATR通路,使多种蛋白的表达水平发生了改变,从而发挥其抗肿瘤的作用。     

Cyclophilin D-dependent mitochondrial permeability transition regulates some necrotic but not apoptotic cell death

Mitochondria play an important role in energy production, Ca2+ homeostasis and cell death. In recent years, the role of the mitochondria in apoptotic and necrotic cell death has attracted much attention. In apoptosis and necrosis, the mitochondrial permeability transition (mPT), which leads to disruption of the mitochondrial membranes and mitochondrial dysfunction, is considered to be one of the key events, although its exact role in cell death remains elusive. We therefore created mice lacking cyclophilin D (CypD), a protein considered to be involved in the mPT, to analyse its role in cell death. CypD-deficient mice were developmentally normal and showed no apparent anomalies, but CypD-deficient mitochondria did not undergo the cyclosporin A-sensitive mPT. CypD-deficient cells died normally in response to various apoptotic stimuli, but showed resistance to necrotic cell death induced by reactive oxygen species and Ca2+ overload. In addition, CypD-deficient mice showed a high level of resistance to ischaemia/reperfusion-induced cardiac injury. Our results indicate that the CypD-dependent mPT regulates some forms of necrotic death, but not apoptotic death.     

基于微流控芯片的无CO2环境下神经细胞与免疫细胞培养技术研究

空间站是空间生命科学研究的重要平台,而空间站难以提供细胞培养所需要的CO₂环境,并且需要可控且自动化的细胞培养方法,因此建立基于微流控芯片的无CO₂细胞培养系统至关重要.本研究从改变培养基成分的初始pH值入手（向培养基中添加外源CO₂或缓冲物质）,探寻无CO₂环境下培养细胞的可行性.用光学显微镜镜检细胞生存状态,用MTS法测定细胞活力.结果表明向培养基中添加不同比例的HEPES,在一定浓度的HEPES缓冲液条件下,可实现无CO₂环境下培养人神经相关细胞SH-SY5Y和U87MG以及人免疫相关细胞THP-1,并且向培养基添加3% HEPES可以使细胞至少存活5天,在此基础上又优化了结合微流控芯片培养细胞的条件.     

丙酮醛对人牙周膜成纤维细胞的毒性作用

丙酮醛是一种细胞的代谢产物.近日研究表明,丙酮醛与牙周病发病有密切联系.通过研究丙酮醛对牙周膜成纤维细胞的毒性作用进一步明确其致病性.发现不同丙酮醛浓度在刺激牙周膜成纤维细胞后,存在一个阈值,其与所刺激的细胞浓度有关.