新型靶向性药物VEGF-hFc的抗肿瘤研究

生物机体内天然存在许多受体与配体,它们之间亲和结合力远远高于抗体亲和力（Kd=10-8~10-9）.本实验根据VEGFR和VEGF之间的高亲和力（Kd=1.6×0-11）,以新生血管细胞表面的VEGFR为靶点,设计VEGFhFc融合蛋白作为靶向抗肿瘤药物.在本实验中构建pcDNA3.1IgG leader-VEGF-hFc重组载体,转染CHO/dhFr-细胞真核表达融合蛋白VEGF-hFc,并通过Protein A纯化.使用A549细胞构建人非小细胞肺癌裸鼠肿瘤模型,小鼠静脉注射10 μg VEGF-h     

幽门螺杆菌鞭毛蛋白A单克隆抗体的制备与鉴定

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)鞭毛蛋白A(FlaA)可作为临床诊断标志物,但目前尚无识别FlaA蛋白的特异性抗体.该研究构建了HpflaA基因表达质粒,表达并纯化了HpFlaA重组蛋白,并以此重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞技术制备HpFlaA单克隆抗体,最后对抗体的亚型、效价、纯度、亲和力和特异性等进行鉴定.共获得5株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2G2、2G10、3E2、3E4和4H3.这5株细胞分型均为IgG1型且抗体效价均超过1∶10~5,亲和常数均达到10~7以上.经间接酶联免疫吸附实验和蛋白质免疫印记实验验证,单克隆抗体能特异性识别HpFlaA.成功制备出高亲和力、高效价、特异性好的HpFlaA单克隆抗体,具有潜在临床应用价值.     

绿色荧光蛋白结合蛋白的表达纯化与鉴定

绿色荧光蛋白(GFP)及其衍生物已经被广泛应用于生物化学和分子生物学研究,其纳米抗体(GBP)也已在近期被鉴定,但GBP大规模表达及纯化流程优化尚未见报道,并且GBP与不同荧光蛋白之间的亲和力尚未被测定.我们首先构建了GBP基因(GBP1)的原核表达系统,然后通过Ni-NTA亲和层析和Mono Q阴离子交换层析纯化,每升菌液能够得到超过43mg、纯度超过95%的重组GBP1蛋白.我们通过MALDI-TOF/TOF质谱法测定纯化的GBP1的精确分子量,通过微量热泳动(MST)和等温滴定量热(ITC)实验检测GBP1与7种不同来源荧光蛋白的亲和力.结果显示GBP1特异性地与源自Aequorea victoria的荧光蛋白及其衍生荧光蛋白相互作用,与RFP和Zoanthus GFP等无相互作用.GBP1与EGFP和sfGFP的亲和力最高,与YPet和T-Sapphire的亲和力稍弱,与CyPet的亲和力最低.     

西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)pilO基因的功能研究

细菌性果斑病是全世界范围内瓜类生产中的重要病害,其病原菌是西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli).细菌Tpye-IV菌毛的生物合成及功能由十几个基因参与调控,pilO是其中的一个基因.运用同源重组的方法,构建了西瓜噬酸菌AAC-3菌株Type IV菌毛结构蛋白编码基因pilO的功能缺失突变体菌株ΔpilO,对突变体的生长能力、运动能力、生物薄膜形成能力及致病力等进行了测定,同时对菌体形态进行观察.透射电镜观察结果显示突变体菌株不能形成菌毛.ΔpilO突变体菌株的生长基本不受影响,但是其运动能力显著下降,生物薄膜形成能力降低80%,致病力与野生型菌株相比下降了55%.本研究结果表明pilO基因在病原菌Type IV菌毛形成及其运动性和致病力等方面发挥重要作用.     

比较免疫磁珠法与A蛋白亲和层析法纯化兔抗血清中的IgG

优化了免疫磁珠分离法纯化抗血清的实验条件,并与A蛋白亲和层析法比较纯化效果,以求得到一种简便、快速、高效的纯化IgG方法.结果表明:从5只新西兰兔获得210 mL试管凝集效价高达1∶5 120的兔抗鳗弧菌抗血清,磁珠与IgG结合10 min达到平衡,其最大结合量为0.227 mg/mL;免疫磁珠分离法与A蛋白亲和层析法...     

十字花科黑腐病菌一个致病相关基因的鉴定

十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,简称Xcc)8004菌株的一个转座子插入突变体186807,其Tn5gusA5插入位点位于一个推测的双组分调控系统的感受蛋白基因XC2229中.该突变体对寄主植物满身红萝卜的致病力显著降低.为了进一步证实XC2229基因与该菌致病力之间的相关性,本工作构建了该基因的缺失突变体DM2229.DM2229与186B07在寄主上的致病力基本一致,均显著低于野生型Xcc 8004.生化及表型检测结果表明,DM2229的胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)产量降低,细胞运动能力减弱.用带有完整XC2229基因的pLALR6互补DM2229,互补菌株CDM2229在EPS合成、细胞运动能力以及致病力方面与野生型Xcc 8004基本一致.这些实验结果表明,XC2229是一个与EPS合成、细菌运动相关的基因.推测该基因通过调控EPS的生成和运动能力而影响Xcc的致病力.     

德国小蠊致敏原Bla g 2的Glu 233突变的分子对接研究

为探讨Bla g 2的E233A突变对抗原抗体相互作用的影响,从RCSB数据库下载德国小蠊致敏原Bla g 2野生型及其单克隆抗体4C3的NMR结构,运用Swiss PDB Viewer将Bla g 2野生型(E233-93Q)构建为突变型(E233A-93Q)三维结构;并将Bla g 2野生型和突变型分别与其单克隆抗体4C3进行分子动力学模拟和蛋白-蛋白对接.结果表明:突变体E233A与单克隆抗体4C3结合能力下降,进而增加了与Ig E的结合力,可能加重过敏反应的发生.     

烟曲霉COFILIN与人GOSR1蛋白相互作用并抑制HEK293T细胞的增殖

COFILIN是真核生物中肌动蛋白的解聚因子,使细胞骨架产生活力.烟曲霉(Aspergillus fumigatus)COFILIN蛋白是其侵入机体的主要致病力因子,也是其逃逸宿主免疫系统防御的重要手段.为了探索烟曲霉COFILIN在感染宿主细胞过程中的作用机制,首先利用酵母双杂交技术在人类巨噬细胞cDNA文库中筛选到了一个新的COFILIN相互作用蛋白GOSR1(Golgi SNAP receptor complex member 1),然后采用GST pulldown和Co-IP技术验证了这两个蛋白在体外和体内相互作用的特异性,并通过将构建的截短突变体转化宿主菌表达的形式确定了相互作用的区段.将烟曲霉COFILIN基因在HEK293T细胞中过表达,结果发现COFILIN对细胞内源性GOSR1在转录水平和蛋白水平的表达都有一定的抑制作用,同时抑制细胞增殖、促进凋亡,并引起G2/M期阻滞.     

表面等离子共振测定CD45-FITC抗体与蛋白A特异性结合常数

运用表面等离子共振(SPR)平台建立测定CD45-FITC抗体与蛋白A特异性结合常数的方法。当偶联蛋白A的传感芯片上流过CD45-FITC抗体溶液时,双通道SPR仪实时监测CD45-FITC抗体与蛋白A特异性结合过程,获得了该反应不同温度下的结合速率常数k_a、解离速率常数k_d和结合平衡常数K_a,以及该反应的活化能E_a和焓变△H。结果表明该特异性结合比较适宜的条件是:中性或微碱性、较高的离子强度和较高的温度。该方法操作步骤简单、快速、灵敏度高、消耗样品少,是研究分析免疫球蛋白IgG抗体和蛋白A等生物分子相互作用比较理想的方法之一。     

CDK1磷酸化修饰对驱动蛋白Kif18A的ATP酶活性的影响

为了探究真核细胞中蛋白激酶CDK1的磷酸化修饰对驱动蛋白分子Kif18A的ATP酶活性的影响,利用昆虫杆状病毒表达系统,在体外表达并纯化Kif18A模拟磷酸化(EE)和非磷酸化(AA)的突变体蛋白(Kif18A-EE,Kif18A-AA).首先构建驱动蛋白Kif18A的杆状病毒表达载体质粒pFast-Bac-FLAG-Kif18A-AA或EE,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,通过蓝白斑筛选得到阳性克隆.随后提取杆状病毒基因组,转染昆虫细胞SF9后得到能够表达FLAG-Kif18A突变体蛋白的杆状病毒.扩增病毒后,对病毒感染SF9细胞表达目的蛋白的条件进行优化,最终通过蛋白纯化得到有活性的Kif18A突变体蛋白,并在体外检测纯化蛋白的ATP酶活性.结果显示,Kif18A-EE蛋白的ATP酶活性低于Kif18A-AA蛋白.这一结果表明,CDK1的磷酸化修饰能够降低驱动蛋白Kif18A的ATP酶活性.     

新型二氢化茚-咪唑衍生物的合成及生物活性研究

从1-茚酮出发,通过简洁的路线合成了15个结构新颖的二氢化茚-咪唑衍生物,并对合成的新化合物进行了抗肿瘤活性和抑菌活性的筛选.生物活性结果表明,化合物7、15、16和18具有较好的抗肿瘤细胞毒活性,其中化合物15对白血病(HL-60)、肝癌(SMMC-7721)及肺癌(A-549)的细胞毒活性甚至优于阳性药物DDP;化合物7、10、14、15、16和17对金黄色葡萄球菌(S.aureus)和枯草芽孢杆菌(B.sutbilis)均具有较好的抑菌活性,化合物8对金黄色葡萄球菌显示出较好的选择性抑制活性.     

gamma-Interferon induced by S. aureus protein A augments natural killing and ADCC

Staphylococcus aureus produces a protein identified as protein A (SpA) with a molecular weight of 41,000 (ref. 1) which binds to the Fc region of many types of mammalian IgG2, activates complement, blocks opsonins and is both chemotactic and mitogenic. SpA has been used for various immunological purposes including removal of immune complexes, arming effector cells with antibody, distinguishing between antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and natural killing (NK), and exerting anti-tumor activity. We have now demonstrated that SpA induces the production of gamma interferon (IFN-gamma) in nonadherent, T lymphocyte-depleted (E-), Fc receptor-bearing (FcR+) human peripheral blood lymphocytes. Our data also suggest that IFN-gamma is a potent stimulator of both NK and ADCC activity.     

sFcγRⅡb蛋白结合肽的筛选与鉴定

FcγRⅡb是免疫球蛋白G受体( FcγR)中唯一的抑制型受体,在免疫反应的负性调节方面发挥重要作用.为了筛选sFcγRⅡb的蛋白结合肽,以重组sFcγRⅡb蛋白为靶分子,采用噬菌体肽库展示技术对sFcγRⅡb结合肽进行筛选.利用ELISA鉴定每轮洗脱噬菌体与sFcγRⅡb蛋白亲和力,经过4轮筛选,挑取40个噬菌体克隆进行序列测定,获得28种不同的12肽序列.经ELISA法鉴定噬菌体与sFcγRⅡb蛋白结合活性,得到sFcγRⅡb蛋白高特异性、高亲和力结合肽FHKMPWYMSMYY,为进一步研究FcγRⅡb的作用机制和探索结合肽的功能提供实验基础.     

Sequences homologous to ZFY, a candidate human sex-determining gene, are autosomal in marsupials

Sexual differentiation in placental mammals results from the action of a testis-determining gene encoded by the Y chromosome. This gene causes the indifferent gonad to develop as a testis, thereby initiating a hormonal cascade which produces a male phenotype. Recently, a candidate for the testis-determining gene (ZFY, Y-borne zinc-finger protein) has been cloned. The ZFY probe detects a male-specific (Y-linked) sequence in DNA from a range of eutherian mammals, as well as an X-linked sequence (ZFX) which maps to the human X chromosome. In marsupials it is also the Y chromosome that seems to determine the fate of the gonad, but not all sexual dimorphisms. Using the ZFY probe we find, surprisingly, that the ZFY homologous sequences are not on either the X or the Y chromosome in marsupials, but map to the autosomes. This implies ZFY is not the primary sex-determining gene in marsupials. Either the genetic pathways of sex determination in marsupials and eutherians differ, or they are identical and ZFY is not the primary signal in human sex determination.     

IgM-autoantibodies against isologous erythrocytes also react with isologous IgG(Fc)

The mechanisms by which the adaptive immune system of animals discriminate between foreign and self components are not known. It is generally believed that antibodies are produced only in response to foreign agents. However, against this axiom there is mounting evidence that normal animals produce autoantibodies against a variety of self components. In two murine model systems, a high proportion of IgM-producing cells secrete autoantibodies. In one model, the autoantibodies are specific for isologous mouse IgG(Fc) and in the other, the autoantibodies are specific for antigens revealed on the surface of mouse erythrocytes (RBC) by proteolytic enzymes. The function of these two autoimmune responses is a mystery. Here we show that the two responses are related. The lysis of mouse RBC, modified with bromelain (brom) by IgM autoantibodies was completely inhibited by isologous IgG(Fc), and antibodies against mouse IgG(Fc) formed precipitin bands with solubilized membranes from mouse RBC. We conclude that mouse RBC membranes and IgG(Fc) have at least one antigenic determinant in common and that this determinant is the target for autoimmune responses in normal mice.     

一种自剪切内含肽重组酿酒酵母表达优化研究

自剪切内含肽纯化系统在大肠杆菌中已经得到很好的应用。为了在真核生物中应用该系统,以酿酒酵母为宿主,p HR质粒为表达载体,构建微型内含肽ΔI-CM intein酿酒酵母表达系统。以猪免疫球蛋白Ig G的Fc domain为亲和标签,绿色荧光蛋白gfp为报告蛋白,在酿酒酵母GPD强启动子作用下,表达出融合的Fc-intein-gfp蛋白。检测发现融合序列在起始密码子ATG前加入一段Kozak序列有利于gfp表达。在此基础上,将微型内含肽ΔI-CM intein序列替换成密码子优化的ΔI-CMintein-O序列,显著促进gfp蛋白的表达量,初步实现了ΔI-CM intein融合蛋白的高效表达。为新型自剪切内含肽酿酒酵母表达系统的建立和重组蛋白高效纯化的实现奠定了基础。     

7β-[2-(2-氨噻唑-4-基)-(Z)-2-甲氧亚胺乙酰氨基]-3-(2-芳基-1,3,4-恶二唑-5-硫亚甲基)头孢菌素衍生物抑菌活性及构效关系探讨

采用2倍浓度稀释法、平板抑菌实验法、比浊法检测了衍生物对金黄色葡萄球菌等的最小抑菌浓度(MIC)及时效、量效关系，比较了6种衍生物不同的抑菌作用。结果表明，该系列头孢菌素衍生物对实验菌株均有明显的抑制活性。对金葡菌最为敏感，其中7β[2—(2—氨噻唑—4—基)—(Z)—2—甲氧亚肢乙酰氨基]—3—(2—芳基—1，3，4—恶二唑5—硫亚甲基)头孢—3—烯—4—羧酸a作用最强，与头孢拉定相似。提示该类衍生物是一类对受试菌株中金葡菌最为敏感的化合物。     

Structure of the Fc fragment of human IgE bound to its high-affinity receptor Fc epsilonRI alpha

The initiation of immunoglobulin-E (IgE)-mediated allergic responses requires the binding of IgE antibody to its high-affinity receptor, Fc epsilonRI. Crosslinking of Fc epsilonRI initiates an intracellular signal transduction cascade that triggers the release of mediators of the allergic response. The interaction of the crystallizable fragment (Fc) of IgE (IgE-Fc) with Fc epsilonRI is a key recognition event of this process and involves the extracellular domains of the Fc epsilonRI alpha-chain. To understand the structural basis for this interaction, we have solved the crystal structure of the human IgE-Fc-Fc epsilonRI alpha complex to 3.5-A resolution. The crystal structure reveals that one receptor binds one dimeric IgE-Fc molecule asymmetrically through interactions at two sites, each involving one C epsilon3 domain of the IgE-Fc. The interaction of one receptor with the IgE-Fc blocks the binding of a second receptor, and features of this interaction are conserved in other members of the Fc receptor family. The structure suggests new approaches to inhibiting the binding of IgE to Fc epsilonRI for the treatment of allergy and asthma.