两株松材线虫拮抗细菌的筛选和鉴定

【目的】筛选对松材线虫具有较高杀线活性的拮抗细菌。【方法】以分离自南京、洛阳、上海的松树茎部的137株内生细菌为研究对象,采用培养滤液和菌悬液浸渍法对这些菌株进行杀线活性的测定,并对筛选的高效拮抗细菌进行菌种鉴定。【结果】通过培养滤液浸渍试验筛选出3株细菌对松材线虫有较高的杀线活性,使用3种菌滤液处理线虫48 h后,线虫死亡率均达到100%,其中菌株LYMC-3的培养滤液还可使线虫虫体出现消解。将3株菌的培养滤液分别稀释2倍、4倍和10倍后处理松材线虫,随稀释倍数的增加,培养滤液的杀线活性逐渐降低。处理线虫48 h后,菌株LYMC-3的10倍稀释滤液与其他两株菌滤液相比对线虫的致死率最高,为94.7%; 在菌悬液浸渍试验中筛选出菌株NJSZ-13对松材线虫有较高杀线活性,10⁵ cfu/mL 浓度的菌悬液处理线虫48 h后,线虫死亡率达81.5%。通过对LYMC-3和NJSZ-13菌株的形态特征、生理生化特征、Biolog鉴定和16S rDNA序列以及系统发育分析,确定菌株LYMC-3、NJSZ-13分别为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。【结论】从松树体内筛选到两株对松材线虫有高效拮抗活性的菌株LYMC-3和NJSZ-13,对生物防治松材线虫病具有潜在的应用价值。     

喜旱莲子草灭钉螺实验研究

为了解喜旱莲子草水浸液杀螺效果,采用喜旱莲子草的茎、叶经干燥磨粉后的水浸液处理钉螺,同时用五氯酚钠水溶液和去氯水作比较和对照,结果显示0．5％以上的喜旱莲子草水浸液即对钉螺具有速杀抑螺效果,处理达48h钉螺死亡率达100％,浓度越高,抑灭螺作用越强．喜旱莲子草是一个常见易得的较好的灭螺植物．     

蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株对松材线虫产卵和繁殖的影响

【目的】 已有研究表明蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)NJSZ-13菌株对于马尾松具有促生作用,且菌悬液的促生效果最佳。为了进一步解析和评价该菌对松材线虫的生防机理,在虫液和卵液中加入NJSZ-13菌株,研究该菌株对松材线虫的杀线效果以及对其产卵、卵孵化和繁殖量的影响。【方法】 首先通过离心将蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株分成菌悬液、发酵液和发酵滤液,并调配成原液、5、10、100和1 000倍的稀释液,其中菌悬液和发酵液的原液浓度为3×10⁸ cfu/mL,以无菌水和NB培养基为对照。①用浸渍法测定NJSZ-13菌株在24 h和48 h对松材线虫的杀线效果。②挑取10对生长良好的雌雄4龄幼虫于1.5 mL离心管,用NJSZ-13菌株处理24 h后将虫卵从离心管冲洗到35 mm培养皿中,统计各处理的产卵量。③在35 mm小皿中加入1 mL无菌卵液(约含400个卵)和NJSZ-13菌株,统计12、24和36 h的孵化虫数。④将100 μL线虫液(含500条松材线虫)与100 μL NJSZ-13菌株混合接入60 mm培养皿的灰葡萄孢中,在25 ℃培养箱培养5 d,用贝尔曼法分离线虫并计数。【结果】 ①NJSZ-13菌株的发酵液和发酵滤液原液处理24 h后的杀线率即高达100%,而其菌悬液原液处理48 h后的杀线率仅为81.47%。②NJSZ-13菌株原液能极显著地抑制松材线虫产卵,随着稀释倍数的增大,这种抑制作用逐渐减小。③NJSZ-13菌株的10倍稀释液处理松材线虫卵,在12 h时极显著地抑制卵的孵化,在24 h时仍达到显著水平,在36 h时仅发酵液和发酵滤液有显著的抑制作用。100倍稀释液处理12 h时,发酵液和发酵滤液相对于对照有显著差异,其他处理时间点均无显著差异。④NJSZ-13菌株原液和5倍稀释液处理松材线虫,其繁殖力与对照组有显著差异(P<0.05)。10倍稀释液处理松材线虫时,菌悬液对线虫繁殖力无明显的影响,而发酵液和发酵滤液与对照有显著差异。【结论】 蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株的菌悬液、发酵液、发酵滤液均对松材线虫有杀线作用。其中,发酵液和发酵滤液的杀线效果更显著;NJSZ-13菌株能抑制松材线虫的产卵、卵孵化和繁殖,同样发酵液和发酵滤液的抑制效果较菌悬液明显。     

松材线虫性别决定基因Bx-sex-1表达特征和生物学功能分析

【目的】揭示松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)性别决定基因Bx-sex-1的表达特征和生物学功能。【方法】通过Mega 6中的Jones-Taylor-Thornton (JTT)模型,采用邻接法(neighbor joining,NJ)对Bx-sex-1和其他线虫的氨基酸序列进行系统发育构建。采用同步培养的方法分别收集不同龄期的松材线虫并提取总RNA,反转录获得cDNA并采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR) 的方法,研究Bx-sex-1在松材线虫不同发育阶段的相对表达量。同时采用qRT-PCR并通过绝对定量法分析Bx-sex-1基因在雌虫和雄虫基因组的拷贝数。采用dsRNA浸泡法对目的基因进行干扰,观察松材线虫后代卵的孵化率和雌雄比的变化。【结果】系统进化树显示松材线虫Bx-sex-1和其他两个植物寄生线虫成为一支,与自由生线虫和寄生动物线虫分别进化为不同的分支。松材线虫Bx-sex-1在不同发育阶段相对表达量有差异,在卵期相对表达量最高,而在2龄幼虫时期最低,从2龄幼虫时期到成虫时期相对表达量逐渐升高。qRT-PCR结果显示Bx-sex-1基因在雌虫和雄虫基因组中均为单拷贝。Bx-sex-1被干扰后,卵的孵化率下降,雌雄比降低。【结论】松材线虫Bx-sex-1基因在卵的发育过程和性别决定中可能具有重要作用。     

拟松材线虫个体发育研究

【目的】探索拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)的繁殖能力,并对其胚胎发育过程中经历的重要阶段和卵的形态变化进行研究,了解胚胎发育和完成整个生活史所需时间,为进一步研究其生长发育并进行有效防控提供参考。【方法】分别挑取3组180条拟松材线虫雌成虫,观察记录雌虫在25 ℃条件下的产卵情况,每隔2 h统计每组线虫的累积产卵量,直至卵的数量基本不再增加。挑取尚未产卵的拟松材线虫雌虫于载玻片上,待其产卵后,将卵置于蔡司体视显微镜下观察。连续观察胚胎的发育过程并使用照片记录不同发育阶段胚胎的形态变化,记录卵发育至不同阶段所需时间。挑取约200个刚产下的拟松材线虫卵,在25 ℃条件下发育24 h后每隔4 h统计其总孵化率,直至孵化数不再增加,设置3组重复。将刚孵化的2龄幼虫接种于灰葡萄孢(Botrytis cinerea)上,分为3组,每组设置3个重复,分别在接种1、2、3 d后使用贝尔曼漏斗法收集线虫,计算混合龄线虫中每龄期线虫所占比例,计算拟松材线虫胚后发育及完成整个生活史所需时间。【结果】① 在拟松材线虫产卵能力方面,0~10 h拟松材线虫产卵总量增长较快,16 h后产卵量逐渐趋于稳定,28 h内雌虫平均累积产卵12粒/条。② 拟松材线虫的胚胎发育过程主要经历以下几个关键阶段:单胞期、双胞期、3胞期、4胞期、5胞期、8胞期、16胞期、囊胚期、利马豆期、蝌蚪期、蠕虫期、1龄幼虫(J1),至孵化为2龄幼虫(J2)时结束。③ 在胚胎发育前期,第1次卵裂发生的位置存在两种情况,即卵的1/2和1/3处。双胞发育至5胞时也存在两种不同的发育方式,一种是双胞不移动直接分裂成3胞并列排列,另外一种是细胞进行移动,3胞呈三角形排列。通过观察30个卵的第1次卵裂和100个卵双胞的发育过程发现,这些不同的发育方式均是普遍存在的。④ 在25 ℃条件下,拟松材线虫卵的累积孵化率随时间增加而增加,在32 h时达到最高(93.31%),随后逐渐趋于稳定。⑤ 在25 ℃条件下记录了拟松材线虫卵从单胞发育至各个阶段的时间,完成整个胚胎发育过程需要约28 h。2龄幼虫接种于灰葡萄孢3 d后即可获得新的2龄幼虫,因此拟松材线虫完成整个生活史只需要3 d。【结论】对拟松材线虫卵从单胞阶段直至孵化的整个胚胎发育过程进行观察发现,拟松材线虫完成胚胎发育大约需要28 h,完成整个生活史需要3 d。对拟松材线虫产卵能力和卵的孵化率进行统计,收集拟松材线虫卵和2龄幼虫的最佳时间分别为16 h和36 h。拟松材线虫胚胎发育前期,在第1次卵裂期以及由双胞期发育至5胞期的两个过程中均存在两种与同属线虫不同的发育方式。这种现象还有待进一步研究。     

松材线虫拮抗细菌的筛选和鉴定

为了筛选对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)具有较高杀线活性的拮抗细菌,从马尾松林中分离获得了230株细菌,并从中筛选出8株对松材线虫具有较高杀线活性的细菌,其中JK-JS3菌株对松材线虫的杀线活性最高.将该细菌培养滤液分别稀释2倍、4倍、10倍处理松材线虫,72h后线虫的死亡率均达到100%;线虫死亡后虫体消解,消解率分别为100%、97.8%、96.4%.测定了该细菌培养滤液对香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)和水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)等植物线虫的杀线活性,结果表明对不同种的线虫杀线活性有差异.该菌株培养滤液对松材线虫和小杆线虫(Rhabditis sp.)的杀线活性最高,其余杀线活性从高到低依次为拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)、腐生线虫(Panagrellus redivivus)、香蕉穿孔线虫和水稻干尖线虫.形态特征和革兰氏染色观察,该细菌为革兰氏阳性菌、产芽孢、具有周生鞭毛;经Biolog细菌鉴定仪进一步鉴定该细菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens).     

蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株诱导马尾松抗松材线虫病研究

【目的】蜡样芽孢杆菌NJSZ-13是1株能杀死松材线虫的松树内生细菌,研究该菌株能否诱导马尾松抗松材线虫病,为进一步开发利用该菌株抗松材线虫病提供理论依据。【方法】通过对2年生马尾松苗根部施用NJSZ-13菌株菌悬液和灭活的菌悬液后4 d再接种松材线虫,以观察不同处理的病情发展。测定该菌诱导处理后4天内和接种松材线虫AMA3虫株后28天内马尾松体内防御相关酶活性的变化。【结果】接种松材线虫后42 d,菌悬液和灭活菌悬液处理诱导马尾松抗松材线虫病的效果达54%和33%,且发病时间延迟。接种NJSZ-13菌株后,马尾松体内丙二醛(MDA)含量减少,过氧化氢酶(CAT)活性降低,而过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)活性均显著高于对照;接种松材线虫后,菌悬液和灭活菌悬液处理的马尾松这5种酶活性明显高于未接种菌株的马尾松苗。总体上,菌悬液处理比灭活菌悬液处理的马尾松防御相关酶活性变化显著。【结论】蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株能诱导马尾松抗松材线虫病,并且菌悬液的诱抗效果最佳。     

细菌XSJS3对松材线虫杀线活性的测定

细菌XSJS3是一种新发现的对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)具有较高杀线活性的细菌,试验比较了细菌XSJS3培养液、细菌培养液滤液及含菌体水溶液对松材线虫的杀线活性,结果发现细菌菌体本身对松材线虫无杀线活性,杀线活性物质存在于细菌的培养液滤液中。通过对该细菌培养液滤液对松材线虫致死过程的观察发现:松材线虫接触该细菌培养液滤液30min后就表现为行动迟缓;在5h后所有虫体均不活动,针刺无反应;24h后部分僵直虫体出现局部膨大,且膨大部位出现体液外渗而虫体最终被消解。对不同培养时间的细菌XSJS3滤液杀线活性的比较试验表明:该细菌分泌的杀线物质在10d内随培养时间的延长而含量增加,杀线活性逐渐提高,不同培养时间下滤液的杀线活性差异明显;但培养15d后,稀释10倍的滤液对松材线虫杀线活性比培养10d时同样滤液的杀线活性则略有下降,但差异不明显,因此获得该细菌分泌的杀线物质较理想的培养时间为10d。将细菌XSJS3培养液滤液进行不同温度的热处理后测定对松材线虫的杀线活性,结果表明引起松材线虫死亡和消解的物质是两个不同物质,存在于培养液滤液中的对松材线虫有杀线活性的物质是热稳定的,而引起松材线虫虫体消解的物质是热不稳定的。     

空心莲子草不同提取物的抑菌作用研究

以空心莲子草为实验材料,采用OD值法比较空心莲子草8种不同提取物对4种微生物的抑制作用,同时采用STAT软件对结果进行聚类分析,结果表明:空心莲子草干粉酸性乙醇提取物6和80%乙醇处理后的空心莲子草残渣的水提物的60%乙醇沉淀物质4对大肠杆菌具有较好的抑制效果,空心莲子草醇提物的乙酸乙酯酯层萃取物5对枯草杆菌的抑制效果非常明显,空心莲子草醇提物的乙酸乙酯醇层萃取物8和80%乙醇处理后的空心莲子草残渣的水提物的60%乙醇沉淀物质4对金黄色葡萄球菌具有较明显的抑制效果,空心莲子草醇提物的乙酸乙酯萃取物5和8对苏云金芽孢杆菌抑制效果明显,聚类结果显示空心莲子草的乙酸乙酯提取物有别于其他提取物.     

几种植物提取液对根结线虫的抑杀作用

采用浸渍生测法测定了一些外来有害植物以及本地常见植物提取液11种对南方根结线虫(Meloidogyne incog-nita)的毒杀作用,结果表明:马缨丹、烟草、一枝黄花、冬青等5种植物提取物的抑杀作用都很强,均有95%以上的校正死亡率.且每种植物不同部位的杀线活性物质的含量不一样.同时盆栽实验结果表明:夹竹桃、马缨丹、苦楝等4种植物提取物对线虫的抑杀作用很明显,而且对卵块孵化的抑制率也很高.     

黄山马尾松林天牛及携带线虫种类初步调查

【目的】松材线虫病是我国危害最大的森林病害,松树一旦感病便迅速死亡。调查黄山地区马尾松林内天牛种类以及天牛携带线虫的变化规律,为黄山市松材线虫病的防控工作提供理论支持。【方法】在安徽省黄山市博村林场通过野外和室内收集天牛,并对天牛进行整姿、鉴定,记录天牛种类和数量。为确定可以携带线虫的媒介天牛,使用贝尔曼漏斗法对可以危害松树且有活力的天牛进行单头天牛线虫分离实验,12 h后,用15 mL离心管接取漏斗下端的天牛浸泡液,将浸泡液放在显微镜下观察是否含有线虫。根据携带线虫的天牛数量占天牛总数的比例计算天牛总体携带线虫比例;为鉴定天牛携带线虫种类,先通过室内真菌培养、观察线虫形态学特征对线虫进行初步鉴定,再使用松材线虫分子检测技术确定天牛携带的线虫是否为松材线虫,对于其他寄生线虫,通过28S rDNA基因进行扩增、测序、比对以及构建系统进化树进行分类鉴定。此外,统计不同时间携带线虫的天牛数量以及天牛携带线虫数量的变化。【结果】在黄山市博村林场共收集到4个亚科12个属的14种天牛,通过线虫分离实验确定可以携带线虫的天牛主要有2种:松墨天牛(Monochamus alternatus)和小灰长角天牛(Acanthocinus griseus),2种天牛整体线虫携带率分别为45.8%和13.6%,通过形态学观察松墨天牛和小灰长角天牛均可携带两种不同形态的扩散型线虫,一种是尖尾形线虫,另一种则是圆尾形线虫。尖尾形线虫通过形态学和松材线虫分子检测鉴定被确定为松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus),而圆尾形线虫则通过形态学和系统发育树结果被确定为Contortylenchus sp.类线虫。6月19日至7月23日每周线虫分离试验结果表明,松墨天牛雌成虫携带线虫的比例依次为76.5%、66.0%、52.9%、34.7%和10.0%;松墨天牛雄成虫携带线虫的比例依次为76.5%、60.0%、50.0%、30.8%和14.7%,松墨天牛雌成虫携带线虫的数量依次为1 018.0、530.1、202.5、200.4和80.0条/头,松墨天牛雄成虫携带线虫的数量依次为495.1、68.3、74.9、8.2和3.8条/头。【结论】黄山市博村林场马尾松林内共收集到14种天牛,其中松墨天牛和小灰长角天牛都可以携带松材线虫和Contortylenchus sp.类线虫,但以松墨天牛为主,松墨天牛携带线虫的数量和比例随携带时间推移逐渐减少。     

马尾松松材线虫病抗性无性系的筛选和遗传多样性分析

【目的】 松材线虫病是松属致命性的世界检疫性森林病害。筛选和创新抗性遗传资源是马尾松抗松材线虫病育种的重要基础。松材线虫病重灾疫区自然淘汰存留下来的马尾松资源,可能是开展马尾松抗松材线虫病育种潜在的重要遗传基础,值得进一步深入挖掘、系统评价和开发利用。本研究通过对110个对松材线虫病具有抗性表型的无性系进行遗传多样性、生长性状测定和保存率调查,综合评价其在抗性育种中的潜在价值。【方法】 通过接种松材线虫对马尾松的1 201个初选无性系进行筛选,并对110个具有抗线虫表型的重选无性系进行遗传多样性RAPD和生长性状评价。从14对SCAR分子标记引物中筛选通用性强、多态性位点高的两组引物,用于MuPS(Multiplex-PCR of SCAR markers) 反应扩增和遗传多态性位点检测。基于79个MuPS唯一型无性系群体,采用Popgene 32软件估算的遗传多样性,结合生长量和存活率指标,评估该批遗传资源在马尾松抗性育种中的潜在价值。【结果】 初选的1 201个无性系(来自251个马尾松初选家系),经松材线虫接种筛选后,获得110个无性系(来自初选家系中的81个),由两组引物扩增得到92种MuPS分型。其中,有79个无性系为单一的MuPS分型所完全准确识别(占71.81%)。基于79个具单一MuPS分型的无性系群体遗传多样性分析表明,群体所有位点的平均有效等位基因数(N_e)为1.508 1个,Nei’s基因多样度(H)为0.302 3,Shannon多样性指数(I)为0.459 1。无性系体间遗传参数差异明显,N_e变幅为1.012 8~1.998 1,H变幅为0.012 6~0.499 5,I变幅为0.038 5~0.692 7。具有抗松材线虫病表型的110个马尾松无性系存活83个。保存无性系间其生长性状存在显著差异,树高、胸径和单株材积生长量变幅分别为4.6~10.7 m,6.7~21.7 cm和0.012 3~0.189 4 m³,生长量最大的休3-3号无性系立木材积(0.189 4m³)为最小的无性系广27-2的(0.012 3 m³)15倍以上。【结论】 马尾松1 201个初选无性系,经野外人工接种松材线虫的抗性筛选后,110个无性系表现出对松材线虫病有显著的抗性表型,占初选无性系的9.09%。这些经过抗性筛选的无性系在材积生长性状上达到了极显著差异水平。这意味着在抗性改良基础上,进行生长量改良的策略是可行的。与已有的天然和人工育种群体的遗传多样性参数相比,本研究虽然经初选和抗性复选淘汰了90%以上的无性系,仍保留了群体中较高的遗传多样性。综上,笔者认为这批初选资源经抗性筛选存留的遗传资源,在马尾松抗松材线虫病育种研究中具有明显的潜在价值。     

木腐真菌对松材线虫病疫木处理初探

【目的】筛选在疫木中迅速定殖扩展且能抑制松材线虫生长和繁殖的木腐真菌,在抑制松材线虫生长的同时快速降解疫木的木材成分,从而实现疫木中松材线虫在被媒介昆虫传带前就被大幅减少或不能正常进入蛹室,即在侵染循环的疫木环节即被阻断的目标,为松材线虫病的有效防控提供参考。【方法】分别将2 000条松材线虫接种至培养成熟的不同木腐真菌菌落上,通过室内平板试验测定不同木腐真菌对松材线虫生长和繁殖的影响;其次,将黑松木块接种至筛选获得具有抑制松材线虫生长和繁殖作用的木腐真菌菌落上,探究其对黑松木材的降解作用。以此筛选出能明显影响松材线虫生长繁殖且具有分解木材能力的优良木腐真菌;最后将筛选获得的优良木腐真菌经大量液体培养和固体培养繁殖后接种至田间当年染松材线虫病60 cm长的伐倒松木木段上,分别于接种后的120和150 d用电钻钻孔取木样,后将木段劈开,收集天牛蛀道周围的木样,分离并统计木样内松材线虫数量,比较接种前后疫木内松材线虫数量的变化,分析木腐真菌对疫木中松材线虫种群的影响。【结果】在室内培养茯苓菌的平板上松材线虫不能成活,在黄孢原毛平革菌、B18、C11和D16菌落上松材线虫的生长和繁殖也明显受到抑制。以接种茯苓菌后木材的质量损失率最大(7.30%),其分解纤维素和半纤维素能力也最强,分解率分别为19.21% 和29.65%;分解木质素能力最强的为黄孢原毛平革菌,分解率达到31.59%。在田间接种试验中,接种同种木腐真菌,以接种液体培养菌丝的效果优于接种固体培养菌丝的。不同木腐真菌中,以接种茯苓后减少疫木内的松材线虫数量显著优于接种其他木腐真菌处理的。接种茯苓液体培养菌丝和固体培养菌丝150 d后,均可最大程度减少疫木内松材线虫数量,减少率分别为74.51% 和65.78%。接种茯苓液体培养菌丝后天牛蛀道的松材线虫数量较接种前减少了65.45%。【结论】茯苓在室内外分解松木和减少疫木内松材线虫两方面效果均最佳;同种木腐真菌,以接种液体培养菌丝的效果优于接种固体培养菌丝的。研究表明,采用不利于松材线虫生长和繁殖的木腐真菌进行松材线虫病的疫木除治具有技术可行性和广阔的应用前景。     

利用腐生线虫加速替代疫木中松材线虫种群数量研究

【目的】筛选在疫木中容易定殖且能够加快树体内松材线虫种群消退的腐生线虫,在媒介昆虫羽化前大幅减少疫木中松材线虫种群数量,使得松材线虫病害的传播得到有效控制。【方法】从安徽、四川和江苏3省的部分疫区采集的疫木中分离获得8种腐生线虫。将8种腐生线虫以1、2、4倍于木块中松材线虫数量的接种量接种至疫木块中,以接种无菌水的木块为对照,分别置于15和25 ℃下培养15和30 d,分离并计数疫木块中松材线虫和腐生线虫的种群数量,分析不同接种量及温度下,接种腐生线虫对疫木中松材线虫种群数量的影响。野外条件下,将8种腐生线虫接种至松材线虫病疫木段中,接种量为2.0×10⁵~2.5×10⁵条,以接种无菌水的木段作为对照。120 d后钻取木样,150 d后捕获松墨天牛并收集蛹室周围木样,分离并计数木样中的松材线虫数量,比较接种前后疫木内松材线虫数量的变化,分析腐生线虫对疫木整体、天牛及蛹室周围携带的松材线虫种群的影响。【结果】室内接种试验表明,15 ℃培养时,在第30 天接种量为4倍的虫株JHS2处理组和接种量为1倍的虫株JHS4处理组能显著降低松材线虫的数量。25 ℃条件下培养的第15 天,3种不同接种量的虫株JHS4处理组中松材线虫减少率均显著高于对照。培养 30 d后,接种量为4倍的虫株JHS4处理木块中松材线虫减少率显著高于对照,为对照的2.9倍。野外接种试验结果表明接种虫株JHS4能加速木段内松材线虫的消亡,与对照相比,木段整体松材线虫的减少率为96%,显著高于同期对照(74%);此外,所有处理组的蛹室周围木样和羽化天牛所携带的松材线虫量均低于对照。其中,虫株JHS4处理组蛹室周围木样和羽化天牛携带的松材线虫数量最低,每克蛹室木样中携带松材线虫的数量仅为20 条,平均每头天牛携带松材线虫的数量为132条。【结论】腐生线虫能够加快疫木中松材线虫种群消退,可影响天牛蛹室及天牛所携带的松材线虫数量。利用腐生线虫对疫木中松材线虫具有一定的生防潜力,将其应用于松材线虫病的疫木除治具有技术可行性和广阔前景。     

内源抑制物对加拿大紫荆种子萌发的影响

【目的】探究内源抑制物质对加拿大紫荆(Cercis canadensis)种子萌发的影响,为揭示加拿大紫荆种子的休眠原因及其解除机制提供依据。【方法】以加拿大紫荆种子为试验材料,先采用80 ℃热水预处理,再经低温层积处理解除种子的生理休眠,对不同层积阶段的种子进行发芽率和生物活性测定。结合气质联用(GC-MS)、高效液相色谱(HPLC)技术与标准品有效半抑制浓度(IC₅₀)方法,分析加拿大紫荆种子内源抑制物种类及休眠解除过程中内源抑制物含量的变化。【结果】内源抑制物是引起加拿大紫荆种子休眠的主要原因,随着层积时间延长,休眠逐渐解除。加拿大紫荆种子种皮和胚乳各分离相提取液对白菜籽发芽抑制作用由大到小依次为乙醚相>甲醇相>水相≈乙酸乙酯相>石油醚相,表明种皮和胚乳中的内源抑制物主要存在于乙醚相、甲醇相、乙酸乙酯相提取液中。采用GC-MS技术测得加拿大紫荆种皮和胚乳分离相提取液中主要有油酸、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸、2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)、邻苯三酚6种可能对加拿大紫荆种子具有抑制作用的物质。对6种物质标准品进行有效半抑制浓度(IC₅₀)测定发现:油酸对白菜籽发芽无抑制作用,较高浓度的亚油酸、棕榈酸、硬脂酸才能抑制白菜籽发芽,而较低浓度的BHT和邻苯三酚对白菜籽发芽就有很强的抑制作用。种子休眠解除过程中,亚油酸含量呈先下降后上升再下降的趋势,而棕榈酸、硬脂酸、BHT、邻苯三酚的含量逐渐下降,层积后的4种物质含量下降幅度分别为42.43%、52.00%、5.77%、96.14%。【结论】结合IC₅₀及层积过程中内源抑制物含量的变化,认为邻苯三酚可能是引起加拿大紫荆种子休眠的主要抑制物质。     

龙爪槐枝干溃疡病的病原研究

【目的】鉴定龙爪槐枝干溃疡病的病原菌。【方法】采用组织分离法从龙爪槐枝干溃疡病病枝获得疑似病原菌,并通过野外致病性测定该病原菌,结合该病原菌的形态学特征、rDNA-ITS和EF-α基因序列分析,进行病原菌的种类鉴定。【结果】完成了F6菌株致病性分析的科赫法则实验,证实了其致病性; 鉴定该菌为腐皮镰孢菌复合种[Fusarium solani species complex(FSSC)]。【结论】腐皮镰孢菌复合种(FSSC)为引起龙爪槐枝干溃疡病的病原菌。     

鞭毛蛋白毒素导致的黑松超微结构病理学变化

【目的】以松材线虫、致病细菌荧光假单胞菌及其鞭毛蛋白毒素、非致病细菌缓慢葡萄球菌等材料对3年生黑松进行接种试验,通过其样枝切片的超微结构病理学变化,了解致病细菌毒素在松萎蔫病中的作用。【方法】分别以野生松材线虫悬液、荧光假单胞菌菌株GcM5-1A无细胞滤液、无菌松材线虫+荧光假单胞菌菌株GcM5-1A、荧光假单胞菌菌株GcM5-1A的鞭毛蛋白毒素Flg、无菌松材线虫+缓慢葡萄球菌菌株AM2C、无菌松材线虫悬液接种黑松,以健康松树为对照。对于发病的处理,在接种后病程的第2或第3阶段取样; 对于未发病的处理,则在接种11 d后取样。取样时,在距离接种点不同位置进行,然后制备透射电镜样品,观察这些切片的超微结构变化。【结果】野生松材线虫、GcM5-1A无细胞滤液、无菌松材线虫+GcM5-1A、GcM5-1A鞭毛蛋白毒素等4种处理下黑松树体组织的超微结构均遭受严重破坏,病理学变化趋势一致。无菌松材线虫、无菌松材线虫+AM2C等两种处理下树体组织基本未遭受破坏,超微结构观察结果与健康松树的基本一致。GcM5-1A无细胞滤液与野生松材线虫的处理中,在靠近接种点处,前者处理下切片的超微结构受害比后者严重; 在远离接种点处,前者受害反而比后者轻。通过GcM5-1A无细胞滤液与野生松材线虫接种观察结果比较,发现松材线虫在树体内的移动加速了致病菌的扩散,导致毒素的增产和扩散,加速了松树的死亡。【结论】在接种处理的第2阶段是松萎蔫病发展的关键阶段。无菌松材线虫不能致死松树,而松材线虫携带的致病细菌产生的毒素是致死松树的真正原因,验证了松萎蔫病是松材线虫与其携带致病细菌的复合侵染导致病害的假说,而松材线虫在树体内的移动加速了致病菌的扩散,最终导致松树加速死亡。     

细胞自噬对松材线虫繁殖存活的影响及线虫与松树互作早期自噬相关基因的表达

【目的】细胞自噬在真核生物细胞应对不良环境中具有重要作用。探讨细胞自噬对松材线虫取食繁殖的影响,测定松材线虫与松树互作过程中松材线虫BxATG1和BxATG8两个自噬相关基因的表达。【方法】在前期研究发现松材线虫存在细胞自噬现象,并克隆了松材线虫BxATG1和BxATG8两个自噬相关基因的基础上,采用外源自噬诱导剂探讨了细胞自噬对松材线虫取食繁殖的影响,测定了松材线虫与松树互作早期自噬相关基因的表达。【结果】经雷帕霉素处理后,松材线虫的自噬启动基因BxATG1和自噬标志性基因BxATG8表达量显著上调,且松材线虫的取食速率及繁殖量也显著增加; 松材线虫在饥饿状态下的存活能力明显上升,脂肪含量的堆积也略有增加。松材线虫与松树互作早期(6、12、18、24 h)的qRT-PCR结果表明,松材线虫侵染松树12 h时,细胞自噬爆发达到最高峰。【结论】外源自噬诱导后促进了松材线虫细胞自噬的发生; 细胞自噬在促进松材线虫生长发育中具有一定作用; 在松材线虫侵染松树过程中,细胞自噬有助于线虫适应松树的早期抵抗反应。