含外显子8的prosaposin蛋白亚型与Rhox5蛋白间的相互作用

研究含外显子8的prosaposin蛋白亚型(PsapE8)与同源异型框蛋白Rhox5蛋白间的相互作用. 重叠延伸PCR法扩增PsapE8的cDNA序列,将其按照通读框方式分别克隆至pGBKT7和pGADT7酵母双杂交载体中构建pGBKT7-PsapE8和 pGADT7-PsapE8重组质粒. 酵母双杂交实验检测PsapE8与Rhox5蛋白在酵母体内的结合;体外转录翻译S35标记的PsapE8蛋白,GST pull-down实验检测PsapE8与Rhox5蛋白在体外的结合情况. 成功地构建了pGBKT7-PsapE8和 pGADT7-PsapE8重组质粒,酵母双杂交实验表明PsapE8蛋白在酵母体内可以结合Rhox5蛋白;GST pull-down实验再次验证了两者在体外的结合;表明含有外显子8的prosaposin蛋白亚型PsapE8可以与Rhox5蛋白相结合.     

GST pull-down技术验证CIPK7蛋白激酶与CBL1蛋白的相互作用

采用DNA重组技术,构建pGEX-4T-3-CIPK7和pET28-CBL1蛋白表达载体,转化大肠杆菌并诱导表达目的蛋白,利用亲和层析纯化法纯化GST标签、His标签融合蛋白,通过GST pull-down试验验证CIPK7与CBL1之间的相互作用.成功构建了CBL1和CIPK7的重组质粒,经诱导表达及纯化获得了可溶性GSTCIPK7和CBL1-His融合蛋白,GST pull-down试验证实了CBL1能够与CIPK7结合.CIPK7蛋白与CBL1蛋白之间存在直接的相互作用,为进一步研究蛋白激酶CIPK7的功能奠定了基础.     

NF-κB相互作用多肽原核表达载体的构建、表达与纯化

为了获得高纯度的可溶性NF-κB相互作用多肽,首先以酵母双杂交技术筛选获得的NF-κB相互作用多肽的酵母表达质粒pGAD GH/pp10为模板,扩增多肽基因片段,后经BglⅡ,StuⅠ双酶切后连接到pET-42a(+)载体中,构建GST/多肽融合蛋白的原核表达载体,并将GST/多肽融合蛋白的原核表达载体转化入BL-21菌株,用0.4 mmol/L IPTG于30 ℃诱导表达4 h,后经GST亲和纯化GST/多肽融合蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定融合蛋白的表达和纯度.实验结果表明,成功地构建了NF-κB相互作用多肽的GST/多肽融合蛋白原核表达载体,进行了GST/多肽融合蛋白的诱导表达,融合蛋白的表达为可溶性表达,最终纯化获得纯度约为80%的可溶性GST/多肽融合蛋白,这将为后继利用GST pull-down,Bio-sensor,EMSA等实验进一步验证NF-κB相互作用多肽的功能提供可靠的材料来源奠定基础.     

利用泛素分裂系统筛选AtTR1相互作用蛋白质

以AtTR1作为诱饵蛋白利用泛素分裂系统在拟南芥cDNA文库中筛选与拟南芥AtTR1基因相互作用的蛋白质.运用营养缺陷型培养基和X-Gal显色、PCR扩增及酶切分析等实验排除假阳性,并对阳性克隆进行序列测定和比对.通过泛素分裂系统筛选到可靠的AtTR1相互作用蛋白质,测序比对后,选取HMA与AtTR1通过GST pull-down进行进一步的验证,结果证明它们确实存在相互作用,这对进一步研究AtTR1及其相互作用蛋白质在植物耐热中的作用和耐热分子机制奠定了基础.     

酵母双杂交系统筛选与AtTR1相互作用的蛋白

AtTR1是拟南芥中发现的与植物高温和高盐等非生物胁迫相关的全新基因.采用GAL4酵母双杂交系统,以AtTR1作为诱饵蛋白,对拟南芥cDNA文库进行筛选,获得了与AtTR1有潜在相互作用的蛋白质PATL6 (Patellin6).进一步采用GST pulldown方法在体外验证了PATL6与AtTR1的相互作用.采用Realtime PCR检测PATL6在NaCl和Mannitol处理后的表达情况,结果显示PATL6的表达受高盐和高渗的诱导,是一个与非生物胁迫应答相关的基因.这些实验结果为进     

睾丸生殖细胞瘤易感基因Dnd1互作蛋白质的筛选与鉴定

小鼠睾丸生殖细胞瘤（testicular germ cell tumour,TGCT）易感基因Dnd1属于RNA结合蛋白基因家族成员．Dnd1在进化中具有保守性,Dnd1缺乏导致小鼠原始生殖细胞（primordial germcell,PGC）的丧失、TGCT的发生和部分胚胎死亡,但Dnd1作用机制还未明了．利用酵母双杂交系统,构建小鼠Dnd1基因诱饵载体pDBLeu-Dnd1,筛选10．5d的小鼠胚胎cDNA文库,成功筛选到4个与Dnd1相互作用蛋白,其中之一为原癌基因Jun蛋白;进一步的酵母双杂交实验和GST pull down实验再次确认Dnd1与Jun蛋白之间的相互作用．研究发现Dnd1新的相互作用蛋白,这为探明其信号传导通路及Dnd1致病机制研究建立了基础．     

结核分枝杆菌ICL抑制CTBP1表达并促进细胞凋亡

异柠檬酸裂合酶(Isocitrate Lyase,ICL)参与乙醛酸循环,是结核分枝杆菌能在宿主体内潜伏的关键因素之一.为了探索ICL在结核菌与宿主相互作用中的地位,首先通过酵母双杂交技术在人淋巴细胞cDNA文库中筛选得到一个新的ICL相互作用蛋白CTBP1(C Terminal Binding Protein 1).然后分别采用GST pull-down和Co-IP实验证实了这两个蛋白在体外和体内与ICL相互作用的特异性.通过使ICL在HEK293T细胞中过表达,发现内源性CTBP1在转录水平和蛋白水平的表达都受到了抑制,同时导致细胞增殖减缓、凋亡加快,并出现G2/M期阻滞等改变.这些结果表明,结核菌ICL在参与介导细胞凋亡、影响宿主细胞活性的过程中起着重要的作用.     

拟南芥富天冬酰胺蛋白NRP与PP6型磷酸酶FyPP3具有相互作用

NRP是植物体内被研究发现具有响应胁迫并会引起细胞凋亡的一个蛋白.Fy PP3在植物体内作为一种PP6型的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶,可以对Phy A、PIN以及ABI5等蛋白进行去磷酸化修饰,并调控各种响应途径.本文通过酵母双杂交实验发现NRP与Fy PP3之间具有相互作用,且通过GST pull-down验证.随后通过烟草瞬时转化实验,发现NRP定位在细胞质中,Fy PP3同时出现在细胞质与细胞核中,当二者同时存在时,共定位发生在细胞质中.说明NRP与Fy PP3是有相互作用的,且这样的相互作用是发生在细胞质中的.     

拟南芥AtDWD与ABI2相互作用的初步研究

本文以RCAR1为诱饵蛋白通过酵母双杂交（Y2H）技术筛选出了DWD基因编码的蛋白,同时在用ABI2参与筛选的过程中,同样得到了DWD这个基因. 进行了pull down 实验验证它们之间的相互作用,实验结果显示：在体外,RCAR1、RCAR3与DWD之间确实存在相互作用,同时ABI2与DWD也存在相互作用. 其后对DWD结构的进行分析和实验,发现ABI2和DWD的相互作用区域集中在AtDWDC端,大概是145~350位氨基酸之间的WD40结构域里.     

人类线粒体转录因子B1和B2与裂殖酵母线粒体转录聚合酶Rpo41相互作用的初步研究

由L02型人肝脏细胞cDNA通过PCR技术获取到线粒体转录因子B1和B2的ORF片段(NM_022366和NM_016020);构建表达质粒pGEX-4t-1/GST-mtTFB1及pMAL-c-2X/MBP-mtTFB2,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经亲和层析,分子筛和阳离子交换柱得到纯度较高的蛋白.利用体外pull-down实验证实TFB1和TFB2均与来源于裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的线粒体RNA聚合酶(Rpo41)存在分子间相互作用.在裂殖酵母中过表达h-TFB1和h-TFB2,利用实时荧光定量PCR检测,2个蛋白在酵母体内均对线粒体基因转录产生影响.