金黄色葡萄球菌sPP2C的克隆、表达及性质研究

从金黄色葡萄球菌基因文库中克隆了一条新的双特异性磷酸酶，命名为sPP2C (protein phosphatase 2C, Staphylococcus aureus). sPP2C基因具有741个碱基，编码的蛋白有247个氨基酸，具有一个蛋白磷酸酶2C的催化结构域.sPP2C的分子量为26.1 kD，等电点为4.95.在E.Coli. Rossetta中表达蛋白sPP2C.高纯度的sPP2C用亲和层析的方法纯化得到.酶学研究结果表明：sPP2C对磷酸酶的通用底物硝基苯磷酸 (p-nitrophenyl　phosphate, pNPP)不起作用，而与pSer/Thr和pTyr的寡肽均有去磷酸化作用.这些实验结果说明sPP2C是一个新的双特异性磷酸酶.     

不带电荷极性氨基酸对兔肝中碱性磷酸酶活性的影响

采用生物化学方法中的有机溶剂分级沉淀法,对碱性磷酸酶进行了分离纯化,用金氏法测定其活性,并用Folin-酚法测定酶含量,然后筛选碱性磷酸酶的最适pH值和最适温度。在此条件下研究不带电荷极性氨基酸对兔肝中碱性磷酸酶活性的影响。结果表明,兔肝中碱性磷酸酶的最适pH值为9.84,最适温度为39℃。在不带电荷极性氨基酸中甘氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和天冬酰胺对碱性磷酸酶的活性有不同的抑制作用,而丝氨酸对碱性磷酸酶的活性有激活作用,这说明不带电荷极性氨基酸对酶活性抑制或激活作用与其侧链基团有关。     

21日龄鸡胚中金黄色葡萄球菌的PCR检测

为检测某鸡场21日龄鸡胚金黄色葡萄球菌感染情况, 针对其特有的耐热核酸酶基因(Nuc)设计并合成1对引物进行PCR扩增, 建立特异性检测金黄色葡萄球菌的PCR方法. 对18个21日龄鸡胚培养、分离, 获得18株疑似金黄色葡萄球菌菌落. 用建立的PCR方法对18份疑似样品进行扩增获得4份金黄色葡萄球菌的阳性扩增, 证实该鸡群21日龄鸡胚中金黄色葡萄球菌的感染率为22%(4/18). 本文中基于Nuc基因建立的PCR检测方法是检测鸡胚中金黄色葡萄球菌快速、特异的分子生物学方法.     

齐墩果酸衍生物的合成与表征及其抑菌活性的研究

齐墩果酸属于五环三萜类化合物,在自然界中分布广泛,并显示出多种生物活性,如:保肝、抗炎、抗病毒、抗癌等多种药理作用,并具有良好的抑菌活性.因此本文以齐墩果酸为先导化合物,对其结构进行了修饰,合成4个中间体和6个新的目标产物,并经过IR、1 H NMR波谱测试技术对其结构进行了表征.并以其对培养于MHB(高铁血红蛋白)的S.a(金黄色葡萄球菌)4220、S.a(金黄色葡萄球菌)209、MRSA(抗甲氧西林金黄色葡萄球菌)3167、MRSA(抗甲氧西林金黄色葡萄球菌)3506、QRSA(抗喹诺酮金黄色葡萄球菌)3505、QRSA(抗喹诺酮金黄色葡萄球菌)3519和培养于BHI中的E.coli(大肠杆菌)1682、E.coli(大肠杆菌)1356等8种菌种进行抑菌活性测试,结果表明,部分化合物的抑菌活性较标准抗菌药物有明显提高.     

僧帽牡蛎(Ostreu cucullata)碱性磷酸酶的酶学特性

本文对僧帽牡蛎(Ostrea cucullata)碱性磷酸酶的酶学特性进行了若干探索. 实验结果表明,碱性磷酸酶的最适pH与所用的废物有关,以磷酸苯二钠为底物时,酶的最适pH为10.3,而以β-甘油磷酸钠为底物时,则降为9.5.所得结果证实,pH对酶的影响有可逆和不可逆之分,在pH8.5—10.0范围内,pH对酶的影响是可逆的,而当pH大于10.5时,则为不可逆, 实验求得,僧帽牡蛎碱性磷酸酶对磷酸苯二钠作用的Km值为1.9×10~(-4)M,在10-50℃时.酶对磷酸苯二钠反应的“活化能”为9550卡/克分子。酶在30℃以下活性稳定,最适温度区在39℃附近;50℃保温一段时间,酶活力大大降低. 僧帽特蛎的碱性磷酸酶与从其它材料获得的碱性磷酸酶一样,可被镁离子激活:其最适激活浓度为8.33mM,但被汞离子,锌离子,氰化物和半胱氨酸强烈抑制.氟化物和钼酸盐对酶的影响不明显.     

乳粉中常见致病菌的多重荧光PCR检测

利用多重荧光PCR技术快速检测乳粉中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌.以沙门氏菌的invA基因、志贺氏菌的ipaH基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因为靶基因,选择特异性引物,以参照菌种为对象,验证引物的特异性,建立多重荧光PCR检测方法,人工添加沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌,确定方法的检出限.结果表明该方法特异性强、灵敏度高,乳粉中检测的灵敏度为1CFU/mL,可在8h内完成对乳品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌的检测.     

PCR技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素D基因

根据金黄色葡萄球菌肠毒素Ｄ基因的序列,设计相应的引物,建立检测金黄色葡萄球菌肠毒素Ｄ基因的ＰＣＲ技术。利用该方法可从含有肠毒素Ｄ基因的金黄色葡萄球菌中扩增出ＰＣＲ产物。扩增产物具有特异性,长为３１６个碱基对。经限制性核酸内切酶ＨｈＩⅠ酶切证实扩增产物为ＳＥＤ基因片段。     

类志贺邻单胞菌噬菌体ФP4-7裂解酶Gp2的表达及活性测定

多重耐药菌株的出现给临床治疗带来了困难,噬菌体编码的裂解酶能够杀死病原菌,是潜在的重要杀菌因子.本实验采用PCR技术,扩增类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)噬菌体ФP4-7裂解酶gp2基因并克隆至质粒p QE30上进行表达,重组蛋白采用Ni-NTA亲和层析法进行纯化.重组裂解酶Gp2最适反应p H为9;裂解酶40,℃保温15,min,酶活剩余56.4%,.底物专一性实验结果显示,该裂解酶能够高效裂解5种革兰氏阴性菌,即铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii),以及3种革兰氏阳性菌,即金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis).杀菌实验结果表明,裂解酶Gp2可与EDTA、LAB-35以及SDS配合使用,进一步提高该酶对铜绿假单胞菌和枯草芽胞杆菌的杀菌活性.裂解酶Gp2具有高效广谱裂菌活性,具有潜在的应用价值.     

临床分离MRSA中氨基糖苷类双功能修饰酶AAC(6)′-APH(2″)的克隆表达与活性测定

双功能酶AAC(6′)-APH(2″)是一种重要的氨基糖苷类抗生素钝化酶,从临床分离出的6株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的总DNA中克隆得到AAC(6′)-APH(2″)基因,将该基因插入质粒pET-28a中构建表达载体,然后将该重组质粒转入大肠杆菌BL21进行异源表达,在IPTG的诱导下产生大量可溶性目标重组蛋白,该重组蛋白经亲和层析分离纯化,SDS-PAGE鉴定纯度大于90%;建立了此双功能酶的体外测活方法,为建立氨基糖苷类抗生素双功能酶抑制剂筛选模型奠定基础.     

长瓣金莲花中原金莲酸的分离和生物活性

目的 :研究长瓣金莲花 (TrolliuschinensisBunge)中非黄酮类成分的抑菌和抗病毒活性 .方法 :用柱层析等手段分离化学成分 ,并用波谱手段作结构鉴定 ;用微量稀释法作体外抑菌和抗病毒活性研究 .结果 :从长瓣金莲花中提取分离出原金莲酸 ;原金莲酸对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的最低抑菌质量浓度为 0 2mg/mL ,对A型流感病毒的半抑制质量浓度为 184 2 μg/mL ,治疗指数为 4 0 .结论 :原金莲酸对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌有抑制活性 ,对A型流感病毒有弱的抑制活性 .     

不同磷条件下斜生栅藻胞外ALP和ACP的变化

不同培养液磷的含量对斜生栅藻胞外ALP、ACP的活性有显著影响,在磷胁迫时,胞外ALP的活性显著增加,ACP的活性有类似的变化,但上升幅度小于ALP。在有机磷存在时,ALP的活性变化与磷胁迫时相近,而ACP对不同磷源的变化反应不明显。pH对斜生栅藻胞外ALP和ACP的影响不明显,但可以显著提高胞外CA活性。     

饥饿应激对泥鳅3种组织糖原,ACP和ALP的影响

研究了饥饿应激对泥鳅肝、肠和肌肉3种组织细胞糖原、酸性和碱性磷酸酶的细胞化学变化.对泥鳅进行饥饿处理,0~28 d不喂养食物,29~35 d恢复正常喂食.分别于0、7、14、21、28和35 d取材,利用显微石蜡切片、组织化学染色的方法检测其肝、肠和肌肉细胞糖原、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶细胞化学特征.结果表明:随着饥饿程度的加深,糖原的量减少,碱性磷酸酶活性下降,酸性磷酸酶活性则增强.投喂后,糖原量、酸性和碱性磷酸酶活性都有不同程度的恢复.整个过程中,上述变化存在组织差异性.泥鳅中糖原量、酸性和碱性磷酸酶活性均与长期饥饿条件下机体的应激反应有关.     

长期饥饿和再投喂对泥鳅不同组织糖原、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的影响

研究长期饥饿和再投喂对泥鳅肝、消化道和肌肉3种组织细胞糖原、酸性和碱性磷酸酶的细胞化学变化.对泥鳅进行饥饿处理,0～28 d不喂养食物,29～35 d恢复正常喂食.分别于0,7,14,21,28和35 d取材,利用显微石蜡切片、组织化学染色的方法检测其肝、消化道和肌肉细胞糖原、酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(ALP)细胞化学特征.结果表明,随着饥饿程度的加深,糖原的量减少,碱性磷酸酶活性下降,酸性磷酸酶活性则增强,投喂后,糖原量、酸性和碱性磷酸酶活性都有不同程度的恢复.整个过程中,它们的变化存在组织差异.泥鳅中酸性和碱性磷酸酶均与长期饥饿条件下机体的应激反应有关.     

人原发性骨肉瘤移植瘤的超微结构和碱性磷酸酶的定位研究

用透射电镜观察人原发性骨肉瘤及其移植瘤的超微结构及碱性磷酸酶的活性变化,实验结果发现第1至第7代移植瘤的超微结构和碱性磷酸酶活性与对照组原发瘤一致;第9代以后的移植瘤的碱性磷酸酶含量明显减少,而细胞超微结构仍具有原发瘤细胞的一些特点,因而证明在本实验条件下,第1至第7代移植瘤可以作为骨肉瘤生物学特性和进一步实验治疗研究的良好材料.     

凡纳对虾体内ACP、AKP酶的细胞化学定位

运用电镜酶细胞化学技术对凡纳对虾体内肝脏(L)、肌肉(M)、心脏(H)和复眼(E)等四种组织的酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)进行了细胞化学定位,并与感染病毒的凡纳对虾四种组织中ACP、AKP的细胞化学定位进行比较.结果显示,在健康的对虾体内,ACP依次出现在各组织中的溶酶体、细胞核、细胞内膜、线粒体、内质网以及肝脏组织中的部分脂滴周围及微绒毛中AKP依次出现在各组织中的细胞膜、细胞核、溶酶体、内质网以及肝脏组织中的脂滴周围及微绒毛中.感染病毒后,对虾体内组织细胞出现了明显的病理变化,各组织细胞内均出现大量的髓样小体;各组织中ACP,AKP的超微细胞化学定位也发生了明显的规律性变化,表现为相应细胞器内ACP,AKP酶活性均减弱或消失,并在多数组织的细胞质中检测到ACP,AKP酶活性的高电子密度颗粒,且大量出现的髓样小体均呈阳性反应.     

小鼠生长过程中肝AKP的活性变化及细胞定位

用比色法、酶的原位复性电泳、组织化学和细胞化学方法等分析观察了小鼠生长过程中肝碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)同工酶变化和细胞定位.比色法和细胞化学法研究表明,在小鼠生长过程中,出生第 7天小鼠(D7)肝的AKP活性最强,成体肝(Da)活性最弱; AKP活性在肝小叶内带、中带、外带中的活性呈依次减弱的趋势;细胞化学显示,AKP活性主要出现在肝实质细胞的细胞膜上,尤以胆小管周围的细胞膜上最多.用酶的原位复性电泳测得小鼠生长过程中共出现四条AKP同工酶带,各同工酶活性随着小鼠的生长发育时间不同而发生变化.     

LD含量和LDH、ACP、ALP、TCHE活性在有氧运动影响下的变化

为了探讨有氧运动对人体在不同功能状态下血乳酸（LD）代谢和乳酸脱氢酶（LDH）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（ALP）、乙酰胆碱脂酶（TCHE）活性的影响，对12名业余长跑大学生和12名普通大学生进行了对比研究，结果发现：安静时，血清LD含量、LDH、ACP活性无组间差异，长跑组ALP活性低于对照组，而TCHE活性高于对照组（P＞0.05）；定量负荷后，长跑组血清LD含量明显低于对照组、LDH活性明显高于对照组（P＜0.05），ACP活性高于对照组、ALP活性低于对照组（P＞0.05），TCHE活性无组间差异；力竭性运动后，长跑组LD含量和LDH活性极明显高于对照组（P＜0.001），TCHE活性高于对照组（P＞0.05），ACP、ALP活性无组间差异，以上表明长跑运动对机体在运动状态下的血乳酸代谢和LDH活性有显著的影响，但对ACP、ALP、TCHE活性无明显作用。     

MNNG诱发大鼠胃癌前期肝中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶同工酶变化的冰冻切片观察

用冰冻切片技术对MNNG诱发Wistar大鼠胃癌前期肝中碱性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)的变化进行观察．结果表明：(1)ALP、ACP的定位在处理组与对照组间无明显变化；(2)处理组比对照组ALP、ACP的活性增强；(3)处理组间比较，ALP、ACP的活性有上升趋势．结果提示，在胃癌的诱发过程中ALP、ACP的含量的增加和活性的增强有利于细胞维持正常的生理功能．ALP、ACP的含量和活性的变化有望成为肿瘤诊断、预后的辅助因子，有一定的研究价值。     

萝卜贮藏期间蛋白水解酶及磷酸酶同工酶谱研究

用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分离在不同贮藏期三个品种的萝卜块根的蛋白水解酶及磷酸酶后 ,用特异染色方法检测酶活性及同工酶谱变化 ,实验结果表明 :在不同贮藏期的同一品种萝卜及同一贮藏期的不同品种萝卜之间蛋白水解酶同工酶谱变化较大 ,最适pH均为 7.0 ;酸性磷酸酶同工酶谱也有较大变化 ,碱性磷酸酶谱缺失。萝卜贮藏期存在活跃的蛋白水解酶及磷酸酶的活动。