苏丹黑B染色法原位检测2株淡水小球藻胞内油脂累积

以2株淡水小球藻Chlorella pyrenoidosa XJ01和Chlorella sorokiniana XJ02为研究对象,对苏丹黑B染色法测定微藻胞内油脂质量分数的条件进行优化,建立苏丹黑B染色法原位测定微藻油脂的方法;并在通气条件下,检测微藻脂质质量分数及脂质累积过程。研究结果表明:当辅助染色破壁的盐酸浓度为1.0 mol/L,染色时间和温度分别为10 min和100℃时,苏丹黑B染色效果最好;在不同生长阶段,C.sorokiniana XJ02胞内油脂质量分数均比C.pyrenoidosa XJ01的高;此外,2株藻胞内油脂质量分数在对数生长期中期开始快速增加,到生长稳定期油脂质量分数达到最高,C.pyrenoidosa XJ01和C.sorokiniana XJ02油脂质量分数最高分别为25%和38.2%,随后油脂质量分数开始缓慢降低;利用苏丹黑B将微藻细胞染色后在显微镜下观察到的胞内油滴结果与其胞内油脂测定结果基本相符。     

快速高通量测定三角褐指藻油脂含量

为了实现三角褐指藻细胞内油脂含量的快速高通量测定,探索了尼罗红荧光染色法检测其油脂含量的检测条件.采用96孔板并配合酶标仪考察三角褐指藻的预处理液的种类及其用量、染色液尼罗红的用量、染色温度、染色时间以及细胞浓度对荧光强度的影响,确立最优染色条件,并研究荧光强度与油脂含量之间的对应关系.结果表明,TritonX-100终浓度为0.05%时,通透效果最佳,每100μL藻悬液中加3μL尼罗红染液(0.1mg/mL),温度40℃,时间10min,细胞浓度低于3×106个/mL时,荧光强度(y)与油脂含量(x)之间呈现良好的线性关系:y=927.37x+15.913,R2=0.9247.方法优化后,90min即内可完成对96个样品的处理及分析,极大提高了分析的通量.     

过表达甘油激酶三角褐指藻藻株富集油脂的研究

为了得到高产并符合生物柴油标准的微藻油脂的藻株,本文研究了在外源甘油存在的情况下野生型（WT）三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）,甘油激酶过表达藻株（GKOE）以及甘油激酶RNA干扰藻株（GKRNi）在添加浓度为20 mmol/L外源甘油的培养基中的生长情况、油脂产量以及脂肪酸组成.结果显示：（1）甘油兼养的GKOE藻细胞浓度可达到2.23×107个/mL,明显高于甘油兼养的WT的1.79×107个/mL和GKRNi的1.78×107 个/mL;（2）甘油兼养的GKOE油脂含量可达到31.73%,比甘油兼养的WT和GKRNi分别高了27.20%和26.63%;（3）尼罗红染色显示甘油兼养的GKOE荧光强度比甘油兼养的WT和GKRNi分别高16.26%和17.83%;（4）甘油兼养的GKOE总脂肪酸产量可达到0.052 mg/mL,比甘油兼养的WT和GKRNi高了36.84%和10.64%,说明其油脂适合于生物柴油开发.     

大肠杆菌对链状弯壳藻生长特性的影响

目的:探究细菌与链状弯壳藻共培养时对其生长特性的影响,了解链状弯壳藻改变存在状态、形成水华的原因.方法:研究了不同大肠杆菌(Escherichia coli)添加量对链状弯壳藻生物量、多细胞群体形成、胞外多糖含量等的影响.结果:大肠杆菌对链状弯壳藻的生长存在抑制作用,表现为总细胞密度随添加菌液浓度(0.2%～2%)的增加而减少;但细菌的存在对链状弯壳藻单细胞形成群体具有促进作用,其中1%的菌液浓度最有利于链状弯壳藻形成群体,群体细胞的密度约为对照的5倍.与1%菌液浓度共培养的链状弯壳藻胞外多糖含量是对照的2.3倍,且链状弯壳藻的胞外多糖含量与群体细胞密度正相关(P0.05).结论:细菌的存在是链状弯壳藻形成多细胞链状群体的重要因素.     

耐高COD淀粉废水的高产油脂粘红酵母的驯化和筛选

为减轻高COD淀粉废水对产油菌株粘红酵母生长的抑制,提高油脂产量,本文利用淀粉废水对该菌株进行了耐高COD梯度驯化,并采用流式细胞仪对经尼罗红染色的粘红酵母细胞进行了高油脂含量菌株的筛选。结果表明：经多次驯化后,粘红酵母耐受淀粉废水COD高达75000mg/L;流式细胞仪筛选得到一株油脂含量为25.7%（质量分数）的粘红酵母,比原始菌株油脂提高了140%。400L发酵罐实验表明,在初始COD 75000mg/L,葡萄糖质量浓度为36g/L,pH4.8及30℃条件下,培养33h后,粘红酵母生物量达25.3g/L,菌体油脂含量为29.5%,COD降至5600mg/L,降解率为92.5%。     

氮缺失对蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）的油脂含量的影响以及应用两步培养法提高藻的油脂产率

摘要：氮缺失培养可提高绿藻属Chlorella pyrenoidasa 内的油脂积累并使不同种类的脂肪酸含量也发生改变。两步培养法和氮源KNO3初始浓度为1.5 g/L的单步培养法相比,细胞油脂含量和总脂肪酸含量分别提高了5.8%和 5.2%。两步培养法中生物量浓度为8.32 g/L,而单步培养法中生物量浓度为7.55 g/L。与单步培养法中热焓值为23.587 MJ/kg 相比两步培养法中热焓值提高到25.524 MJ/kg。两步培养法中小球藻热焓值的提高可能是细胞油脂含量提高的缘故。应用两步培养法不但可以提高生物量的浓度而且增加细胞油脂含量。本研究表明,两步培养法特别适合油脂含量丰富的藻的生产,这有利于大规模培养藻生产生物柴油。     

双溶剂体系提取小球藻油脂的研究

采用双溶剂提取法对小球藻油脂进行提取,并对油脂成分及其质量分数进行分析。对比了不同溶剂体系、溶剂添加顺序、溶剂体积比以及固液比(小球藻质量(g)与混合溶剂体积(mL)之比)对油脂提取效率的影响。结果表明:当采用最佳双溶剂提取体系石油醚+乙醇(体积比为1∶2),并且先添加非极性溶剂再添加极性溶剂乙醇,固液比为1∶20时,可以得到质量为干藻粉总质量45.9%的提取物和16.1%的藻油。     

盐胁迫对鲁氏酵母菌生理特性的影响

研究了盐胁迫对鲁氏酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii CGMCC 3791)细胞生理特性的影响,结果表明,盐胁迫使细胞生长受到抑制,单位(每克)菌体乙醇含量从11.64mg增加到19.20mg(120g/L NaCl)。分析细胞胞内pH值和胞内活性氧(ROS)水平,结果表明:盐胁迫使细胞胞内pH值水平降低,胞内活性氧(ROS)水平增加,同时胞内抗氧化酶系(过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶,以及谷胱甘肽过氧化物酶)的活力提高,从而抵御由盐胁迫引起的氧胁迫。研究了盐胁迫对鲁氏酵母菌胞内谷胱甘肽(GSH)含量的影响,结果表明,随着盐质量浓度增加,胞内GSH含量增加,在120g/L盐质量浓度下,GSH含量显著增加了73.4%。考察了外源添加GSH对细胞生长的影响,发现添加0.5g/L GSH的鲁氏酵母菌,在120g/L盐质量浓度下生物量提高了15%。本研究可对深入认识鲁氏酵母菌耐盐生理机制及进一步提高其耐盐性能提供理论支持。     

不同光照条件下氮浓度对衣藻生长及油脂积累的影响

为探究莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)油脂含量的最佳条件,在不同的光照条件下检测了氮浓度对莱茵衣藻生物量及油脂含量的影响.结果表明:在氮添加和光照强度增加的梯度上,衣藻的油脂含量逐渐降低;光照强度和氮添加量对衣藻的油脂含量都有显著影响;控制光照强度和氮添加量后发现,当光照强度为30μE·m~(-2)·s~(-1),氮质量浓度为100 mg·mL~(-1)时,衣藻油脂含量的质量分数为39.79%,叶绿素质量浓度为17.08 mg·mL~(-1),最适宜衣藻油脂积累.     

博来霉素对转基因椭圆球藻(Chloroidium ellipsoideum)生长及油脂积累的影响

为了探究博来霉素对野生型椭圆球藻(Chloroidium ellipsoideum,SD-0701)和导入外源基因Gus的转基因椭圆球藻(SD-0702)生长以及油脂积累的影响,在Knap培养基中添加不同质量的博来霉素,测量2个藻株在不同处理下的细胞密度、藻粉产量以及油脂产量.结果发现,培养基中不添加博来霉素时,SD-0701的生长速率、藻粉和油脂产量均高于SD-0702.培养基中添加博来霉素能够抑制SD-0701和SD-0702的生长,对SD-0701的抑制作用更明显.培养基中博来霉素的质量浓度为4μg/mL时,2个藻株的生长就开始受到抑制,博来霉素对SD-0701的抑制率达到87.31%,对SD-0702的抑制效果不明显,抑制率仅有12.23%. SD-0701对博来霉素更敏感,添加了博来霉素的处理组中,SD-0701的藻粉产量微小无法制备;SD-0702在不同质量浓度的博来霉素培养基中均能够生长,且可获得藻粉和油脂,但产量随着博来霉素质量浓度的增加而降低.博来霉素质量浓度为4μg/mL时,SD-0702的藻粉产量和油脂产量抑制率分别为12.44%和8.49%,博来霉素质量浓度高达16μg/mL时,藻粉产量和油脂产量的抑制率分别为66.31%和75.46%.低质量浓度博来霉素(≤8μg/mL)对SD-0702的含油率有提升作用,高浓度则会降低SD-0702的含油率.以上结果表明,野生型椭圆球藻中导入外源基因Gus会轻微抑制细胞生长,但增强了椭圆球藻对抗生素的抗性,使其能够在低抗生素污染水体中生长并生成代谢物.     

不同浓度铁离子对栅藻生理生化特性和生长的影响

研究了不同浓度铁离子对栅藻生长和藻细胞抗氧化系统的影响.分析测定了培养基初始Fe3+分别为0,1.2×10-3,1.2×10-4,1.2×10-5,1.2×10-6,1.2×10-7mol.L-1时栅藻的细胞密度、生物量、蛋白质含量、总脂产量及脂肪酸组成,并研究了不同浓度铁离子对栅藻细胞的抗氧化系统的影响.实验结果表明,当培养基中初始铁离子浓度为1.2×10-4mol.L-1时最适合栅藻生长和蛋白质合成,蛋白质含量达到最大为97.33μg.mL-1;当初始Fe3+浓度为1.2×10-5mol.L-1时,栅藻细胞总脂占干质量最高达38.60%;C18∶2和C18∶3占总脂肪酸的比例随Fe3+浓度增加而降低.当Fe3+浓度达到1.2×10-3mol.L-1时,栅藻的生长受到抑制.与对照组(培养基不添加铁离子)相比,不同浓度铁离子使栅藻总抗氧化能力增加,超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性有不同程度的提高,羟自由基能力受到不同程度的抑制.     

一种荧光分光光度法测定铜绿微囊藻胞内氧化物的方法

该论文利用荧光分光光度计的三维波长扫描和定量分析模式,探讨了一种简单、快捷地测定水华爆发的优势藻——铜绿微囊藻胞内氧化物的方法.论文比较了去离子水、超纯水和磷酸盐缓冲溶液作为细胞承载基质时的荧光发光情况,确定了超纯水为最适的藻细胞承载基质;确定了荧光剂的激发发射波长为Ex/Em=498 nm/522 nm;比较得出最适的荧光剂终浓度和黑暗孵育时间为100μmol/L和60 min.该方法无需复杂的前处理,可快速地测定胞内氧化物.     

不同浓度铁离子对栅藻生理生化特性和生长的影响

研究了不同浓度铁离子对栅藻生长和藻细胞抗氧化系统的影响.分析测定了培养基初始Fe3+分别为0,1.2×10-3,1.2×10-4,1.2 ×10-5,1.2×10-6,1.2×10-7 mol·L-1时栅藻的细胞密度、生物量、蛋白质含量、总脂产量及脂肪酸组成,并研究了不同浓度铁离子对栅藻细胞的抗氧化系统的影响.实验结果表明,当培养基中初始铁离子浓度为1.2×10-4 mol·L-1时最适合栅藻生长和蛋白质合成,蛋白质含量达到最大为97.33 μg·mL-1;当初始Fe3+浓度为1.2 ×10-5 mol·L-1时,栅藻细胞总脂占干质量最高达38.60％;C18∶ 2和C18∶3占总脂肪酸的比例随Fe3+浓度增加而降低.当Fe3+浓度达到1.2×10-3 mol·L-1时,栅藻的生长受到抑制.与对照组(培养基不添加铁离子)相比,不同浓度铁离子使栅藻总抗氧化能力增加,超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性有不同程度的提高,羟自由基能力受到不同程度的抑制.     

外源糖对爪哇伪枝藻低温胁迫耐受性的影响

以一种从荒漠结皮中分离的典型蓝藻--爪哇伪枝藻为材料,在实验室条件下设置2、10和25 ℃(对照)进行低温处理,并向低温处理的藻培养物中添加0.2 g/L蔗糖和0.2 g/L葡萄糖,测定低温胁迫和外源糖对伪枝藻生物量、光合活性、膜脂过氧化产物丙二醛含量、细胞可溶性蛋白质含量和胞外多糖分泌的影响.研究结果显示,与对照处理相比,低温胁迫导致伪枝藻生物量和光合活性的显著降低,细胞内可溶性蛋白呈现明显增高.同时低温处理导致伪枝藻膜脂的过氧化伤害,即丙二醛含量的大量增加.添加外源糖处理时发现,蔗糖和葡萄糖有利于提高伪枝藻对低温胁迫的耐受性.研究还发现,经过48 h、10 ℃低温适应处理的伪枝藻骤然降至2 ℃时,出现胞外多糖的大量分泌.研究结果表明糖类物质可能对于提高伪枝藻的低温胁迫耐受性具有重要调节作用,为更好地理解荒漠结皮蓝藻对极端环境的耐受机制提供了有意义的参考.     

不同氮源对骨条藻光合活性、生长和中性脂积累的影响

研究了硝酸钠、氯化铵和尿素作为单一氮源对骨条藻的光合活性、生长及中性脂积累的影响.结果表明:最适合骨条藻生长的氮源是氯化铵,其次是尿素,最后是硝酸钠,3种氮源的最适浓度均为4.4×10-4mol/L,光合活性的结果与藻的生长基本一致.3种氮源各浓度梯度的中性脂积累量最大值基本都出现在第7天(培养时间为8d),与藻的生长不是同步关系.最适合骨条藻中性脂积累的氮源是氯化铵,最适浓度为8.8×10-6mol/L,其最高油脂含量为31.07%.硝酸钠组的最高油脂含量为28.46%,略高于尿素组的最高油脂含量27.99%,但尿素组最适合中性脂积累的氮源浓度为1.8×10-5mol/L,低于硝酸钠组的最适氮源浓度1.8×10-4mol/L.在高接种量的条件下,骨条藻油脂总量的高低与百分含量的高低是基本一致的.     

外源一氧化氮调控三角褐指藻响应氮胁迫的作用研究

为探究外源一氧化氮(Nitric Oxide,NO)对三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)响应氮胁迫的作用,本研究通过添加外源NO供体硝普钠(Sodium Nitroprusside,SNP)及NO清除剂[2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-teramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide,cPTIO],探讨外源NO对氮胁迫条件下的三角褐指藻细胞密度、叶绿素含量、叶绿素荧光参数、岩藻黄素含量、油脂相对含量等的影响。结果表明,缺氮会抑制三角褐指藻细胞的生长,显著降低叶绿素a (chla)含量与光合效率,降低岩藻黄素含量,增加脂质合成。与氮正常情况下相比,在缺氮条件下添加200 μmol/L SNP可在一定程度上缓解缺氮对三角褐指藻生长、叶绿素含量、光合效率与岩藻黄素积累的抑制,并能显著促进油脂的积累。在缺氮条件下添加50 μmol/L cPTIO对三角褐指藻的生长、叶绿素含量、光合效率及物质积累影响不大。本研究可为探明外源NO调控三角褐指藻响应氮胁迫的作用机制提供基础数据,也为进一步提高逆境条件下三角褐指藻的生物量及促进成分积累量提供参考依据。     

底栖硅藻新月筒柱藻对锌胁迫的生理学效应

采用流式细胞仪检测细胞增长与色素含量、原子火焰吸收光谱法测定金属含量以及显微镜观察细胞状态等方法研究了红树林底栖硅藻新月筒柱藻(Cylindrotheca closterium (Ehr.) Reimann and Lewin)暴露在重金属锌96 h内的细胞增长、光合色素含量和细胞形态结构等胁迫效应,以及锌在藻细胞内外动态分布的情况.结果为:(1)在Zn2 浓度小于10 mg/L范围内,锌对新月筒柱藻的细胞增长和色素含量均无显著抑制作用.(2)1 mg/L和10 mg/L的Zn2 对藻细胞内的叶黄素和叶绿素a的产生都有促进作用.(3)在实验开始的24 h内,藻细胞处在低Zn2 浓度(1 mg/L)时,藻细胞胞内吸收的Zn2 大于胞外吸附的Zn2 .而藻细胞处在高Zn2 浓度(10 mg/L)时,胞外吸附的Zn2 较胞内吸收的大,细胞内Zn2 的含量处在较低水平,从而促进细胞的增长和色素的合成并使细胞免受外界高浓度锌的毒害.可见,新月筒柱藻正是通过改变对锌的富集方式,以保持细胞内锌含量的相对稳定来适应不同浓度锌的胁迫.     

两步培养法提高蛋白核小球藻的油脂含量

基于Chlorella pyrenoidosa的生长规律和在缺氮条件下培养可提高其细胞内的油脂积累的特性,进行了两步培养法提高小球藻油脂产量的研究.结果显示：小球藻高密度生长的最适葡萄糖和硝酸钾质量浓度分别为20 g/L和1.50 g/L;单步培养法中氮源KNO3初始质量浓度为1.50 g/L时的小球藻生物量为（7.55±0.23）g/L,两步培养法中的小球藻生物量提高至（9.23±0.11）g/L;与单步培养法相比,两步培养法中小球藻细胞的油脂含量和总脂肪酸含量分别提高了5.8%和5.2%,藻的热值由（23.58±0.02）kJ/g提高到（25.52±0.03）kJ/g.这说明,两步培养法不仅可保证藻细胞的高密度生长,而且能有效增加藻细胞的油脂含量.     

绿色荧光蛋白标记S2P在集胞藻6803中的表达

为研究集胞藻6803中两个S2P同源蛋白酶Slr0643和Sll0862的功能,分别在两个蛋白酶的羧基端添加增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标签,构建了两株转基因集胞藻psbA2::0643GFP-Cmr/△0643-Kmr和psbA2::0862GFP-Cmr/△0862-Kmr.通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测到egfp基因的转录表达,通过激光共聚焦显微镜检测到转基因集胞藻细胞发出的绿色荧光蛋白荧光,表明带EGFP标签的S2P融合蛋白在psbA2启动子调控下正确表达.     

重金属离子对栅藻生长代谢的影响

研究了Pb、Zn、Cu、Cd、Mn、Cr、Ni等7种重金属离子对栅藻生长代谢的影响.定时测定重金属处理后藻的生长情况、叶绿素a和粗油脂含量.结果表明,栅藻对Pb的耐受性最强,耐受能力可达20 mg·L-1,Zn、Mn、Ni其次,对Cu、Cd、Cr比较敏感,耐受性仅为1 mg·L-1.当重金属离子质量浓度在1 mg·L-1以下,Pb、Zn促进栅藻生长,同时提高其叶绿素a含量.Pb质量浓度为0.5 mg·L-1时,生物量最高,达0.642 mg·L-1,随着质量浓度提高,粗油脂含量增加,脂肪酸主要组分为棕榈酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯,并且随着胁迫质量浓度的增加,脂肪酸含量明显增加.超过一定质量浓度后,重金属离子抑制栅藻的生长,并导致生物量下降,Zn质量浓度高于5 mg·L-1时,栅藻叶绿素a含量降至1 mg·L-1以下.