石刁柏雄性连锁的AFLP及SCAR标记的建立

目的:对石刁柏雌雄株基因组差异进行分析,筛选雄性或雌性连锁的分子标记.方法:利用限制性片段长度多态性技术,设计了多个引物组合,分别对石刁柏雌雄株基因组进行扩增.结果:在使用的72个引物组合中,引物组合E-AAG+M-CAT从雄性基因组中扩增出了一个雄性连锁的标记(MLDA555),该序列长度为555bp,AT含量为59%.Blast检索未发现相似序列.根据该片段序列设计的引物将该标记转化为雄性连锁的大小为523bp的稳定的SCAR标记,经过不同基因型雄性个体的验证证明该标记广泛存在于不同基因型石刁柏雄性个体中.结论:通过AFLP扩增筛选得到了石刁柏雄性连锁的AFLP和SCAR标记,为石刁柏性别决定机制的理解及石刁柏的分子标记辅助育种提供理论资料和技术支持.     

响叶杨（杨属）叶绿体基因组测序与比较分析

本研究中,我们对响叶杨的叶绿体基因组进行测序和组装,并将其与杨属其他11个叶绿体基因组进行比较分析.结果表明,响叶杨叶绿体基因组全长158,591bp,其中两个反向重复序列区(IR)长度均为27,667bp,长单拷贝序列区(LSC)和短单拷贝序列区(SSC)长度分别为84,634和18,623bp.通过对杨属12个物种的叶绿体基因组进行比较,只发现了6个相对较大的插入缺失,因此整体而言,杨属的叶绿体基因组结构是高度保守的.系统发育分析结果显示,杨属中12个物种组成了3个具有高支持率的进化支,响叶杨与其他白杨组物种聚为一支,并且与银白杨的亲缘关系最近.本研究基于叶绿体基因组数据揭示了杨属的进化历史,将有助于进一步开展杨属植物基于叶绿体DNA序列数据的群体遗传学及其他分子生态学研究.     

菠菜叶绿体基因组定点整合表达载体构建及原核表达

分析菠菜叶绿体基因组全序列,选用了rbcL基因和accD基因的间隔区作为外源基因的定点整合位点,并从菠菜叶绿体基因组中克隆了rbcL基因全长和accD基因的5′端部分,长度分别为1956 bp和1320 bp。以这2个DNA片段作为同源重组片段,以烟草叶绿体基因的启动子Prrn和终止子psbA3′控制外源基因的转录,构建了包含筛选标记基因aadA基因(编码氨基糖苷-3′-腺苷酸转移酶,具有壮观霉素和链霉素抗性)和报告基因GFP(编码绿色荧光蛋白)的菠菜叶绿体基因组定点整合表达载体pRAGA。酶切结果显示构建正确。将该载体转化大肠杆菌,在激光扫描共聚焦显微镜下用488 nm蓝光激发,发现大肠杆菌发出强烈的绿色荧光,而对照菌体没有荧光,表明GFP基因在原核大肠杆菌中已经成功表达。实验结果说明构建的菠菜叶绿体定点整合表达载体pRAGA可以用于菠菜叶绿体转化。     

石刁柏雄性连锁的AFLP及SCAR标记的建立

目的:对石刁柏雌雄株基因组差异进行分析,筛选雄性或雌性连锁的分子标记.方法:利用限制性片段长度多态性技术,设计了多个引物组合,分别对石刁柏雌雄株基因组进行扩增.结果:在使用的72个引物组合中,引物组合E-AAG+M-CAT从雄性基因组中扩增出了一个雄性连锁的标记(MLDA555),该序列长度为555bp,AT含量为59%.Blast检索未发现相似序列.根据该片段序列设计的引物将该标记转化为雄性连锁的大小为523bp的稳定的SCAR标记,经过不同基因型雄性个体的验证证明该标记广泛存在于不同基因型石刁柏雄性个体中.结论:通过AFLP扩增筛选得到了石刁柏雄性连锁的AFLP和SCAR标记,为石刁柏性别决定机制的理解及石刁柏的分子标记辅助育种提供理论资料和技术支持.     

马铃薯与其野生近缘种叶绿体基因组差异分析

叶绿体基因组是植物基因组的重要组成部分,解析马铃薯及其野生近缘种的叶绿体基因组结构差异对理解马铃薯的进化具有重要的意义.选择Solanum fernandezianum、Solanum etuberosum、Solanum palustre和Solanum phureja进行叶绿体基因组的组装和结构分析.发现它们叶绿体基因组的长度为155 283～155 492 bp,总GC含量变异较小,为37.86%～37.94%,基因的数目均为113个.通过基因组序列差异比较分析,共鉴定了725个单核苷酸多态性(SNP)、62个插入和47个缺失.其中,有229个SNP和3个缺失在马铃薯中是独有的,分别落在了49个和3个基因上.简单重复序列(SSR)分析发现,群体中只存在单核苷酸和二核苷酸的重复,总的变异数目在马铃薯中最少.序列相似性分析结果表明在马铃薯栽培种和野生种之间存在3个差异较大的区域.基于叶绿体全基因组的系统进化树分析发现,三个野生种中S.etuberosum和S.palustre具有更近的亲缘关系.     

浅谈叶绿体基因组分析技术在植物系统学中的应用

本文对植物叶绿体基因组做一简介,包括叶绿体基因组的发现、结构与特点、编码基因、进化特点和遗传方式。综述了DNA杂交、DNA限制酶谱分析、RFLP分析、PCR-RFLP分析、微卫星序列分析、SSCP分析和核酸序列分析等叶绿体DNA分析技术的原理、特点及应用。阐述了叶绿体DNA在植物系统学研究中广泛应用的利弊。     

基于叶绿体基因组比较栝楼属植物的演化

叶绿体基因组在基因水平上高度保守，并且遵循单亲遗传及单倍体遗传，已被广泛应用于物种鉴定和系统发育分析。栝楼属为葫芦科的一个重要属，具有极其重要的药用价值及经济价值，但种内关系不清。本文利用生物信息学及比较基因组学的方法，分析了11种栝楼的叶绿体基因组大小、结构、组成、重复序列、密码子偏性、边界扩张、正向选择、基因组共线性、核苷酸变异位点及系统发育等。结果显示，11种栝楼的叶绿体基因组都具有典型的四联体结构，长度为156 413 bp～157 556 bp,GCs含量为37%，较为保守。重复序列在LSC区域分布较多，密码子偏好性不强，没有明显的边界扩张或收缩，但是某些栝楼属植物叶绿体基因组存在序列重排，其中三种栝楼还受到环境的正向选择。同时，序列重排将11种栝楼分为两个主要分支，其中第一分支的演化与环境的正向选择密切相关。栝楼属物种核酸多态性位点多分布在SSC区域，系统发育分析表明栝楼属与油渣果属、丝瓜属及藏瓜属亲缘关系较近。本研究为栝楼属物种的分类及演化提供了分类依据，同时为编制栝楼属物种DNA条码提供了候选标记。     

青鳉DMY基因的克隆及其在性别鉴定中的应用

提取雄性青鳉成鱼基因组DNA为模板,利用特异性引物,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增获得1 908 bp的特异性条带.经测序证明为DMY基因片段,其核苷酸序列由3个外显子和2个内含子组成,可连续编码150个氨基酸.建立准确而有效的鉴定任意发育阶段青鳉个体雌雄性别基因型的方法,即利用管家基因——肌动蛋白基因PCR扩增条带的有无验证DNA样本提取和PCR扩增的有效性,同时利用雄性DMY基因的PCR扩增条带的有无鉴定青鳉个体的雌雄性别.对随机选取的成鱼和新生鱼卵样本,应用该方法可成功地鉴定出青鳉个体的雌雄性别.     

黄鳝性别决定与SRY基因不相关

以人和鼠的SRY片断为探针与黄鳝基因组DNA进行杂交,发现雌雄黄鳝中均有相同的杂交带.用一对SRY基因保守区HMGbox的引物,在雌雄黄鳝的基因组DNA中均扩增出约200bp片段.将此片断克隆测序后发现雌雄个体中此片断仅相差1个bp,且与人的SRY基因HMG盒基因极相似.以该片段与雌雄个体的RNA进行Northern杂交未能检测到杂交带,RT-PCR反应扩增出一条微弱的200bp片段.以上结果表明:在雌雄黄鳝的基因组DNA中均存在SRY同源片断;黄鳝中的SRY同源片断可能与其性别无直接关系,而是具备其他功能,由此推测低等脊椎动物的性别决定可能由其他基因控制.     

应用抑制性消减杂交技术构建人肝癌组织特异表达cDNA文库

为克隆和筛选肝癌特异表达基因.应用抑制消减杂交技术对肝癌及癌旁组织进行消减杂交,产物PCR扩增后,进行克隆.共得到1820个克隆,1776个克隆有100~800bp的插入片断,阳性率达98%,说明人肝癌组织特异表达cDNA消减文库构建成功,同时我们对cDNA克隆进行测序,证明这些克隆的功能是和肝癌的发生高度相关的.抑制消减杂交是克隆特异表达基因的有效方法.     

鹅耳枥属树种叶绿体基因组结构及变异分析

【目的】了解鹅耳枥属(Carpinus)树种叶绿体基因组基因组成及结构特征,为鹅耳枥属的系统发育及基因组进化研究提供参考。【方法】获取鹅耳枥属16个树种的叶绿体基因组,对其进行基因注释,利用生物信息学方法比较叶绿体基因组间的结构特征与变异程度,并以麻栎(Quercus acutissima)为外类群分析了鹅耳枥属的系统发育关系。【结果】鹅耳枥属16个树种的叶绿体基因组均为双链环形结构,均包含1个长单拷贝区(LSC)、1个短单拷贝区(SSC)以及2个反向重复区(IRa和IRb)。叶绿体基因组大小差异较小,最大差异仅1 902 bp。基因排列顺序基本一致,各基因数量相对保守,其中核糖体RNA(rRNA)数量最为保守,所有树种均为8个。此外,鹅耳枥属树种叶绿体基因组在序列长度、基因组成以及GC含量等方面相对保守,但4个边界存在明显的多样性。鹅耳枥属叶绿体基因组中非基因编码区存在较大差异,变异程度较高,而基因编码区差异较小,具有较高的保守性。在叶绿体基因组4个部分中,LSC区的变异程度最高,IRa区的变异程度最低。鹅耳枥属叶绿体基因组中psbA、rps16、atpA、rps19、ndhF、ndhI以及ycf1等基因的编码区存在显著差异。此外,ycf3-trnS, trnS-rps4, trnH-psbA, psbZ-trnfM, matK-rps16, rps16-trnQ, trnQ-psbK, ccsA-ndhD, accD-psaI, ndhC-trnV, trnT-trnL, trnF-ndhJ, atpB-rbcL, trnT-psbD, trnE-trnT, trnD-trnY, rpl32-trnl等基因间隔区的非编码区差异较大。绝大部分基因的编码区长度十分保守,含内含子的蛋白编码基因长度变异主要来源于内含子长度或编码区长度。系统发育分析结果将鹅耳枥属划分为鹅耳枥组与千金榆组,此外由于地理隔离导致欧洲鹅耳枥(C. betulus)、美洲鹅耳枥(C. caroliniana)与鹅耳枥属其他树种表现出较远的亲缘关系。【结论】鹅耳枥属树种叶绿体基因组具有较高的保守性,其基因排列顺序基本一致,未检测到大规模的倒位或基因重排,但其IR区与单拷贝区(SC)边界存在明显的多样性。基于叶绿体基因组构建的系统发育树在一定程度上可以揭示鹅耳枥属树种的系统发育关系。     

Gene transfer to the nucleus and the evolution of chloroplasts

Photosynthetic eukaryotes, particularly unicellular forms, possess a fossil record that is either wrought with gaps or difficult to interpret, or both. Attempts to reconstruct their evolution have focused on plastid phylogeny, but were limited by the amount and type of phylogenetic information contained within single genes. Among the 210 different protein-coding genes contained in the completely sequenced chloroplast genomes from a glaucocystophyte, a rhodophyte, a diatom, a euglenophyte and five land plants, we have now identified the set of 45 common to each and to a cyanobacterial outgroup genome. Phylogenetic inference with an alignment of 11,039 amino-acid positions per genome indicates that this information is sufficient--but just rarely so--to identify the rooted nine-taxon topology. We mapped the process of gene loss from chloroplast genomes across the inferred tree and found that, surprisingly, independent parallel gene losses in multiple lineages outnumber phylogenetically unique losses by more that 4:1. We identified homologues of 44 different plastid-encoded proteins as functional nuclear genes of chloroplast origin, providing evidence for endosymbiotic gene transfer to the nucleus in plants.     

木兰叶绿体atpB和rbcL基因的系统进化分析

木兰科植物作为古老的类群,其杂交和形态多样以及趋同进化等特点导致传统分类出现很多不同结论。对生物类群进行种群的系统进化分析可以在一定程度上弥补传统分类方法的局限。叶绿体的母系遗传相对保守、分子水平差异明显,是绿色植物的标志性细胞器,因此叶绿体基因组常被用来进行植物的系统进化探究。本项研究利用phylip软件将NCBI核酸序列数据库中下载的21种木兰科植物叶绿体的atpB和rbcL基因序列760bp进行序列比对处理之后,进一步应用邻接法进行分子进化系统发生分析,构建系统发育进化树,从而得出木兰属中白玉兰、星花玉兰、锐叶木兰、北美大叶木兰、夜香木兰等在系统进化中的亲缘关系,为进一步对木兰属植物进行系统发生研究奠定基础。     

Properties and nucleotide sequence of linear plasmid-like DNA pC4 from mitochondria ofCucumis sativus

Four kinds of mitochondrial plasmid-like DNAs, designated pC1, pC2, pC3 and pC4, were detected in Cucumis sativus Jinyan No. 4. The electron microscopy observation showed that pC4 was linear conformation. Complete sequence of pC4 was cloned into pUC19 with E. coli JM109 as host. Sequence analysis revealed that pC4 was 370 bp long, the shortest one among all the reported mitochondrial plasmid-like DNAs. pC4 was AT rich. It contained terminal direct repeat sequence (35 bp in length)as well as many short direct and inverted repeats. ORFs in pC4 were short. pC4 was found to be homologous to nuclear DNAs, but lack homology with main mitochondrial and chloroplast DNAs. pC4-homologous sequence also occurred in nuclear genome of Jinyan No. 7 which contained no mitochondrial plasmid-like DNAs. The hybridization pattern of Jinyan No. 7 was slightly different from that of Jinyan No. 4. This suggested that pC4 occurred at the forepart of Cucumis sativus species divergence and integrated into the nuclear genome, and the pC4-homologous sequence in nucleus varied during species diverging.     

Transfer of a eubacteria-type cell division site-determining factor CrldfnD 8ene to the nucleus from the chloroplast genome in Chlamydomonas reinhardtii

MinD is a ubiquitous ATPase that plays a crucial role in selection of the division site in eubacteria, chloroplasts, and probably Archaea. In four green algae, MesosUgma viride, Nephroselmis olivacea, Chlorella vulgaris and Prototheca wickerhamii, MinD homologues are encoded in the plastid genome. However, in Arabidopsis, MinD is a nucleus-encoded, chloroplast-targeted protein involved in chloroplast division, which suggests that MinD has been transferred to the nucleus in higher land plants. Yet the lateral gene transfer （LGT） of MinD from plastid to nucleus during plastid evolution remains poorly understood. Here, we identified a nucleus-encoded MinD homologue from unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii, a basal species in the green plant lineage. Overexpression of CrMinD in wild type E. coil inhibited cell division and resulted in the filamentous cell formation, clearly demonstrated the conservation of the MinD protein during the evolution of photosynthetic eukaryotes. The transient expression of CrMinD-egfp confirmed the role of CrMinD protein in the regulation of plastid division. Searching all the published plastid genomic sequences of land plants, no MinD homologues were found, which suggests that the transfer of MinD from plastid to nucleus might have occurred before the evolution of land plants.     

淀粉质体DNA的研究现状

淀粉质体含有丰富的DNA,平均每个淀粉质体含有数百个基因组拷贝。其分布特点因物种而异,大都集中于拟核区,有的分散于质体内。在淀粉质体发育过程中,DNA含量不断增加,成熟期达到顶峰,以贮藏形态存在,为种子的萌发和幼苗的形态建成提供核苷酸等原料。淀粉质体DNA具有与叶绿体DNA同源的序列,存在一些表达基因,如：16SrRNA、psbA。但在抑制区域富甲基化,尤其是5-甲基胞嘧啶,碱基的甲基化在aDNA基因的表达调控中起重要作用。