GGPPS多克隆抗体的制备与鉴定

构建人香叶基香叶基二磷酸合成酶基因(GGPPS)原核表达载体,制备兔抗人GGPPS多克隆抗体.利用DNA重组技术构建原核表达载体pGEX-4T-GGPPS,诱导表达GGPPS融合蛋白,分离纯化该融合蛋白后,作为免疫原免疫家兔制备多克隆抗体.成功构建了pGEX-4T-1-GGPPS原核表达载体,转化Rosetta菌株后可高效表达GGPPS融合蛋白,成功制备GGPPS多克隆抗体,间接ELISA法测定抗体效价为1∶32000,并且抗体具有良好特异性.成功克隆GGPPS基因并制备了特异性的兔抗人GGPPS多克隆抗体,为进一步研究GGPPS的功能奠定了基础.     

植物乳杆菌Lactobacillu plantarumY1菌株胆盐水解酶基因(bsh)的克隆及重组表达

经同源蛋白比对分析设计引物,PCR 扩增获得植物乳杆菌Y1菌株bsh基因(975bp),首先克隆至表达载体pET-28a,转化E. coli BL21(DE3)菌株,IPTG 诱导表达,SDS-PAGE分析结果显示表达的重组蛋白为包涵体.选择能为大肠杆菌稀有密码子提供额外tRNA 的E. coli Rosetta(DE3)作为宿主菌,仍旧没有改善表达产物的可溶性.但是,选择含IF2融合蛋白标签的pLS-IF2质粒构建表达载体,SDS-PAGE分析及Western blot 鉴定结果显示表达的融合重组蛋白IF2-BSH具有可溶性.该结果为进一步研究乳酸菌胆盐水解酶的生物活性,结构功能关系的研究奠定了基础.     

重组人瘦素蛋白的原核表达、纯化和生物学活性鉴定

为解决重组人瘦素蛋白(hLeptin)大规模生产过程中包涵体的形成以及体外重折叠过程中蛋白聚集导致的低产量,探究在大肠杆菌中hLeptin高水平可溶性的表达,并进行生物学活性检测.利用hLeptin成熟肽基因与pET-30a(+)-SUMO系统构建融合表达质粒pET-30a(+)-SUMO-Lep,转化至大肠杆菌BL21(DE3),加入异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)进行诱导表达,之后经Ni金属亲和层析纯化,并切去SUMO融合标签后获得成熟hLeptin.重组hLeptin表达量高,主要以可溶形式存在.通过KM小鼠减肥实验和CCK8实验证明重组hLeptin具有生物学活性.综上,使用SUMO融合标签,以增强hLeptin在大肠杆菌中的高效可溶性高纯度的表达,为大规模生产hLeptin提供了一种新方法,同时为表达可溶性重组蛋白研究提供了一定的基础.     

人白细胞介素32的真核表达、纯化及生物学活性鉴定

摘要:目的：构建人白细胞介素32（IL-32）和IgG4基因Fc段的融合基因真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC,建立稳定转染的中国仓鼠卵巢细胞（CHO/DG44）克隆,并检测重组蛋白的表达及相应的生物学功能.方法：采用聚合酶链反应(PCR)从LPS激活的人CD4+T细胞cDNA中扩增出IL-32基因,并克隆到构建IL-32融合基因的真核表达载体 IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC.经脂质体法转染CHO/DG44 细胞, 通过RT-PCR检测,筛选出实验组细胞,并对筛选的阳性克隆细胞再进行氨甲喋呤（MTX）加压筛选,利用ProteinG-Agarose亲和纯化培养上清中表达的融合蛋白,并通过SDS-PAGE、免疫印迹鉴定检测目的蛋白的表达,最后以 HeLa细胞为靶细胞测定重组蛋白的生物学活性.结果：构建了一个IL-32融合基因真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC;筛选出了能稳定表达IL-32-IgG4(Fc) 融合蛋白的CHO/DG44细胞克隆; 亲和纯化后的IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白在SDS-PAGE电泳后与预期分子质量大小相符,能够与羊抗人IgG-HRP 抗体特异结合,并能促进HeLa细胞的死亡.结论：成功构建了人IL-32融合基因真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC,获得了能够表达具有生物学活性的IL-32-IgG4(Fc) 融合蛋白的CHO/DG44细胞克隆.     

重组蛋白Fpr3的原核表达、纯化与多克隆抗体的制备

为了从分子水平上进一步研究PPIase与PP1的相互作用,将构建好的pGEX-5X-1重组表达质粒转化于受体菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG诱导后得到了可溶形式表达的融合蛋白.采用GST亲和层析法对重组蛋白进行了纯化,并用Factor Xa对融合蛋白进行柱上酶切,SDSPAGE检测表明可获得较高纯度的GST-Fpr3融合蛋白以及去除GST标签的目的蛋白.用其免疫日本雄性大耳白兔,成功制备了抗GST-Fpr3的多克隆抗体,为Fpr3的空间结构的解析和相应的分子识别过程奠定了基础.     

MCUR1蛋白的表达纯化以及晶体初筛

Mitochondrial Ca~(2+)Uniporter(MCU)是线粒体钙离子通道的一个主要成分.近期研究发现Mitochondrial calcium uniporter regulator 1(MCUR1)是MCU的一个调节蛋白.研究通过合成人源的MCUR1基因,利用PCR得到目的DNA片段,克隆到表达载体PET.32a,构建Trx-MCUR1融合蛋白表达质粒PET.32aMCUR1.克隆质粒转化表达菌E.coli BL21(DE3)Condon Plus,经IPTG诱导表达.将得到的融合蛋白经过镍亲和层析柱进行初步纯化,然后加入PreScission酶分离目的蛋白与标签,再用离子柱和分子筛层析进行进一步的纯化以去除标签以及杂蛋白.浓缩纯化后的目的蛋白,进行晶体初筛以及后期的晶体优化.最后将生长的晶体进行初步的X射线衍射分析.     

人类线粒体转录终止样因子融合蛋白的构建与表达研究

在前期工作中,采用EST介导的定位克隆策略,克隆了一个人类线粒体转录终止样因子,为进一步研究其结构与功能的关系,构建了含该基因全长编码区的pET-28b的表达载体,经大肠杆菌中诱导表达获得含该基因的融合蛋白.用此融合蛋白注入小鼠制备多抗血清,为深入研究该基因的功能奠定了基础.     

HLA-A*0207重链胞外区原核表达载体的构建及表达

目的：克隆HLA-A*0207(A2)重链基因，构建在羧基端融合生物索化酶BirA底物肽(BirA substrate peptide，BSP)的A2重链胞外区原核表达载体，在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR方法从HLA-A2^ 供白细胞中克隆A2基因并进行DNA测序，并以PCR方法构建在羧基端融合BSP的A2重链胞外区表达载体，在大肠杆菌B121(ED3)中进行表达。结果：从31名HLA-A2^ 供白细胞中克隆到的基因经DNA测序显示，只有从供2得到的基因是HLA-A*0207。将编码该基因编码重链胞外区1-275的序列和编码BSP的序列融合，构建融合蛋白表达载体，并以测序验证。融合蛋白在B121(ED3)中获得高效表达，产物相对分子质量为35000，约占菌体总蛋白的30％，主要存在于包涵体中，对包涵体进行洗涤后得到纯度为80％的重组蛋白。结论：成功克隆HLA-A*0207基因，构建了其胞外区和BSP融合蛋白表达载体并在大肠杆菌中获得高效表达。     

Rab39A多克隆抗体的制备与鉴定

制备抗人Rab39A多克隆抗体并进行纯化检测,以用于Rab39A功能的研究.选取免疫原性强且特异性高的羧基端42个氨基酸(176～217aa)作为目的片段.PCR法扩增并构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rab39C42.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化GST-Rab39C42融合蛋白,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体.然后以亲和层析法纯化抗体,利用Western blot和免疫荧光检测抗体的特异性.结果表明,构建的原核表达载体经IPTG诱导后高效表达GST-Rab39C42蛋白,纯化后抗体质量浓度为1μg/μL;Western blot实验显示,抗体可以识别外源Rab39A蛋白和多个细胞系的内源Rab39A蛋白;抗体中和实验和RNA干扰实验证明了该抗体具有特异性.本研究成功构建了pGEX-4T-1-Rab39C42原核表达载体,并制备了特异性的抗人Rab39A兔多克隆抗体,为进一步研究Rab39A的功能提供了有力的支持.     

星海链霉菌卤化酶重组蛋白在大肠杆菌中可溶表达

大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是表达异源蛋白的良好宿主,但常遇到蛋白表达产物不可溶的困难.在对来自星海链霉菌的卤化酶基因sinH进行大肠杆菌异源表达时,为克服蛋白表达产物可溶性低的问题,探讨了不同载体对蛋白可溶表达的影响.利用pET28a进行SinH表达时不能得到可溶的目标蛋白;使用含有泛素标签及内含肽的载体pHUIE实现了卤化酶蛋白SinH的可溶表达,但纯化后纯度不高;利用带有链霉菌分子伴侣蛋白基因的载体pET28a-SinH与pETcoco-pL1SL2在E.coli BL21(DE3)中共表达,在30℃,0.1mmol/L IPTG诱导条件下表达4h,成功获得大量可溶蛋白,使用亲和层析(Ni-NTA)纯化,获得了较纯的目标蛋白SinH,上述研究结果为在大肠杆菌中进行其他链霉菌蛋白的可溶表达提供了参考.     

高频等位基因HLA-A*1101重链胞外域-BSP融合蛋白原核表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建HLA-A*1101重链胞外域羧基端融合生物素化酶B irA底物肽(BSP)的融合蛋白(HLA-A11-BSP)原核表达载体,并在大肠杆菌中表达该融合蛋白。方法:以RT-PCR法扩增并克隆HLA-A*1101重链基因的cDNA,以PCR方法构建HLA-A11-BSP的表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并以免疫印迹法进行鉴定。结果:从HLA-A2阴性的供者外周血单个核细胞中克隆到HLA-A*1101重链基因的cDNA,以此cDNA为模板,将编码HLA-A*1101重链胞外域1~276序列与编码BSP的序列融合,构建HLA-A11-BSP融合蛋白表达载体,重组质粒经测序验证。融合蛋白在BL21(DE3)中诱导后获得高效表达,约占菌体总蛋白的20%;其相对分子质量约为35 000,与理论值一致。免疫印迹分析显示表达产物主要存在于包涵体中,上清液中几乎无任何产物存在。结论:成功构建表达HLA-A11-BSP融合蛋白的原核表达载体,该融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式获得高水平表达。     

分泌型Survivin真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建含6个组氨酸标签(His6)的小鼠存活素(Survivin)融合蛋白的真核表达载体,及其在真核细胞中的表达。方法:根据小鼠Survivin序列设计引物,经过RT-PCR克隆Survivin的cDNA并进一步构建分泌型Sur-vivin的真核表达载体,经测序鉴定后在大肠杆菌中扩增在HeLa细胞中表达;以金属离子螯合层析富集,再用免疫印迹法鉴定。结果:克隆到Survivin编码区全长序列,经DNA测序后证明与已报道序列相同。构建氨基端融合小鼠IL-2信号肽,羧基端带有His6标签的Survivin融合蛋白的真核表达载体,在HeLa细胞中转染成功并且表达;细胞上清经HisTrap HP柱层析富集后,进行免疫印迹分析,表明该融合蛋白以分泌型方式在HeLa细胞中表达。结论:成功克隆Survivin的cDNA,并构建其分泌型真核表达载体。     

F3重组毒素的克隆表达及纯化

以pEKH-F3质粒为模板,PCR扩增F3片段,将F3插入克隆质粒PQE80L,转化大肠杆菌,筛选,获得含有F3的PQE80L重组载体的克隆.提取绿脓杆菌菌株染色体DNA为模板,PCR扩增绿脓杆菌外毒素A催化区,PE40.然后将PQE80-F3和PE40重组,得到表达PQE80L-F3-PE40载体.转化至大肠杆菌DH5a,BL21,表达融合蛋白F3-PE40.结果显示,大肠杆菌表达了融合蛋白F3-PE40,表达的融合蛋白量大概占菌体总体蛋白量的20%.通过质粒提取、PCR扩增构建F3-PE40表达载体转化大肠杆菌,成功地表达了融合蛋白F3-PE40,为大规模表达、纯化F3-PE40的进一步功能奠定了基础.     

结核分枝杆菌esat6-cfp 10融合基因的克隆表达及纯化

获得esat6-cfp 10重组蛋白,为研究其在结核病诊断和预防中的作用奠定一定基础。以结核杆菌H37,Rv基因组DNA为模板,克隆cfp10基因,将其插入到pGEM-7ZF( )克隆载体后与esat6基因连接,构建含有esat6和cfp10融合基因的克隆载体esat6-cfp 10。酶切消化esat6-cfp 10重组质粒,将esat6-cfp 10基因亚克隆到pPROEX^TM HTb原核表达载体,经IPTG诱导后,可表达出分子量约28kD的esat6-cfp 10融合蛋白,重组蛋白经镍柱纯化后,得到了高纯度的esat6-cfp 10融合蛋白。Western blot证明表达重组蛋白有较好的免疫原性。     

构建的FIt3L胞外域原核表达载体在大肠杆菌中的表达

目的:构建含组氨酸标签的FMS样酪氨酸激酶3配体(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand,FIt3L)胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达.方法:依据FIt3L基因序列设计引物,以RT-PCR的方法从小鼠脾脏总RNA中克隆FIt3L基因并构建其胞外域原核表达载体,测序鉴定后在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达,用免疫印迹鉴定.结果:克隆到FIt3L编码区全长序列,经DNA测序证明与已报道的序列相同;构建羧基端带有His6标签的FIt3L胞外域蛋白的原核表达载体,转化大肠杆菌后SDS-PAGE分析显示在BL21(ED3)中获得较高表达;免疫印迹分析表明IPTG诱导后表达的FIt3L胞外域蛋白的相对分子质量(Mr)为19 000,与理论值相符,此蛋白与抗His6标签的抗体发生特异性反应.结论:成功克隆FIt3L基因,构建其胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达.     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的克隆、 表达及多克隆抗体制备

利用原核系统表达牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白, 制备鼠源多克隆抗体. 通过MDBK细胞增殖病毒, 提取RNA, RT-PCR扩增E2全长基因, 进行生物信息学分析后设计截短引物, 构建优化表达载体pET-30-E2, 转化BL21, 用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达; 用SDS-PAGE电泳分析蛋白表达, 纯化蛋白联合弗氏佐剂免疫小鼠; 用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定抗体效价水平, 用免疫印迹(WB)和免疫荧光(IFA)法验证抗体特异性. 结果表明: E2基因在大肠杆菌中成功表达, 蛋白大小为32 000, 不可溶形式表达, 表达量为0.4 mg/mL; 多克隆抗体效价为1∶256 000, 可特异性结合重组蛋白及细胞中的病毒.     

PbTIP多克隆抗体对恶性疟原虫生长抑制作用的初步研究

首先构建了伯氏疟原虫TIP样蛋白(以下简称PbTIP)的原核表达载体pET32a/PbTIP,在大肠杆菌中成功诱导表达了带His标签的PbTIP融合蛋白。SDS-PAGE分析显示该融合蛋白主要以包涵体形式表达。Western-Blot鉴定虽然证明该融合蛋白表达正确,但即便在变性条件下该蛋白的亲和层析纯化效果也不佳。以PbTIP融合蛋白经过初次和三次加强免疫获得的小鼠PbTIP多克隆抗体滴度达到1∶105以上。进一步的研究表明,小鼠PbTIP抗血清对体外培养恶性疟原虫的生长具有一定的抑制作用,这显示PbTIP多克隆抗体对恶性疟原虫感染具有一定的交叉保护作用。以上实验结果为后续PbTIP在疟原虫免疫抑制中的功能及其机制研究奠定了一定的基础。     

氧化还原因子-1的原核表达纯化及其活性鉴定

为建立氧化还原因子-1(Ref-1)的原核表达系统,将经过酶切后的人源Ref-1编码片段定向克隆到pGEX-4T-3载体上,构建了pGEX-4T-3/Ref-1原核表达载体,重组质粒转化至BL21(DE3)工程菌,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组工程菌表达可溶性融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(Glutathione Sepha-rose 4B)亲和纯化重组蛋白,透析后用聚乙二醇8000(PEG8000)浓缩,获得纯度达92%的融合蛋白,产率为3.7 mg/L,融合蛋白占菌体总蛋白的6.8%.蛋白质印迹(Western blot)显示该蛋白可以被抗体特异性识别,证实其为GST-Ref-1融合蛋白.GST-Ref-1蛋白体外增强了激活蛋白-1(AP-1)的DNA结合能力,并能拮抗H2O2造成的AP-1氧化损伤.     

鸡缩胆囊素-33四串体的可溶表达及应用研究

根据pRSETA载体序列,设计一对引物,采用PCR技术从重组质粒pRSETA-4CCK33上扩增到鸡缩胆囊素33(cholecystokinin-33,CCK33)四串体基因片段(缩写为4CCK33)。再将4CCK33克隆到原核表达载体pBCX上,成功构建重组质粒pBCX-4CCK33并在大肠杆菌BL21中成功表达,SDS-PAGE检测到分子量约为53 000的融合蛋白,可溶分析表明,融合蛋白主要是以可溶形式表达。Western-blot证实,融合蛋白能与CCK-8阳性血清发生免疫反应。用此纯化的融合蛋白制成油乳剂疫苗,主动免疫肉猪。饲养试验表明,免疫0.5 mg/mL和1.5 mg/mL 4CCK33疫苗的试验肉猪平均日增重与空白对照组相比,分别提高了5.28%和5.92%;日采食量则分别提高3.03%和2.53%,差异显著(P<0.05)。     

拟南芥蛋白激酶SnRK1α1亚基和α2亚基蛋白纯化

为了构建拟南芥蛋白激酶SnRK1α1基因和SnRK1α2基因的原核表达载体,表达并纯化SnRK1α1和SnRK1α2蛋白,以拟南芥Col-0的cDNA为模板,分别扩增得到SnRK1α1基因和SnRK1α2基因.将其分别构建到含有GST标签的载体PGEX-4T-3上,得到SnRK1α1的原核表达载体GST-SnRK1α1和SnRK1α2的原核表达载体GST-SnRK1α2.菌落PCR扩增鉴定到的阳性克隆测序后,转化大肠杆菌BL21(DE3).SDS-PAGE分析表明,在18℃,0.5mmol/L IPTG诱导条件下,GST-SnRK1α1和GST-SnRK1α1融合蛋白都能够高效、正确的表达.GSTSnRK1α1和GST-SnRK1α2融合蛋白的大小均为84ku.经过GST标签蛋白纯化,得到了纯化的GST-SnRK1α1融合蛋白,为进一步认识SnRK1复杂的三聚体结构以及SnRK1蛋白激酶的理化性质奠定了基础.