构建的FIt3L胞外域原核表达载体在大肠杆菌中的表达

目的:构建含组氨酸标签的FMS样酪氨酸激酶3配体(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand,FIt3L)胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达.方法:依据FIt3L基因序列设计引物,以RT-PCR的方法从小鼠脾脏总RNA中克隆FIt3L基因并构建其胞外域原核表达载体,测序鉴定后在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达,用免疫印迹鉴定.结果:克隆到FIt3L编码区全长序列,经DNA测序证明与已报道的序列相同;构建羧基端带有His6标签的FIt3L胞外域蛋白的原核表达载体,转化大肠杆菌后SDS-PAGE分析显示在BL21(ED3)中获得较高表达;免疫印迹分析表明IPTG诱导后表达的FIt3L胞外域蛋白的相对分子质量(Mr)为19 000,与理论值相符,此蛋白与抗His6标签的抗体发生特异性反应.结论:成功克隆FIt3L基因,构建其胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达.     

结核分枝杆菌Rv2626c基因的表达、纯化和鉴定

克隆结核分枝杆菌Rv2626c基因,构建其原核表达载体,并进行表达、纯化及鉴定.采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv2626c基因片段,克隆入pMD18-T载体,序列测定正确后亚克隆入原核表达载体pPro-EXHTb,转化入E.Coli DH5α,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析后与抗His单抗进行Western-blot,以Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白.PCR扩增获得的目的基因为432bp,与预期大小一致,测序与Genebank公布的基因序列完全一致.成功构建原核表达载体pPro-EXHTb-2626c,转化E.Coli DH5α后能特异性表达目的蛋白,大小约16KD,与理论值相一致.蛋白可溶性分析表明该蛋白主要以可溶性方式存在,纯化蛋白经Western-blot鉴定有特异性反应条带.成功构建结核分枝杆菌Rv2626c原核表达载体pPro-EXHTb-2626c,并获得纯化的目的蛋白,为研究新型结核疫苗的靶抗原奠定了基础.     

构建的Flt3L胞外域原核表达载体在大肠杆菌中的表达

目的：构建含组氨酸标签的FMS样酪氨酸激酶3配体（Fms—like tyrosine kinase 3 ligand,Fh3L）胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。方法：依据Fh3L基因序列设计引物,以RT—PCR的方法从小鼠脾脏总RNA中克隆Fh3L基因并构建其胞外域原核表达载体,测序鉴定后在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中诱导表达,用免疫印迹鉴定。结果：克隆到Flt3L编码区全长序列,经DNA测序证明与已报道的序列相同;构建羧基端带有His6标签的Flt3L胞外域蛋白的原核表达载体,转化大肠杆菌后SDS-PAGE分析显示在BL21（ED3）中获得较高表达;免疫印迹分析表明IPTG诱导后表达的Flt3L胞外域蛋白的相对分子质量（Mr）为19000,与理论值相符,此蛋白与抗His6标签的抗体发生特异性反应。结论：成功克隆Flt3L基因,构建其胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达。     

人RACK1基因的克隆及原核表达

克隆人RACK1基因,构建原核表达载体pET-30a(+)-RACK1,诱导表达重组蛋白,纯化后Western blot鉴定目的蛋白.根据GeneBank提供的RACK1基因序列及pET-30a(+)载体上的多克隆位点设计引物,以人胎肝cDNA文库为模板,钓取RACK1cDNA全长序列.将目的片段与原核表达载体pET-30a(+)连接,转入E.coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆.将测序正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)细胞,IPTG诱导表达,利用镍柱对表达的蛋白进行纯化,Western blot法检测纯化的蛋白.结果显示,克隆得到的目的基因序列与GeneBank中已报道的序列完全一致,成功构建了pET-30a(+)-RACK1原核表达载体.重组蛋白主要以包涵体形式存在,经镍离子亲和层析柱纯化后,Western blot检测证实纯化的蛋白能与特异性的抗体发生反应.本研究获得了人RACK1蛋白,为深入研究RACK1的功能奠定基础.     

人TRAIL基因胞外段的化学合成和克隆

根据大肠杆菌高表达序列重新设计了人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)胞外段的基因编码区的核苷酸序列, 应用化学合成的方法合成了多个互补DNA片段,经互补片段分别退火和连接后, 将完整编码区克隆于pMD18-T质粒中,进行DNA 序列分析,获得了与设计序列完全一致的含有完整编码区的人TRAIL胞外段基因,并成功构建了高效的TRAIL胞膜外段原核表达载体pTWIN1/TRAIL111-281.     

人FOXA1蛋白的原核表达、纯化及蛋白互作分析

构建FOXA1的原核表达载体,诱导表达并纯化后获得人FOXA1的C端和N端蛋白片段,为寻找FOXA1的互作蛋白提供材料基础.提取人乳腺癌细胞MCF7的总RNA,逆转录成cDNA,设计引物PCR克隆FOXA1的cDNA,再以此为模板扩增FOXA1的C端、N端cDNA片段,分别并克隆进带有GST标签的原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达质粒.双酶切及测序鉴定正确后,转化至大肠杆菌BL21Rosetta DE3,经IPTG诱导,Glutathione Sepharose 4B亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳及Western blot确定FOXA1蛋白的表达.与MCF7细胞裂解液孵育,进行GST-Pull down试验,检测纯化蛋白与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.成功构建pGEX-4T-1-FOXA1-C和pGEX-4T-1-FOXA1-N的原核表达载体;在大肠杆菌中诱导目的蛋白表达;经Glutathione Sepharose 4B纯化后,获得了人FOXA1的C端蛋白片段GST-FOXA1-C与N端蛋白片段GSTFOXA1-N;证实GST-FOXA1-C能与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.     

丙型肝炎病毒截短型核心C区和NS_3区融合蛋白(C_8-NS_3)的原核表达

通过RT-PCR从HCV全长基因组中分别克隆HCV核心区和NS3非结构区的部分优势表面抗原的基因片段,运用重叠延伸PCR技术将它们拼接成融合基因,将融合基因再克隆到表达载体pTrcHis2 TOPO TA中,转化大肠杆菌Top10,阳性克隆经IPTG诱导融合蛋白的表达,表达产物经15%SDS-PAGE鉴定,重组蛋白经His标签纯化.经IPTG诱导可高效表达分子量约为14.4KD的融合抗原,重组蛋白主要以可溶性形式存在.经过纯化目的蛋白纯度达96.3%以上的,表达量约为550μg/mL.ELISA结果表明纯化蛋白具有良好的抗原性.     

δ-氨基-γ-酮戊酸合成酶(ALAS)基因的克隆与原核表达

为获得ALAS的重组表达蛋白,以人肝脏组织cDNA为模板,通过PCR扩增得到ALAS全长片段并测序,成功构建了pET30a(+)-ALAS融合表达载体并转化大肠杆菌Rosetta(DE).IPTG诱导融合蛋白表达.SDS变性凝胶电泳结果显示,融合蛋白的分子量约70kDa,并且在上清液中有少量表达.经镍柱一步纯化得到His6-ALAS融合蛋白.     

丙型肝炎病毒(HCV)截短型E2的原核表达和蛋白纯化

对丙型肝炎病毒(HCV)截短型包膜糖蛋白E2-661基因进行原核表达和纯化.利用PCR法扩增出661 bp的截短型HCV E2区基因片段,并将测序正确的E2-661基因克隆入原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行分析和鉴定.结果表明目的蛋白分子量约为35 kDa,主要以包涵体形式大量存在.Western-blot结果显示目的蛋白与抗His标签单抗及HCV阳性血清均具有良好的反应原性.并通过镍离子亲和层析方法获得纯化的重组蛋白.以上结果为HCV E2功能的进一步研究奠定了基础.     

分泌型Survivin真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建含6个组氨酸标签(His6)的小鼠存活素(Survivin)融合蛋白的真核表达载体,及其在真核细胞中的表达。方法:根据小鼠Survivin序列设计引物,经过RT-PCR克隆Survivin的cDNA并进一步构建分泌型Sur-vivin的真核表达载体,经测序鉴定后在大肠杆菌中扩增在HeLa细胞中表达;以金属离子螯合层析富集,再用免疫印迹法鉴定。结果:克隆到Survivin编码区全长序列,经DNA测序后证明与已报道序列相同。构建氨基端融合小鼠IL-2信号肽,羧基端带有His6标签的Survivin融合蛋白的真核表达载体,在HeLa细胞中转染成功并且表达;细胞上清经HisTrap HP柱层析富集后,进行免疫印迹分析,表明该融合蛋白以分泌型方式在HeLa细胞中表达。结论:成功克隆Survivin的cDNA,并构建其分泌型真核表达载体。     

人膜蛋白CD81的原核表达与纯化

以高效原核表达载体pCold TF为载体骨架,应用PCR、限制性酶切、连接等分子生物学方法,将pCold TF中的六聚组氨酸(His-Tag)序列替换为限制性酶切位点SpeⅠ序列ACTAGT,构建不含His-Tag序列的新载体pL118.以此载体表达蛋白时,通过PCR引物在目的基因3′端添加His-Tag以利于融合蛋白的纯化以及融合蛋白中的Trigger Fac-tor(TF)助溶蛋白的去除.应用pL118对人膜蛋白CD81进行原核表达与纯化,并使用Fac-tor Xa蛋白酶去除CD81融合蛋白中的TF助溶蛋白,获得3′端含有His-Tag的CD81蛋白.人膜蛋白CD81的表达纯化,为CD81靶向药物筛选、抗体制备及深入研究CD81的功能奠定了基础.pL118载体的构建以及CD81蛋白的表达纯化为表达困难的基因实现原核表达提供了一种新的思路和方法.     

尘螨肠道微生物蛋白核苷二磷酸激酶的克隆、表达及纯化

根据 GenBank 中 NDP kinase 的基因序列,采用生物信息学方法将其中稀有密码子改造为大肠埃希菌常用密码子并进行二级结构优化,合成 NDP kinase 基因,构建原核表达载体 pET28a-NDP kinase 并酶切鉴定其序列,在大肠埃希菌 BL21（DE3）中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,重组产物采用镍离子金属螯合亲和层析柱纯化.经密码子改造和二级结构优化后 NDP kinase 基因长度为490 bp,其编码蛋白理论分子量为21.5 kDa,重组表达载体经酶切鉴定与理论推测结果相符,在大肠埃希菌 BL21（DE3）中该基因经 IPTG 诱导可高效表达,纯化后的重组蛋白分子量约为21.5 kDa,其单一蛋白纯度达95;以上.本研究成功构建了尘螨肠道微生物蛋白核苷二磷酸酶（NDP kinase）基因的 pET28a 原核重组质粒,为进一步研究 NDP kinase 在尘螨疫苗免疫治疗中的作用机理提供了基础.     

Expression of human soluble TRAIL in Chlamydomonas reinhardtii chloroplast

The use of plants as bioreactors for the expression oftherapeutic proteins has developed into a new field in biotechnology research[1]. Plant systems provide simple genetic manipulation, low production costs, and low risk of contamination by animal viruse…     

GST和His标记的重组蛋白制备及吸附纳米ZnO的研究

以pET-28a(+)载体为模板人工设计引物,通过PCR反应扩增带有质粒上游6聚组氨酸(6×Histidine)序列的目的基因片段,克隆到原核表达载体pGEX-4T-3中,筛选及鉴定阳性重组子pGEX-His,转化E.coli BL21细胞后通过IPTG诱导表达.由谷胱甘肽(GST)和6聚组氨酸标记的重组蛋白GST-His得到表达,利用Ni-NTA系统进行纯化.通过SDS-PAGE电泳和Western blot分析鉴定,由LC-MS/MS质谱分析确定所得蛋白为目标产物.通过蛋白结合纳米无机材料的亲和吸附实验结果证实,重组的新蛋白表现出对纳米ZnO特异吸附的生物活性.     

人溶菌酶N端与Exendin-4嵌合蛋白的基因克隆及原核表达

目的:克隆嵌合多肽人溶菌酶N端-Exendin-4基因并进行原核表达和纯化.方法:通过重组PCR技术将人溶菌酶N端74个氨基酸的基因序列与Exendin-4多肽基因序列相连接,其间引入一段由凝血酶和二肽基肽酶识别位点组成的连接序列.以嵌合基因hLYZ(N74)-Ex4与质粒pET-32a(+)构建原核表达体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达.表达蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化、Western blotting鉴定;透析复性后,以肠激酶切割并回收目的多肽.结果:重组质粒pET-32a/hLYZ(N74)-Ex4构建正确,目的蛋白主要以包涵体形式存在,37℃诱导4h、IPTG浓度为0.6 mmol/L时表达量最高,约占菌体蛋白总量的30%.Western blotting检测显示重组蛋白为单一清晰条带.重组蛋白经肠激酶切割后,回收得到高纯度的嵌合多肽.结论:成功构建hLYZ(N74)-Ex4嵌合基因的原核表达质粒,高效原核表达并获得高纯度目的蛋白.     

蛋白磷酸酶2C（PP2C）的表达、 纯化与催化活性

从小鼠肌肉组织中提取了总RNA, 经RT PCR, 扩增出蛋白磷酸酶2C（PP2C）基因, 并构建了pUCm T载体. 经核酸序列分析证明PP2C基因序列正确后, 将pUCm T中的PP2C基因插入pET28a载体中, 构建了表达载体pET28a PP2C, 并转化到E.coli BL21(DE3)进行表达. 经测定, 该菌株表达目的蛋白PP2C的最适条件为： 诱导物IPTG的终浓度为0.8 mmol/L, 37 ℃, 诱导时间为20 h. 在此条件下, PP2C实现了高 效表达, 表达的PP2C蛋白约占菌体总蛋白的18.2%, 其中在裂解上清液、 沉淀中分别占总蛋白的7.1%和11.1%. 经SDS PAGE分析, 表达产物分子量约为42 000. 应用Ni NTA柱实现了可溶性PP2C的纯化, 收率达805%, 纯化的PP2C比活力达34.5 U/mg.     

雷竹SOC1蛋白原核表达及纯化

为了获得有活性的雷竹PvSOC1蛋白(Phyllostachys violascens SUPPERSSOR OF CO OVEREXPRESSION 1),并进一步讨论其结构形态,通过原核表达方法得到PvSOC1的可溶性重组蛋白,以pET-GST作为表达载体,大肠杆菌E.coli Rosetta作为宿主菌株,超表达全长和IKC结构域的雷竹PvSOC1蛋白。发现在37℃条件下,菌液浓度D(600)值达到0.4～0.6时进行诱导,控制IPTG终浓度为0.4 mmol/L,诱导目的蛋白表达5 h,可以获得可溶的IKC结构域GST融合蛋白。采用TEV(tobacco etch virus protease)酶切技术、配合GST亲和层析柱及分子层析色谱柱,去除标签蛋白并纯化目的蛋白。所获得的高纯度IKC结构域PvSOC1蛋白经过对比分析发现其以八聚体形式存在。     

重组表达载体pGEM-VLA4的构建

从人外周血细胞中提取mRNA,用RT-PCR法扩增含BamH与HindⅢ酶切位点VLA4基因序列,运用分子生物学方法将该序列克隆到pGEM中,构建成VLA4基因序列的真核表达载体并进行鉴定分析.对重组载体用双酶切系统酶切后进行电泳并测序,结果证明目的基因克隆及连接方向正确,测序结果正确.通过实验,成功地构建了含VLA4基因的真核表达载体pGEM-VLA4.     

鱼腥藻铁调蛋白基因(alr0957)表达和Fe~(3+)对藻生长的影响

根据CyanoBase提供的鱼腥藻PCC7120 FurC基因(alr0957)序列信息设计特异性引物,用降落PCR法从染色体DNA中扩增得约450 bp目的片段.运用TA克隆将其连接到pMD18-T载体上,经筛选测序获得阳性重组质粒.再经过双酶切、纯化FurC基因,连接原核表达载体pET-28a(+),并转化表达菌株BL21和IPTG诱导表达.经测序鉴定的阳性菌株中的FurC,运用SDS-PAGE检测重组蛋白,并利用镍柱层析法纯化目的蛋白.由藻细胞密度、叶绿素a含量、可溶性糖含量等改变探讨不同Fe3+浓度对藻类生长的影响.结果表明:在37℃经1 mmol/L IPTG诱导18 h,成功表达了分子量约为19000的融合蛋白.小于0.5mg/L Fe3+促进藻生长,大于0.9 mg/L Fe3+抑制藻生长,最适藻生长Fe3+浓度为0.5⁰.9 mg/L.