碳氮源平衡流加策略提高重组大肠杆菌表达融合型乳酸片球菌素的产率

设计了基于碳氮源平衡的底物流加策略,研究其对重组大肠杆菌(Escherichia coli)生长与表达目的蛋白融合型乳酸片球菌素的影响.在菌体生长的不同时期流加不同碳源与氮源的质量比(mc/MN)的营养源,实现碳氮源的实时平衡流加,有效地避免了乙酸的积累,获得了高密度的菌体(最大菌体密度可达57.6g/L)和高表达的融...     

敲除iclR基因对大肠杆菌发酵L–色氨酸的影响

为了研究敲除icl R基因对大肠杆菌(Escherichia coli)发酵L–色氨酸的影响,以L–色氨酸工程菌大肠杆菌TRTH为出发菌株,利用Red重组技术构建了icl R基因(编码乙醛酸操纵子阻遏蛋白)缺失菌株TRTHΔicl R.摇瓶发酵实验结果显示:TRTH icl R的L–色氨酸产量和糖酸转化率分别达到(6.52±0.46)g/L和13.17%,,比原菌的分别提高了21.86%,和22.85%,;乙酸累积量为6.82,g/L,比原菌的降低了37.63%.30,L发酵罐发酵实验结果显示:TRTH icl R的L–色氨酸产量及糖酸转化率分别达到(13.01±1.05)g/L和6.51%,,比原菌的下降了60.34%,和68.27%,;乙酸累积量为18.21,g/L,比原菌的增加了33.42%.结果表明:在摇瓶条件下,重组菌株生物量较出发菌株高,代谢流分配适合L–色氨酸积累;但在发酵罐条件下,乙醛酸循环的增强导致重组菌株供能不足和乙酸的过多积累,最终使得生物量不足以及L–色氨酸产量下降.     

乙酸激酶编码基因缺失的L–色氨酸生产菌株的理性构建

针对L–色氨酸生产菌株(Escherichia coli TRTH)发酵生产L–色氨酸过程中乙酸积累的问题,本文采用基因组学的方法证实了该菌株基因组上存在乙酸激酶编码基因ack A及tdc D的完整基因序列;并通过敲除ackA、tdcD构建出菌株TRTHA(TRTH,Δack A)、TRTHT(TRTH,Δtdc D)、TRTHAT(TRTH,Δack AΔtdc D),进而考察ack A或/和tdc D缺失对L–色氨酸发酵的影响.结果表明:基因ack A或/和tdc D的缺失会使得乙酸积累减少、菌体生物量及其L–色氨酸产量增加,但同时会造成谷氨酸积累量的增加;菌株TRTHA的生物量及L–色氨酸产量均高于TRTHT.利用TRTHAT菌株发酵生产L–色氨酸时,菌体生物量、L–色氨酸产量和糖酸转化率分别为47.48,g/L、40.52,g/L和15.44%,,较TRTH菌株分别提高了6.03%,、7.94%,及7.82%,;乙酸和谷氨酸积累量分别为1.41,g/L、8.58,g/L,较TRTH菌株分别降低了10.19%,、提高了12.15%,.由TRTH与TRTHAT菌株的代谢流分析得知,与出发菌株TRTH相比,TRTHAT菌株的乙酸合成代谢流降低了72.78%,谷氨酸合成代谢流提高了13.13%,,L–色氨酸合成代谢流是TRTH菌株的1.74倍.     

重组大肠杆菌W3110（pEC901）培养过程中乙酸生成规律的研究

研究了重组大肠杆菌Ｗ３１１０（ｐＥＣ９０１）及其宿主菌在分批及连续培养中，主要糖代谢产物乙酸的生成规律。发现在分批培养过程中，乙酸主要在对数生长期产生，并当葡萄糖Ｇｌｃ耗尽时，菌体可以利用生成的乙酸作为碳源。乙酸的积累随葡萄糖初始浓度的增大而增加。以葡萄糖为限制性基质的连续培养结果表明，当比生长速率μ〉０．３３６ｈ＾－１，菌体开始产生乙酸，并且其比生成速率随着μ增大而增大，研究所得的这些规律有利于     

新建产PHB基因工程菌VG1(pTU14)的碳源代谢

为解决聚 β-羟基丁酸酯 (PHB)生产过程中的高成本问题 ,构建了具有高溶氧利用能力及可自动裂解破壁的PHB高产基因工程菌 VG1(p TU14)。对该重组菌的葡萄糖耐受能力、乙酸的辅助同化作用及较廉价的淀粉水解液替代葡萄糖的可行性等进行了研究。该重组菌可以在初糖浓度2 0 0 g/ L 的培养基中良好生长 ;无机氮源乙酸铵可同时提供乙酸作为辅助碳源 ;采用淀粉水解液可以完全替代葡萄糖 ,发酵结束时菌体生长和 PHB积累均提高 ,还原糖利用率也可达到 99%以上。     

透明颤菌血红蛋白基因在产TRAIL蛋白大肠杆菌中的克隆表达

为解决大肠杆菌高密度发酵生产TRA IL过程中的供氧矛盾,提高菌体的发酵密度,在大肠杆菌中引入透明颤菌血红蛋白基因(vgb)。聚合酶链反应(PCR)检验和CO差光谱法检验表明:vgb基因能够在C 600(pBV 220-TRA IL)中表达并受溶氧调控,重组菌CTV具有良好的遗传稳定性。3.7 L发酵罐实验表明:在同样的发酵条件下,含vgb基因的重组菌CTV的最高菌体密度为对照菌的1.64倍,达到50.6 g/L,乙酸积累为对照菌的55.6%,TRA IL蛋白产量提高了70%,达到2.8 g/L。     

重组抗栓人胰岛素基因工程菌高密度发酵研究

通过重组DNA技术构建抗栓人胰岛素突变体基因,并转化入大肠杆菌宿主菌,构建基因工程菌株.通过高密度发酵技术对重组菌株进行大规模培养.通过对培养条件包括温度、溶氧量、pH值、补料等的调整,达到最佳培养状态,进而获得高产量的重组大肠杆菌菌体.检测大量培养重组大肠杆菌的表达率,并对表达产物进行纯化与进一步的理化分析鉴定.     

pgpA和tdcG基因的敲除对大肠杆菌磷脂酰丝氨酸合成的影响

磷脂酰丝氨酸具有改善大脑的认知和记忆的功能,是医药和食品行业重要的原料.为进一步提高大肠杆菌(Escherichia coli)中磷脂酰丝氨酸含量,利用Red重组系统,以可积累磷脂酰丝氨酸的E.coli K12(△sda A△sda B△pgp B)为出发菌株,敲除pgp A和tdc G基因,切断与磷脂酰丝氨酸合成相关的L-丝氨酸和磷脂酰甘油磷酸的分解代谢途径.摇瓶发酵后的检测结果表明,重组菌株E.coli K12(△sda A△sda B△pgp A△pgp B△tdc G)中磷脂酰丝氨酸占菌体总磷脂的比例为2.5%,较出发菌株(1%)提高了1.5倍.     

人白细胞介素-15表达菌株的构建

从健康人外周血分离单核细胞,并提取总RNA,利用RT-PCR扩增出白细胞介素15(IL-15)基因.构建了重组表达菌株BL21(DE3)(pET28c(+)-IL-15).经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒(pET28c(+)-IL-15)含有IL-15基因.经Western blot鉴定证实为IL-15,并实现了在大肠杆菌中的高效表达.表达产物占菌体总蛋白的32%,从而为进一步研究IL-15的生物学功能和临床应用奠定了基础.     

大肠杆菌DH5α及其耐乙酸突变株生长和产乙酸规律

大肠杆菌DH5α的耐乙酸突变株DA19在复合培养基中有生长优势,最大比生长速率提高,产乙酸减少,对乙酸的耐受力增加。在基本培养基中DA19生长优势更加明显,消耗葡萄糖速率加快,单位菌体产乙酸得率YA/X比DH5α低,以消耗葡萄糖为基准的菌体得率YX/G提高。在添加乙酸的基本培养基中,DA19细胞浓度高于DH5α,更快利用葡萄糖。DA19在高葡萄糖浓度下(102g／L)也能良好生长,菌体浓度达26g／L,YX/G为0．257g／g。在变速补料分批培养中,DA19可以有效地控制乙酸的生成,细胞浓度达到20g／L,YX/G为0．360g／g,为其在高密度培养中的应用奠定了基础。     

鸡源致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

为了解鸡源致病性大肠杆菌的生物学特性和耐药性,试验通过采集病料、细菌分离培养、16S rRNA基因鉴定、致病性试验、药敏试验等方法。结果表明:分离出的20株细菌的培养特征、镜检特征均符合大肠杆菌特征;16S rRNA基因序列经BLAST比对与大肠杆菌同源性达99.9%～100%,确定20株分离菌为鸡源大肠杆菌;20株大肠杆菌的致病力为40%～100%;10株鸡源致病性大肠杆菌对15种抗菌药物均呈现多重耐药,耐药率为33.3%～93.3%,耐药情况较严重和复杂。     

重组锰超氧化物歧化酶工程菌摇瓶发酵条件的优化

通过单因素试验对重组锰超氧化物歧化酶(Recombinant Manganese Superoxide Dismutase,rMn-SOD)工程菌的摇瓶发酵的培养基(碳源、氮源、无机盐)和培养条件(接种量、乳糖浓度、时间、温度、摇床转速、pH值等)进行了初步优化.结果表明,工程菌发酵的优化培养基组分(质量分数)为:1.5%蛋白胨、1.5%酵母提取物、1.0%NaCl、0.4%KH2PO4、0.8%K2HPO4、1.5%(体积分数)甘油、0.2%NH4Cl和5 mmol/L MnCl2.乳糖诱导表达的优化条件为:以5%接种量培养5 h后,加入质量分数为0.25%的乳糖进行诱导表达6 h.当发酵温度为37℃、摇床转速为180 r/min、培养基的初始pH值为7.0时,表达的rMn-SOD的酶活力高.在优化条件下,工程菌的SOD活性达1 969.9 U/mL,比活力达1 081.8 U/mg.     

Construction and Expression of GST and Carbon Skeleton of Amatoxins Fusion Gene

The primer, AT Forl, AT For2 and AT Back, are designed and synthesized for adding-PCR that is used to construct the fusion GST-AT gene. Depending on two-time adding-PCR amplification and the insertion of coding sequence of octapeptide carbon skeleton into the 3‘ temfinus of GST gene, the authors get the masculine recon, pGAT-1, confirmed by sequence detemfination and analysis, whose ORF is read-through. After IPTG induction and partial purification, SDS-PAGE electrophoresis is employed to detect the gene expression. The expressions of total bacterial proteins are about 21.3%, 22.5%, 19.32%, 21.73% in E. coli BL21, DH5α, JM109 and Top10 strains, respectively. Considering the quantity of induced total bacteria, the E. coli BL21 is the best one among the four recipient strains.This article supplies an academic foundation for producing biological active amatoxins.     

过表达醛脱氢酶对Klebsiella pneumoniae合成3-羟基丙酸的影响

克隆了肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）及大肠杆菌（Escherichia coli）各自的醛脱氢酶基因puuC和aldH,获得了重组肺炎克雷伯氏菌K.p(pET-PK-puuC)和K.p(pET-PK-aldH),这两株菌均能以甘油为唯一碳源生产3-羟基丙酸（3-HP）。发酵实验结果显示K.p(pET-PK-puuC)的甘油转化率和单位菌体产量与野生菌相比分别提高了135%和18%;K.p(pET-PK-aldH)的3-HP产量达1.43g/L,是K.p(pET-PK-puuC)的1.8倍,比野生菌提高了81%,甘油转化率和单位菌体产量比野生菌分别提高了150%和88%。     

大肠杆菌ATCase抗反馈抑制突变体的构建及其对胞苷积累的影响

为解决胞苷生物合成途径中天冬氨酸氨甲酰转移酶受胞苷三磷酸反馈抑制调节的问题,通过对其碱基序列和蛋白质结构分析,利用基因定点突变的方法构建了大肠杆菌的ATCase突变酶,得到三个突变体:M1(H20L)、M2(K60E)、M3(K94E),并在E.coli DH5α中对融合蛋白进行了表达.酶活测定表明,M1、M2、M3的ATCase酶相对活性都比野生型M0的高,分别为野生型M0的1.10、1.22和1.37倍,且比活力都有不同程度提高.与含野生型pyrBI基因的M0相比,含突变型基因的M1、M2和M3均对15,mmol/L的CTP具有强的抗反馈抑制作用,且M1、M2和M3的抗CTP反馈抑制作用分别是M0的5.4、6.0和8.5倍.最后将各突变质粒转入到E.coli Cyt10(Δcdd)中进行发酵培养,结果表明,与未含突变基因菌株相比,各含突变基因菌株的胞苷积累量均有不同程度的提高,说明ATCase定点突变使胞苷的合成积累途径得到了不同程度的强化.     

腐殖酸肥料对尾巨桉苗木生长及生理的影响

通过对尾巨桉DH3229组培苗木施用原料来源不同的腐殖酸肥料,对比分析不施肥方式(施常规复合肥、桉专用肥、桉专用肥+泥炭腐殖酸、桉专用肥+风化褐煤腐殖酸肥)下桉树苗木生长及抗性生理特性差异.结果表明:施肥能明显促进尾巨桉DH3229苗木苗高、地径生长及干物质积累.其中,施桉专用肥+泥炭腐殖酸对苗高的促生效果比施桉专用肥+风化褐煤腐殖酸高2.03%,但二者均低于施桉专用肥处理;施肥处理极显著提高了尾巨桉地径生长,地径及其增长量均为对照的2倍以上,但添加腐殖酸与否对桉树地径生长的促进效果无明显差异;腐殖酸极大地促进了根的生物量累积,桉专用肥中添加泥炭和风化褐煤腐殖酸后,根生物量分别提高了8.5%和40.92%;施肥能明显提高或降低尾巨桉苗木叶片酶的活性,其中,施桉专用肥+泥炭腐殖酸对提高植株叶片的抗性生理能力比施桉专用肥+风化褐煤腐殖酸好.     

Nitrogen limitation of microbial decomposition in a grassland under elevated CO2

Carbon accumulation in the terrestrial biosphere could partially offset the effects of anthropogenic CO2 emissions on atmospheric CO2. The net impact of increased CO2 on the carbon balance of terrestrial ecosystems is unclear, however, because elevated CO2 effects on carbon input to soils and plant use of water and nutrients often have contrasting effects on microbial processes. Here we show suppression of microbial decomposition in an annual grassland after continuous exposure to increased CO2 for five growing seasons. The increased CO2 enhanced plant nitrogen uptake, microbial biomass carbon, and available carbon for microbes. But it reduced available soil nitrogen, exacerbated nitrogen constraints on microbes, and reduced microbial respiration per unit biomass. These results indicate that increased CO2 can alter the interaction between plants and microbes in favour of plant utilization of nitrogen, thereby slowing microbial decomposition and increasing ecosystem carbon accumulation.     

L-天冬氨酸转化菌发酵条件的优化

利用较为便宜的水解棉籽蛋白代替蛋白胨作为氮源 ,用葡萄糖部分代替富马酸作为复合碳源 ,培养产天冬氨酸酶的大肠杆菌。结果表明 ,改变培养基配比后 ,对菌体的总体酶活力 (即对底物转化能力 )影响不大 ,转化率可达 99%以上 ,通过上罐发酵初步估算可以节约培养基碳氮源成本大约 6 0 %。     

产苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌的培养

L-苯丙氨酸是人体8种必需氨基酸之一。酶法转化是目前生产L-苯丙氨酸的主要方法。为了提高苯丙氨酸解氨酶的产量,对可高效表达苯丙氨酸解氨酶基因的重组大肠杆菌JM105进行培养,对发酵过程中pH值对工程菌生长的影响进行了研究。结果表明,摇瓶培养条件下,控制发酵过程中发酵液的pH值可显著提高菌体产量,当控制pH值为7.0左右时,菌体量比对照高87%。在初始pH值为7.5的情况下,培养10h后将培养液pH值分别调整为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0,则以pH值为7.5时的菌体量最高。10L发酵罐中控制发酵液pH值为7.5,菌体密度可达A600=20mol/L（DCW=11g/L）,比不控制pH值高出33%。试验结果为进一步开展该工程菌的高密度培养提供了一定的参考。     

干旱影响森林土壤有机碳周转及积累的研究进展

随着全球气候变暖趋势加剧,伴之而来的干旱问题成为全球关注的热点。干旱对森林生态系统碳积累和周转可能产生显著影响,其主要过程包括植被地上部分和地下部分凋落物对土壤有机碳的输入、凋落物的分解及土壤有机碳的矿化等。笔者综合分析了近年来国内外相关研究成果,对干旱影响森林土壤有机碳的主要过程与机制进行了归纳和总结,结果表明:①干旱通过促进叶片提前脱落,短期增加森林凋落物量,长期干旱则影响森林植物生长,降低森林初级生产力从而降低植物地上凋落物量。轻度和中度干旱下植物为补偿水分缺失增加细根生物量维持植物生命力,重度干旱下植物丧失自我修复能力导致细根生物量降低,干旱也会造成细根死亡率增加。平均而言,全球范围内干旱会造成森林凋落物量降低(1.9%)和细根生物量降低(8.7%),最终减少植物有机碳向土壤的输入量。②干旱可通过改变凋落物化学性质,对分解者——土壤动物、微生物产生胁迫,从而引起凋落物分解速率下降(10%~70%)。干旱使凋落物碳氮含量变化,造成凋落物次生代谢物,如纤维素、木质素、单宁等积累,改变根系分泌物化学组分,从而影响凋落物分解。干旱导致真菌生物量和分解者等土壤动物丰度降低,增加分解者捕食压力,使相关微生物和酶活性下降,造成凋落物分解速率下降。③干旱驱动微生物群落组成变化(真菌细菌比、革兰阳阴细菌比增加),造成微生物生物量下降,活性减弱,此外还会降低腐食动物的摄食活性、酶活性,最终导致土壤有机碳矿化速率下降(10%~50%)。④干旱对土壤有机碳不同组分影响不同,干旱会减小土壤微生物生物量碳(MBC)库(2%~30%),造成表层土壤溶解性有机碳(DOC)积累(30%~60%)。而在全球范围内的不同区域,干旱对土壤有机碳积累的影响也不同,亚热带森林中干旱对土壤有机碳积累的影响多是负面的,热带森林中则相反。总体而言,干旱对森林土壤有机碳库储量影响可能不大,但降低了土壤碳周转效率。而森林土壤有机碳周转过程不仅受干旱这一单一因素影响,温度、物种等因素会共同作用于土壤有机碳的周转与积累,且单因子的简单叠加模拟可能与现实环境中多因子综合对土壤碳通量的影响有一定差别。未来需要通过长期观测、延长控制实验时间、模拟原生环境条件等,开展多因素综合实验,加强干旱对土壤动物和微生物影响的研究,以深入了解干旱对森林土壤有机碳影响的生物学与生态学的过程与机制。