p14ARF高表达对γ射线诱导的人黑色素瘤细胞凋亡的影响

抑癌因子ARF可以激活p53诱导细胞周期的阻断或凋亡. 为阐明ARF在促进细胞凋亡作用中的分子机理, 建立了高表达p14^ARF的人黑色素瘤A375细胞模型. 实验表明, p14^ARF高表达能促进p53富集在细胞核. 经 γ 射线照射后，发现p14^ARF高表达能促进A375细胞凋亡, 促使Smac从线粒体释放到胞质中, p53, Bax, Caspase-3, Caspase-9, p21^cip1和p27^kip1蛋白水平明显提高, 而Bcl-2和磷酸化的ERK蛋白水平下降. 提示γ 射线辐照下, p14^ARF促进A375细胞凋亡是ERK介入的依赖p53的以线粒体为核心的凋亡途径.     

Nutlin-3a可降低野生型p53肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性

p53通路在细胞周期停滞和细胞凋亡中起重要作用.p53的下降可增加肿瘤细胞对化疗或放疗的耐药性.小鼠双微蛋白2(murine double minute2,MDM2)可与p53结合,调节其转录活性和稳定性.本研究旨在观察MDM2拮抗剂Nutlin-3a在非小细胞肺癌野生型p53+/+A549细胞及p53-/-H1299细胞对紫杉醇的反应中的作用.研究发现,Nutlin-3a联合紫杉醇可使A549细胞G0-G1和G2-M期明显增多,S期显著减少;凋亡百分率显著低于单紫杉醇处理组与p53-/-的H1299细胞组.总之,Nutlin-3a联合紫杉醇大大减少了野生型p53+/+的A549细胞对紫杉醇的敏感性,Nutlin-3a对紫杉醇毒性的调控依赖于p53的状态,它可以保护野生型p53细胞免受有丝分裂抑制药物紫杉醇的杀伤.     

转抗细胞凋亡基因p35黏虫细胞克隆株研究

通过脂质体介导的方法将抗细胞凋亡p35基因导入黏虫细胞系Ms7311, 经Zeocin抗性筛选和细胞克隆, 获得了转基因细胞株TMs7311. PCR检测证明, 转基因细胞株基因组DNA中含有p35基因特异扩增谱带. 该转基因细胞株形态与原始细胞系不同, 生长速度快, 群体倍增时间为25.4 h, 对磷酸缓冲液(PBS)有较强的营养抗性, 能抑制放线菌素D诱导的细胞凋亡; 病毒产量和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)以及碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase, SEAP)的表达水平明显高于原始细胞系Ms7311, 是一株高表达重组蛋白和高产杆状病毒的优良细胞株.     

Bd-BH3结构域短肽对线粒体PTP的作用及其机制

在细胞凋亡过程中,线粒体通过释放促凋亡因子对细胞凋亡进行调控.而促凋亡因子的释放主要是由Bcl-2家族成员相互作用来调控的.Bcl-2家族成员在线粒体中的主要作用位点是内外膜接触点上的膜透过性转运孔(PTP).应用体外方法来探讨促凋亡蛋白Bid的BH3结构域短肽对线粒体及其PTP的作用.实验发现促凋亡蛋白Bid的BH3结构域短肽能作用于线粒体PTP,引起线粒体肿胀、跨膜电位下降和细胞色素c释放;而突变的Bid-BH3结构域短肽因为不能与抑凋亡蛋白Bcl-xL结合而没有上述作用.此外,Bcl-xL和环胞菌素A(CsA)能抑制Bid-BH3短肽引起的线粒体膜通透性改变.以上结果说明.Bid-BH3短肽通过作用于线粒体PTP而使得线粒体膜通透性改变,可能通过Bid-BH3与Bcl-xL的结合并抑制Bcl-xL的抑凋亡进而实现促凋亡作用,对合成的Bid-BH3短肽促凋亡作用的研究,为将来研究细胞凋亡调控药物提供了基础.     

p53修饰及其相互作用的研究进展

p53是一个重要的抑癌分子, 在抑制肿瘤发生发展过程中起关键作用. 正常生理状况下, p53水平很低, 细胞受到外界刺激后, p53水平升高, 稳定性增强, 继而参与细胞周期阻滞、细胞衰老、DNA修复或细胞凋亡等重要的生命过程. p53功能的精确调控至关重要, 涉及一系列翻译后修饰(泛素化、乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素样蛋白质修饰等等), 这些作用互相协作、相互影响, 从而精密调节p53的活性. 本文探讨p53的各种修饰作用, 并分析其各种修饰与肿瘤发生的相互关系, 为肿瘤的治疗提供一些参考价值.     

海灰翅夜蛾核型多角体病毒P49蛋白的表达及其抑制细胞凋亡的机制

一个新克隆的海灰翅夜蛾核型多角体病毒（SINPV）的p49基因可抑制病毒感染引起的昆虫细胞Sf9的凋亡。用杆状病毒表达系统表达的P49蛋白的氨基酸序列与推导的氨基酸序列致，证明p49基因编码序列经克隆后能够正确表达。体内标记显示，p49基因在感染早期及晚期均可表达，以多角体基因启动子驱动p49基因的表达只是在晚期，但表达量明显高于wtSINPV合成的P49蛋白。研究结果证实，SINPV的p49基因像其他杆状病毒的凋亡抑制基因（p35)一样也是一个早期基因，但在晚期也可表达，与多角体基因启动子比较，p49基因的启动子是一个较弱的启动子。P49蛋白在体外可被人Caspase及家蚕Caspase所切割，切割后均产生约10和40ku的2个片段。P49蛋白又可明显抑制人Caspase-及家蚕Caspase对其特异底物的切割，证明P49的凋亡抑制与下游Caspase有关。     

细胞凋亡的分子机理

细胞凋亡是一种细胞自主性死亡现象,与维持生物体正常生理功能和一些疾病的发生密切相关.最近发现,细胞凋亡的主要原因是毒物、射线等死亡信号通过死亡诱导信号复合体直接激活一组被称为caspases的蛋白酶系统.同时发现,死亡信号还可通过线粒体和一些癌基因相关蛋自如Bcl-2、P53、PML间接影响caspases的活性.最终影响凋亡的发生.     

四溴双酚A对人体呼吸系统细胞16HBE和Beas2B的接触暴露毒性机制

四溴双酚A(TBBPA)是一种应用量非常大的化学品,广泛用在印刷电路板以及其他聚合材料的阻燃剂中.作为一种环境污染物,其普遍存在于各种非生物和生物介质中.本研究采用人体支气管细胞Beas2B和肺上皮细胞16HBE作为研究对象,开展了TBBPA的接触暴露毒性研究.结果显示,随着TBBPA的暴露浓度从0μmol/L增加至50μmol/L,两种细胞的存活率均逐渐下降,细胞通透性不断提高.此外,流式分析也表明了细胞在暴露后出现了部分凋亡,且随着浓度的提高,凋亡率也随之提高.进一步通过基因表达测定分析发现,与细胞凋亡相关基因p53,Survivin, bax, bcl-2, Caspase-3, Caspase-9的表达量均出现不同程度的上调,其中24 h的暴露相较于12 h会激发更为强烈的表达上调.此外,对暴露过程中细胞胞内活性氧(ROSs)组分、抗氧化性酶SOD和CAT活力活性进行了测定.两种细胞内的ROSs组分和抗氧化性酶均出现明显的提高,表明细胞在TBBPA暴露过程中收到了一定的氧化损伤并出现了氧化应激.     

外源性p53基因对人胃癌细胞恶性增殖的影响

p53基因在细胞增殖调控过程中起重要作用,正常p53基因可使DNA受损的细胞增殖周期阻断在G1期以进行DNA修复,或启动细胞凋亡程序清除受损细胞,若p53基因缺失或突变,损伤后的细胞便会发生恶性增殖而形成肿瘤.约50%的人类肿瘤均有p53基因的异常改变.其中结直肠癌、肺癌、乳腺癌等常见肿瘤中p53基因的突变频率达50%～70%以上.基于这一原理,将野生型p53基因导入肿瘤细胞成为肿瘤基因治疗的策略之一.我国是胃癌高发区,胃癌发病率、死亡率在各类恶性肿瘤中均位居前列.因此,阐明胃癌发生发展过程中基因变异规律,探索胃癌治疗的有效方法,成为肿瘤研究的当务之急.研究表明胃癌中有较高频率p53基因缺失及突变,认为p53基因异常与胃癌发生、发展有重要关系.本项研究即是采用p53基因体外转染有缺陷的人胃癌细胞系,得到生长及致瘤性均有部分抑制的细胞,以探索采用p53基因治疗胃癌的可行性.1 材料与方法1.1 细胞培养及p53基因鉴定细胞:人胃癌BGC823细胞为北京医科大学附属人民医院建立,培养在含10%小牛血清的DMEM培养基中.染色体G带分析及荧光染色体原位杂交(FISH)显示有17号染色体部分缺失,Northern杂交分析也表明该细胞有p53基因表达水平下调.1.2 DNA转染通过脂质体介导将构建有野生型p53基因、突变型p53基因及无p5     

Bid-BH3结构域短肽对线粒体PTP的作用及其机制

在细胞凋亡过程中，线粒体中通过释放促凋亡因子对细胞凋亡进行调控。而促凋亡因子的释放主要是由Bcl-2家族成员相互作用来调控的。Bcl-2家族成员在线粒体中的主要作用位点是内外膜接触点上的膜透过性转运孔（PTP）。应用体外方法来探讨促凋亡蛋白Bid的BH3结构域短肽对线粒体及其PTP的作用。实验发现促凋亡蛋白Bid的BH3结构域短肽能作用于线粒体PTP，引起线粒体肿胀、跨膜电位下降和细胞色素c释放；而突变的Bid-BH3结构域短肽因为不能与抑凋亡蛋白Bcl-xL结合而没有上述作用。此外，Bcl-xL和环胞菌素A（CsA)能抑制Bid-BH3短肽引起的线粒体膜通透性改变。以上结果说明，Bid-BH3短肽通过作用于线粒体PTP而使得线粒体膜通透性改变，可能通过Bid-BH3与Bcl-xL的结合并抑制Bcl-xL的抑凋亡进而实现促凋亡作用。对合成的Bid-BH3短肽促凋亡作用的研究，为将来研究细胞凋亡调控药物提供了基础。     

杆状病毒诱导凋亡昆虫细胞中的线粒体反应和Ca2+的变化

以罗丹明123作为线粒体跨膜电位荧光标记探针, 流式细胞术和激光共聚焦显微镜研究显示, SfaMNPV诱导凋亡的斜纹夜蛾SL-1细胞, 线粒体跨膜电位(∆Ψm)产生明显改变, 病毒接种后4 h, 膜电位开始下降, 随着病毒感染进程的延续, 线粒体膜电位∆Ψm持续降低. 利用Western 杂交分析定位于线粒体的Bcl-2蛋白, 结果表明, 线粒体Bcl-2蛋白含量随病毒感染逐渐减小, 表达水平降低, 病毒感染下调了Bcl-2蛋白的表达. Western杂交检测到显示细胞色素c从线粒体向细胞质中释放, 并在细胞质逐渐积累, 呈时间依赖性特征. 病毒感染诱发的线粒体反应, 提示杆状病毒诱导昆虫细胞凋亡, 可能存在线粒体介导的凋亡信号转导途径. 以Ca²⁺荧光探针Fluo-3/AM负载, 激光共聚焦显微镜观察和荧光分光光度计测定凋亡细胞 [Ca²⁺]_i浓度的变化, 检测到病毒诱导凋亡细胞内的[Ca²⁺]_i浓度明显升高, 细胞外Ca²⁺内流; 在EGTA抑制胞外钙离子内流和细胞质Ca²⁺钳制状态下, PI染色后流式细胞仪检测显示细胞凋亡不受影响, 说明胞质内游离Ca²⁺升高和胞外钙离子内流不是细胞凋亡的主要诱因, 提示内质网钙库Ca²⁺排空可能是SfaMNPV诱导SL-1细胞凋亡信号转导通路中的重要媒介.     

电离辐射诱发小鼠骨髓细胞依赖和不依赖P53基因的凋亡

细胞凋亡(apoptosis)或程序性细胞死亡(programmed cell death),是一种具有典型形态学和生化特征的细胞死亡模式。在胚胎发育,T,B细胞成熟和内分泌相关的组织萎缩等生命过程中发生的细胞死亡,就是一种生理性细胞凋亡,以此控制体内细胞数量。辐射和某些抗肿瘤药物等DNA损伤因子,亦能诱发细胞凋亡,并与某些肿瘤相关基因的诱导表达和蛋白稳定性的改变等事件发生相关。P53基因是一种抑癌基因,参与细胞增殖调控,使细胞生长停滞于G_1期。近年发现,P53基因在细胞DNA受损伤后引发的细胞凋亡过程中也起重要作用。不同学者分别报道,电离辐射诱发小鼠胸腺细胞和小肠上皮细胞的凋亡,是依赖于P53基因,包括P53基因表达增加和P53蛋白稳定性增强。在P53基因缺失纯合子小鼠中,电离辐射就不能有效地启动上述组织细胞的凋亡机制。本文利用基因打靶技术产生的P53基因突变小鼠模型,研究不同P53基因状态下,即野生型(P53+/+)、杂合子(P53+/-)和纯合子突变型(P53-/-),电离辐射诱发小鼠骨髓细胞的凋亡。     

乳腺癌细胞株对TRAIL敏感性不同的分子机制

不同的乳腺癌细胞株对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的敏感性不同. 为了揭示其分子机制, 分别以对TRAIL敏感和不敏感的乳腺癌细胞株(MDA-MB-231和MCF-7)为模型, 比较分析了这2株细胞对重组可溶性TRAIL(rsTRAIL)的不同敏感性的分子机制. 首先使用不同的抑制剂分别阻断细胞内3条主要存活通路(PKCd, MAPK, PI3K)后, 研究细胞对rsTRAIL的敏感性, 结果表明, 阻断这3条存活通路, 都不影响MD-MB-231细胞对rsTRAIL的敏感性, 说明MD-MB-231细胞对rsTRAIL敏感与这3条存活通路无关; 以MEK1/2抑制剂阻断MAPK途径或以Ly294002阻断PI3K途径都不影响MCF-7细胞对rsTRAIL的敏感性; 但以PKCd抑制剂rottlerin抑制PKCd活性, 能显著促进rsTRAIL诱导的MCF-7细胞凋亡, 提示PKCd高表达可能是MCF-7细胞对rsTRAIL不敏感的重要原因. 应用RNA干扰技术抑制PKCd的表达, 确证PKCd高表达是MCF-7细胞对rsTRAIL不敏感的关键因素. 同时, 进一步证明 caspase-3 表达重建不能改变MCF-7 细胞中PKCd的总体表达水平, 说明凋亡执行蛋白酶caspase-3缺陷, 不是PKCd高表达的主要原因.     

JWA参与维甲酸、佛波酯和三氧化二砷诱导急性早幼

JWA基因是受维甲酸(RA)、 13顺-维甲酸(13-cRA)和佛波酯(TPA)等调控的细胞骨架相关基因. 以前的研究发现, JWA基因与细胞分化和凋亡有关. 为了探讨JWA基因在急性早幼粒细胞性白血病(APL)细胞分化和凋亡过程中的作用及机制, 分别用ATRA, 4HPR, TPA和As2O3处理NB4细胞, Western blot和RT-RCR检测JWA基因在蛋白和mRNA水平的表达, 同时检测细胞周期和CD11b, CD33细胞表面抗原, 分析细胞分化和凋亡. 结果表明ATRA和 As2O3分别诱导细胞分化和凋亡, 而4HPR和TPA对NB4细胞分化和凋亡有双重诱导作用. 在诱导细胞分化和凋亡过程中, JWA基因的表达水平均上调, 但PML / RARα 融合基因变化不明显; 用JWA反义核酸处理NB4细胞后, TPA诱导其分化和调亡的作用受到明显抑制. TPA对NB4的作用可能是通过由JWA参与的直接和间接两种途径实现的. 在对APL(M3)原代细胞的研究中除观察到与NB4细胞相似的JWA的变化外, 还发现一特异的与APL细胞分化和凋亡有关的异常分子量的JWA蛋白; 异常分子量的JWA蛋白是否是APL(M3)区别于NB4细胞的一种分子标志物以及JWA是否通过caspases信号调节通路参与NB4细胞分化和凋亡等均有待进一步研究证实.     

JDP2在神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞分化中的作用

c-Jun二聚化蛋白(JDP2)是AP-1家族成员, 参与基因的转录抑制. 为探讨JDP2在神经母细胞瘤分化过程中的作用, 构建了稳定整合有JDP2全长编码区的SH-SY5Y细胞株(SY5Y-JDP2). 实验结果显示, JDP2能促进SH-SY5Y细胞的分化. 与对照细胞相比, SY5Y-JDP2细胞在S期比例降低, 生长速率迟缓, 并且表现p21高水平表达, 在分化过程中cyclin D1降低. 由此可见, JDP2对生长的抑制作用可能是SH-SY5Y细胞撤出细胞周期进入分化的主要原因.     

基于分子信标对肿瘤细胞ING1转录水平调控的定量检测

利用分子信标检测技术, 结合建立的ING1分子信标/cRNA杂交标准曲线, 定量检测了药物处理, 基因转染和p53 RNA干扰(RNAi)等对肿瘤细胞ING1 mRNA表达水平的影响. 结果发现: 在低表达ING1的肿瘤细胞系MCF-7中, 5-FU处理和ING1基因稳定转染均能诱导细胞中ING1 mRNA表达水平升高; 在ING1表达水平正常的CNE2肿瘤细胞中, 利用RNAi 沉默p53表达引起ING1 mRNA表达水平降低. 这些细胞中ING1 mRNA表达水平在7.7×10^-16~53.4×10^-16 mol/mg总RNA. 该方法不仅能从转录水平上为基因表达调控效果提供定量依据, 而且有望用于信号通路途径中多基因转录水平的相互调节研究.     

基于分子信标荧光增强速率检测活细胞内p21 mRNA表达

根据肿瘤抑制基因p21序列设计合成分子信标,通过显微操作将其注入p21表达水平存在差异的两种鼻咽癌细胞内,以活细胞成像方式动态检测了分子信标进入鼻咽癌细胞后荧光信号的变化.p21分子信标注入两种细胞后,荧光信号均逐渐增强,约15min后达到最大值;注入细胞后4min内,细胞间荧光增强速率存在明显差异,该差异反映了p21mRNA表达水平的变化趋势,与常规逆转录PCR(RT-PCR)结果相符.在使用分子信标进行活细胞内mRNA表达水平的研究中,通过分析荧光增强速率的变化,可有效降低细胞内的酶的影响,提高检测结果的准确性.     

转录辅因子CBP/p300提高转录因子C/EBP介导的人白细胞介素5(IL-5)基因启动子活性

IL-5主要由Th2类细胞产生, 在过敏性哮喘等过敏性疾病的发生过程中起着关键的作用. 转录辅因子CBP/p300本身具有组蛋白乙酰转移酶活性, 参与许多基因的转录调控过程. 腺病毒E1A癌蛋白能与CBP/p300蛋白结合并抑制其活性. 我们分析了E1A蛋白在IL-5基因启动子/荧光素酶报告基因表达调控中的作用, 结果表明E1A蛋白能抑制PMA/离子霉素激活和转录因子C/EBPβ介导的IL-5基因启动子/荧光素酶报告基因的活性. 而突变体E1AΔ2-36蛋白因不能与CBP/p300蛋白结合而不能抑制IL-5基因启动子/荧光素酶报告基因的表达. 此结果揭示, 组蛋白乙酰转移酶CBP/p300参与IL-5基因启动子活性的调控. 另外, 转录辅因子CBP/p300和转录因子C/EBPβ可以协同地激活IL-5基因启动子/荧光素酶报告基因的表达. 为进一步研究IL-5基因表达调控的机制奠定了基础.     

小鼠腹腔抑制性巨噬细胞免疫调变涉及ERK1/2和p38 MAPK的激活与NO的生成？

探索了脂多糖（LPS）介导的小鼠腹腔抑制性巨噬细胞免疫调变的机理。通过对LPS调变巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶（iNOS)mRNA与iNOS蛋白表达以及一氧化氮（NO）产生的研究,分析了p38MAPK和ERK1／2信号分子的特异性抑制剂SB203580和PD98059对NO代谢途径和调变巨噬细胞功能的影响。实验证明,免疫调变巨噬细胞对K562肿瘤细胞的细胞静止效应似乎不依赖ERK1／2,p38MAPK信号通路和NO的产生,而对淋巴细胞的增殖效应却与ERK1／2,p38 MAPK和NO的产生密切相关。     

改造的腺病毒5型E1A基因对TNF-α诱导的猪血管内皮细胞中NF-κB活性的抑制作用

在延缓性免疫排斥反应(DXR)过程中, NF-κB发挥着关键作用. 如何恰到好处地抑制其活性是本领域研究的重要问题之一. 用改造的E1A基因(E1A)包括功能区(1 ~ 80氨基酸)和核定位区(139 ~ 243氨基酸), 删除其中可能对人体有害的CR2区, 将其克隆到真核表达载体pcDNA3中, 并转染猪血管内皮细胞(PAEC), 经G418筛选, 获得稳定表达细胞株. RT-PCR技术和细胞生长曲线分析, 证明E1AΔ基因能在PAEC中稳定表达, 且不影响细胞的正常生长, 并能抵抗肿瘤坏死因子-α (TNF-α)诱导的细胞凋亡. 报告基因分析表明, E1A(能抑制由TNF-α诱导的NF-κB活性, 其抑制率为53%, 对NF-κB信号转导途径下游的一个重要炎症基因--E-选择素基因的表达抑制率达63%. 综上, E1AΔ基因的这些功能基本符合异种器官移植中克服DXR的要求, 为利用E1AΔ基因克服DXR的可行性提供了实验依据.