JWA参与调控细胞分化的结构和功能

为阐明新基因JWA的结构特征、表达调节规律和生物学功能，通过基因重组和测序，确定了大鼠JWA同源基因和人JWA基因621bp的启动子序列；用RT－PCR法，分析了培养细胞株和原代白血病细胞经药物处理后JWA mRNA的表达情况，发现TPA处理后JWAmRNA水平在肿瘤细胞株与非肿瘤细胞株中呈反向变化：用维甲酸治疗前的M3型白血病人骨髓白细胞，其JWA基因对多种诱导分化剂处理不敏感；而用维甲酸治疗10d后再用诱导分化剂处理，则JWA基因的转录水平均被下调，提示M3型白血病细胞在ATRA作用下的分化可能是启动JWA信号转导通路的前提。而JWA基因的表达下调是否为白血病细胞进一步分化及4HPR，As2O3和TPA等诱导细胞凋亡所必需，值得进一步探讨。JWA基因在不同种属中保持较为稳定的序列特征，说明该基因在生物进化中可能较保守并可能具有相近的生物学功能。     

JWA参与维甲酸、佛波酯和三氧化二砷诱导急性早幼

JWA基因是受维甲酸(RA)、 13顺-维甲酸(13-cRA)和佛波酯(TPA)等调控的细胞骨架相关基因. 以前的研究发现, JWA基因与细胞分化和凋亡有关. 为了探讨JWA基因在急性早幼粒细胞性白血病(APL)细胞分化和凋亡过程中的作用及机制, 分别用ATRA, 4HPR, TPA和As2O3处理NB4细胞, Western blot和RT-RCR检测JWA基因在蛋白和mRNA水平的表达, 同时检测细胞周期和CD11b, CD33细胞表面抗原, 分析细胞分化和凋亡. 结果表明ATRA和 As2O3分别诱导细胞分化和凋亡, 而4HPR和TPA对NB4细胞分化和凋亡有双重诱导作用. 在诱导细胞分化和凋亡过程中, JWA基因的表达水平均上调, 但PML / RARα 融合基因变化不明显; 用JWA反义核酸处理NB4细胞后, TPA诱导其分化和调亡的作用受到明显抑制. TPA对NB4的作用可能是通过由JWA参与的直接和间接两种途径实现的. 在对APL(M3)原代细胞的研究中除观察到与NB4细胞相似的JWA的变化外, 还发现一特异的与APL细胞分化和凋亡有关的异常分子量的JWA蛋白; 异常分子量的JWA蛋白是否是APL(M3)区别于NB4细胞的一种分子标志物以及JWA是否通过caspases信号调节通路参与NB4细胞分化和凋亡等均有待进一步研究证实.     

JWA参与维甲酸、佛波酯和三氧化二砷诱导急性早幼粒细胞性白血病细胞分化和凋亡的可能机制

JWA基因是受维甲酸（RA）、13顺－维甲酸（13－cRA）和佛波酯（TPA）等调控的细胞骨架相关基因，以前的研究发现，JWA基因与细胞分化和凋亡有关，为了探讨JWA基因在急性早幼粒细胞性白血病（APL0细胞分化和凋亡过程中的作用及机制，分别用ATRA，4HPR，TPA和As2O3处理NB4细胞，Westernblot和RT0RCR检测JWA基因在蛋白和mRAN水平的表达，同时检测细胞周期和CD11b，CD33细胞表面抗原，分析细胞分化和凋亡，结果ATRA和As2O3分别诱导细胞分化和凋亡，而4HPR和TPA对NB4细胞分化和凋亡有双重诱导作用，在诱导细胞分化和凋亡过程中，JWA基因的表达水平均上调，但PML／RARα融合基因变化不明显，用JWA反应核酸处理NB4细胞后，TPA诱导其分化和凋亡的作用受到明显抑制，TPA对NB4的作用可能是通过由JWA参与的直接和间接两种途径实现的，在对APL（M3）原代细胞的研究中除观察到NB4细胞相似的JWA的变化外，还发现一特异的与APL细胞分化和凋亡有关的异常分子量的JWA蛋白；异常分子量的JWA蛋白是否是APL（M3）区别于NB4细胞的一种分子植物志以及JWA是否通过caspases信号调节通路参与NB4细胞分化和凋亡等均有待进一步研究证实。     

维持Oct-4基因表达对小鼠胚胎干细胞分化的影响

通过导入外源性表达的Oct-4基因,使小鼠胚胎干细胞（ES细胞）在维甲酸诱导分化后仍继续维持Oct-4基因的表达,建立了Oct-4基因维持表达的ES－O细胞株。研究发现,在缺乏干细胞分化抑制因子LIF的情况下,Oct-4基因的维持表达本身并不能维持ES－O细胞的干细胞特性;在LIF存在时,Oct-4基因的维持表达增强了ES－O细胞维持干细胞未分化状态的能力, 而且部分抑制了维甲酸诱导的细胞分化,说明Oct-4基因与LIF协同作用才能维持ES细胞的未分化状态,在细胞分化过程中,ES－O细胞倾向于向神经细胞分化,提示Oct-4基因的维持表达可能与神经外胚层分化相关。     

DPH2L基因在细胞分化/凋亡中的降调节——mRNA差异显示的应用

为鉴定维甲酸诱导的人肺癌细胞分化/凋亡相关基因,采用mRNA差异显示的方法对全反式维甲酸处理前后的人肺腺癌细胞系GLC82的mRNA表达模式进行了分析。6个cDNA片段被分离和克隆。其中1个对应于序列已知而功能未知的人DPH2L基因。该基因的2.3kb全长cDNA最初是从人卵巢癌的关键缺失位点17p13.3上分离出来,并被认为是一个候选的肿瘤抑制基因。结果显示DPH2L是一个广泛表达的基因,除已报道的2.3kb转录本外,还有另外一个1.7kd的主要转录本。在全反式维甲酸和N-（4-羟苯）维甲酰胺4HPR诱导的几种肿瘤细胞的分化/凋亡过程中DPH2L呈降调节,由此提示DPH2L可能并不起肿瘤抑制基因的作用,相反,它的降调节可能参与了从细胞生长到细胞分化或凋亡的转换过程。     

JWA蛋白在细胞内与α-微管蛋白的共定位

探讨了JWA在细胞内的分布特征, 特别是在有丝分裂过程中的动态变化及与α-微管蛋白的关系. 用免疫共沉淀方法研究JWA与α-微管蛋白的相关性; 用基因转染技术研究JWA蛋白高表达后JWA蛋白和α-微管蛋白的相互关系; 用荧光显微镜技术研究低温处理、药物阻滞细胞周期、JWA反义寡核苷酸处理的PC12细胞JWA蛋白和α-微管蛋白的相互作用; 分别用流式细胞仪分析和激光共聚焦技术检测PC12细胞的各细胞周期蛋白在细胞内的分布. JWA作为一种新的微管相关蛋白, 在微管动力学变化过程和细胞周期不同阶段与α-微管蛋白分布平行, 可能对微管具有稳定作用.     

cAMP信号通路在维甲酸诱导分化中的作用

维甲酸是一种经典的诱导分化剂,对急性早幼粒细胞性白血病、胚胎癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌等多种组织来源的肿瘤均有明显诱导分化作用.目前普遍认为,维甲酸是通过核内维甲酸受体发挥作用,转录调控肿瘤细胞中异常的基因表达谱使其向正常变化,从而达到诱导分化目的.有研究表明维甲酸诱导分化过程中,除上述机制外,尚有多条信号路径可能参与其中.本文回顾了相关文献.提出cAMP-PKA信号途径是维甲酸实现诱导分化不可缺少的重要组成部分这一概念,并初步探讨了维甲酸与cAMP-PKA信号间相互作用的机制.     

bcl-2基因在蛇毒诱导的血管内皮细胞凋亡中表达增加

通过去除培养液中生长因子和向培养液中加入响尾蛇毒两种方法诱导人脐带静脉血管内皮细胞发生凋亡中 用ｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ方法检测被片处理细胞的ｂｃｌ－２基因的表达,结果表明在正常２的细胞和用去除生长因子诱导亡垢细胞中未检测到ｂｃｌ－２基因的表达,而在１０μｇ／ｍｌ的蛇毒诱导细胞凋亡６ｈ后ｂｃｌ－２基因表达增加,并且其ｍＲＮＡ剪接为两条首次发现ｂｃｌ－２基因在蛇毒诱导的血管内皮细胞凋亡中表达增加和剪接     

红细胞分化相关基因EDRF2抑制K562细胞中α-珠蛋白基因的表达

EDRF2是一个红细胞分化相关因子, 它在分化后的K562细胞中被诱导表达. Northern blot结果显示, EDRF2全长mRNA约500 bp. 利用RACE技术, 成功扩增了EDRF2mRNA完整的5′-和3′-末端. EDRF2正义和反义cDNA在K562细胞中稳定表达. Northern blot分析表明, EDRF2能抑制α-珠蛋白基因的表达, 而对γ -珠蛋白基因的表达没有明显的调节作用. 凝胶阻滞电泳的结果显示, EDRF2对GATA-1, NF-E2和AP1(c-Jun/c-Fos)等转录因子的DNA结合活性没有明显的调控作用. GATA-1的负调控因子PU.1表达被EDRF2上调, 提示EDRF2很可能是红细胞分化的负调控转录因子, 与PU.1协同作用, 下调α-珠蛋白基因在K562细胞中的表达.     

红细胞分化相关基因EDRF6抑制K562细胞中α—珠蛋白基因的表达

EDRF2是一个红细胞分化相关因子，它在分化后的K562细胞中被诱导表达。Northern blot结果显示。EDRF2全长mRNA约500bp。利用RACE技术，成功扩增了EDRF2 mRNA完整的5‘－和3‘－末端。EDRF2正义和反义cDNA在K562细胞中稳定表达。Northern blot分析表明，EDRF2能抑制α－珠蛋白基因的表达，而对γ－珠蛋白基因的表达没有明显的调节作用。凝胶阻滞电泳的结果显示，EDRF2对GATA－1，NF－E2和APl(c-Jun/c-Fos)等转录因子的DNA结合活性没有明显的调控作用。GATA－1的负调控因子PU。1表达被EDRF2上调，提示EDRF2很可能是红细胞分化的负调控转录因子，与PU．1协同作用，下调α－珠蛋白基因在K562细胞中的表达。     

酵母双杂交技术构建重组维甲酸X受体(RXR)基因酵母

应用酵母双杂交技术构建重组维甲酸X受体(RXR)基因酵母, 用以筛选具有类/抗维甲酸活性的化合物. 构建含有RXR基因的酵母表达质粒pGBT9-RXRβ, 称为诱饵质粒; 构建含有RXR协同激活因子GRIP1基因的酵母表达质粒, 形成靶质粒pGAD424-GRIP1; 诱饵质粒和靶质粒同时转染酵母细胞Y187, 于营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu)上筛选阳性菌落, 构建RXR-GRIP1双杂交酵母. 考察RXRβ-GRIP1酵母与典型的RXR配体化合物天然激素-9-顺维甲酸的结合情况. 结果表明, 9-顺维甲酸能够诱导RXRβ-GRIP1酵母酶活性, 并存在显著的剂量-效应关系, EC₅₀值为1.5×10^-7 mol·L^-1. 构建的 RXRβ-GRIP1 酵母与报道的RXRβ- TIF2酵母相比, 对9-顺维甲酸的EC₅₀值接近, 但诱导活性较高. 进一步建立了检测环境污染物诱导/抑制RXRβ-GRIP1酵母β-半乳糖苷酶活性的实验方法, 用于检测三丁基锡乙酸盐化合物、Aroclor1254以及水厂进水和出水样品. 证明三丁基锡乙酸盐能够较强地诱导RXRβ-GRIP1酵母酶活性; 而Aroclor1254能够显著抑制9-顺维甲酸诱导的RXR酶活性, 是RXR拮抗剂; 水厂进水样品能够抑制9-顺维甲酸诱导的酶活性, 而现行工艺对RXR拮抗剂有很好的去除效果. 证实了该重组基因酵母用于环境污染物类/抗维甲酸干扰效应的筛选可行性.     

基于分子信标对肿瘤细胞ING1转录水平调控的定量检测

利用分子信标检测技术, 结合建立的ING1分子信标/cRNA杂交标准曲线, 定量检测了药物处理, 基因转染和p53 RNA干扰(RNAi)等对肿瘤细胞ING1 mRNA表达水平的影响. 结果发现: 在低表达ING1的肿瘤细胞系MCF-7中, 5-FU处理和ING1基因稳定转染均能诱导细胞中ING1 mRNA表达水平升高; 在ING1表达水平正常的CNE2肿瘤细胞中, 利用RNAi 沉默p53表达引起ING1 mRNA表达水平降低. 这些细胞中ING1 mRNA表达水平在7.7×10^-16~53.4×10^-16 mol/mg总RNA. 该方法不仅能从转录水平上为基因表达调控效果提供定量依据, 而且有望用于信号通路途径中多基因转录水平的相互调节研究.     

镧和钆对DU145细胞诱导的前成骨细胞和破骨细胞分化的影响

为探索稀土化合物在防治前列腺癌骨转移方面的潜在药理作用,研究了镧(La)和钆(Gd)对前列腺癌细胞DU145诱导的成、破骨细胞分化的影响.实验结果表明,DU145细胞的条件培养基能够促进小鼠前成骨细胞MC3T3-e1的增殖、ALP活性和钙沉积,而且经La处理后作用进一步加强.然而Gd处理后的DU145细胞条件培养基组对MC3T3-e1的ALP活性和钙沉积影响并不显著.RT-PCR实验表明,La可能通过上调DU145细胞分泌的细胞因子BMP6表达,抑制Noggin的表达进而促进成骨细胞的增殖和分化;而且成骨细胞的增殖、分化与JNK信号转导通路有关.此外,还观察到La能够抑制DU145细胞诱导的破骨细胞生成,并且通过下调前列腺癌细胞RANKL的表达而起到抑制作用.然而Gd对DU145细胞诱导的破骨细胞生成的影响并不显著.     

DPH2L基因在细胞分化/凋亡中的降调节——mRNA差异显示的应用

为鉴定维甲酸诱导的人肺癌细胞分化／凋亡相关基因,采用ｍＲＮＡ差异显示的方法对全反式维甲酸处理前后的人肺腺癌细胞系ＧＬＣ８２的ｍＲＮＡ表达模式进行了分析。６个ｃＤＮＡ片段被分离和克隆。其中１个对就于序列已知而功能未知的ＤＰＨ２Ｌ基因。该基因的２．３ｋｂ全长ｃＤＮＡ最初是从人卵巢癌的关键缺失位点１７ｐ１３．３上分离出来,并被认为是一个候选的肿瘤抑制基因。结果显示ＤＰＨ２Ｌ是一个广泛的基因,除已报道的２     

胞内区功能缺失的EGFR基因对胚胎生殖细胞系EG4分化的影响

EG4细胞是由10．5d胎龄的129/svJ小鼠原始生殖细胞经体外培养得到的多干细胞系,EG4细胞的发育多能性使其可作为研究细胞分化的体外模型,通过基因转染的方法获得能表达胞内缺失的外源EGFR^d基因的EG4细胞,定名为EG4－EGFR^d,分析其生长分化特性,发现：（1）EG4－EGFR^d细胞可在未分化状态下维持长时间的增殖;（2）经维生素A酸（RA）诱导后,作为对照组的大部分EG4细胞和转染空白质粒的细胞分化为脂肪细胞,而EG4－EGFR^d细胞的分化趋势不明显,表明EGFR在脂肪细胞的发育分化中具有一定的调节作用;（3）EG4细胞接种小鼠皮下,长出的肿块切片分析显示,突变型肿块组织含有大量的未分化细胞和结缔组织,发化细胞以骨骼肌为主,对照组主要含软骨细胞、角质和上皮细胞以及神经管等分化组织,结果表明,EG4细胞的EGFR信号传导系统受抑制后,阻碍了依赖EGFR的细胞分化。     

K-RRneo细胞生长与分化特性的检测

细胞分化实质上是基因的选择性表达和特异性蛋白质的合成.珠蛋白基因开启、血红蛋白表达是红系细胞分化的典型标志.当红系细胞癌变时这一分化特征丧失,机理未明.薛社普等经过大量的研究发现,骨髓瘤细胞与网织红细胞同种或异种间进行杂交后,在出现去恶性分化特征(癌基因表达抑制/关闭)的同时,往往伴有珠蛋白基因产物(血红蛋白)的表达.我们报道了兔网织红细胞与人红白血病细胞K_(562)融合后形成的K-RRneo细胞生长活动较     

青蒿琥酯对人白血病K562 细胞凋亡抑制蛋白表达的影响

用Western blot 法检测青蒿琥酯对白血病K562 细胞的X 染色体连锁凋亡抑制因子 (X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)、存活素(Survivin)、细胞凋亡抑制蛋白1 (cellular IAP1, cIAP-1)和细胞凋亡抑制蛋白2 (cellular IAP2, cIAP-2)表达的影响, 以及对K562 细胞半胱 氨酸天冬氨酸酶3 (caspase-3)和多聚ADP-核糖聚合酶裂解片段(poly ADP-ribose polymerase cleavage, PARP cleavage)的作用. 青蒿琥酯能够下调XIAP, Survivin 和cIAP-2 的表达, 上调 caspase-3 活化亚基(17 kD)和PARP cleavage (85 kD)的表达. 青蒿琥酯通过下调XIAP, Survivin 和cIAP-2 的表达来诱导白血病细胞凋亡, caspase-3 也与诱导白血病细胞凋亡有关.     

棉花细胞初始脱分化的基因差异表达分析

植物激素诱导初期是体细胞胚胎发生的关键时期, 它包含了一个通过细胞脱分化获得细胞全能性的过程. 为了揭示棉花细胞脱分化的分子机制, 利用抑制差减杂交方法建立了一个cDNA文库. 共有286个差异表达的cDNA克隆测序并鉴定, 112个独立的EST在激素诱导初期明显地上调表达, 其中有40.2%的EST是第一次被分离鉴定. GST在植物激素诱导初期的6~24 h高度表达, PRPs在不同的处理中优势表达并表现出不同的表达模式, 表明它们与棉花细胞脱分化关系密切. 棉花SAM代谢途径中假定的GhSAMS, GhSAMDC, GhSAHH和GhACO3被鉴定, qRT-PCR分析表明, 它们的表达水平在激素诱导初期出现两次明显的上升/下降过程, 且GhSAMS和GhSAHH表现出高度正相关, 高表达水平的GhSAMS可能与脱分化细胞重新进入细胞周期密切相关. 组织形态学观察进一步表明, 2,4-D处理条件下的部分细胞在72 h内完成脱分化和分裂过程, SAM-dependent转甲基途径可能通过两次转甲基活性的改变调控棉花细胞脱分化过程. 此外, 差异表达基因在不同处理中的表达模式表明了2,4-D和激动素之间存在着复杂互作关系.     

HSV-1的microRNA-LAT基因修饰人骨髓间充质干细胞的体外研究

人骨髓间充质干细胞(HMSCs)具有强大的多向分化潜能, 能为组织移植和体外基因传递载体. 单纯疱疹病毒1型(HSV-1)不仅具有嗜神经元性, 而且对HMSCs也具有很强亲嗜性, 可作为HMSCs的基因修饰载体, 主要通过其自身携带的microRNA-LAT发挥抑制凋亡作用. 本研究构建针对microRNA-LAT的特异性茎环结构的逆转录引物, 并用特殊探针的real-time RT-PCR方法检测HMSCs细胞质中成熟microRNA-LAT的相对定量水平. 采用顺铂诱导对照法观察HSV-1对HMSCs的作用. 通过观察HMSCs细胞形态和流式细胞仪检测细胞凋亡率, 评测HSV-1引起的HMSCs抗凋亡功能; 同时采用RNAi方法, 化学合成TGF-β信号传导通路中SMAD3及TGF-β1靶点的siRNA和microRNA- LAT siRNA. 从基因mRNA, microRNA和蛋白质水平, 分别采用RT-PCR, real-time RT-PCR和Western blotting方法, 检测HMSCs中microRNA-LAT和SMAD3及TGF-β1表达水平及其相互关系. 结果表明, 与单纯顺铂诱导对照组相比, HSV-1组和microRNA- LAT组HMSCs凋亡细胞数减少, 细胞凋亡率降低(P < 0.05), 具有抗凋亡作用; 在TGF-β信号传导通路中, HSV-1组和microRNA-LAT组TGF-β1与 SMAD3靶点基因在mRNA水平及蛋白水平的表达量均观察到一定程度降低, 且降低水平与采用RNAi法的SMAD3组和TGF-β1组相类似. Real-time RT-PCR结果显示, 与空白对照组相比, 顺铂组HMSCs细胞质中成熟microRNA-LAT mRNA水平有所降低(P < 0.05). 据此, HSV-1 及其microRNA-LAT可敲除SMAD3和TGF-β1基因, 下调TGF-β信号传导通路表达而对顺铂诱导的HMSCs凋亡有拮抗作用. 本研究结果证明, HSV-1自身携带的microRNA-LAT对HMSCs细胞TGF-β信号传导通路中的SMAD3和TGF-β1具有精细调节和基因修饰作用, 使HMSCs具有抗凋亡功能, 并且HSV-1可作为针对HMSCs的特殊基因修饰候选载体.     

MRP反义RNA对肺癌细胞耐药的逆转作用

肿瘤耐药是临床肿瘤治疗的普遍现象,大多数肺癌病人一般对化疗没有反应,而肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,死亡率很高,目前仍无良好的治疗方法,因此研究其耐药生物学对治疗至关重要.肺癌中非小细胞性肺癌(NSCLC)的化疗敏感率较低.除MDRI基因和GST-π基因作用以外,最近发现另一个基因MRP也与肺癌耐药密切相关.我们在研究阿霉素诱导肺腺癌细胞系的耐药株(GAOK)时发现MDRI基因反义RNA不能完全抑制其耐药表型,进一步研究发现GAOK细胞MRP基因也表达增高,为了研究MRP基因在GAOK细胞耐药中的作用大小,并探讨逆转其耐药的可能性,用逆转病毒载体将MRP基因反义RNA导入耐药GAOK细胞中,观察其对MRP表达及其介导的耐药性变化.