一个水稻大叶角度突变体lla的遗传分析及基因克隆

突变体是遗传学研究的基本材料. 利用突变体克隆水稻基因, 并进而研究基因的生物学功能是水稻功能基因组学的重要研究内容. T-DNA标签法是众多克隆植物基因方法的一种. 其优点是一旦确定突变性状由T-DNA插入引起, 就可以通过测定T-DNA的旁侧序列而快速分离到相应的突变基因. T-DNA标签法已广泛应用于拟南芥基因克隆中, 据统计有40%的拟南芥突变基因是用T-DNA标签法克隆的[1]. 近年来, 国内外众多研究人员采用不同的T-DNA标签系统构建了大量的水稻T-DNA插入突变体库[2~6]. 目前, 已有3例用T-DNA标签法成功分离水稻基因的报道[7~9]. ......     

用ENU诱变产生斑马鱼胚胎发育突变体

斑马鱼作为一种脊椎动物发育模型，正越来越受到重视。用ENU诱变的方法，建立了320个斑马鱼F2家系。通过对F3代胚胎的表型观察，鉴定在外包、体轴、体节、头部、心血管系统等表现异常的突变体。目前已获得35个突变品系，其中以体轴和体节异常的突变体为主。这些突变体斑马鱼品系的建立为克隆突变的基因、研究胚胎早期发育机制打下了良好的基础。     

用ENU诱导斑马鱼突变的初步研究

斑马鱼作为一种脊椎动物发育模型, 正越来越受到重视. 用ENU诱变的方法, 建立了320个斑马鱼F2家系. 通过对F3代胚胎的表型观察, 鉴定在外包、体轴、体节、头部、心血管系统等表现异常的突变体. 目前已获得35个突变品系, 其中以体轴和体节异常的突变体为主. 这些突变体斑马鱼品系的建立为克隆突变的基因、研究胚胎早期发育机制打下了良好的基础.     

抑制消减杂交及反Northern结合高通量筛选食管癌中差异表达基因

为了解食管癌发生的分子遗传学机理，分离食管癌中差异表达的基因，应用抑制消减杂交（SSH）并与PCR合成双链cDNA，反Northern克隆相结合，成功地自微克级总RNA中分离出8个食管癌中差异表达的基因，其中已知基因5个、新基因片段3个，表达下调的6个、表达上调的2个，中－高丰度基因6个、低丰度基因2个，结果显示多个基因的表达改变参与了食管癌的发生发展，其中新发现的lipocortin I,cystatin A,cystatin B,cytoderatin等13个可能与食管癌的去分化、恶性增殖转化有关，SSH与PCR合成双链cDNA,反Northern筛选SSH克隆相结合，是一种高特异性、高通量的自微量RNA中检出差异表达基因的有效方法。     

我国现有的3类转Bt基因抗虫棉品系棉铃虫抗性的遗传分析

我国主有要３类转Ｂｔ基因抗虫棉，都已培育出品种或杂交种并在生产上推广利用。遗传分析表明，山西９４－２４、中心９４和Ｒ１９３类转Ｂｔ基因抗虫棉亲本品系对棉铃虫的抗性各由－对显性主基因控制，它们的抗虫基因非等位。山西９４－２４与Ｒ１９的Ｂｔ基因可能整合在陆地棉品种的同一梁色体上，表现为连锁遗传，山西９４－２４、中心９４、Ｒ１９３个抗虫棉品系间互交杂种抗虫性与亲本类似，表明抗虫基因在杂合状态下无共抑制现     

玉米遗传突变体群体创制和干旱反应突变体筛选与鉴定

利用自主性Mutator转座子玉米材料115F,330I,715D与玉米自交系材料B73,Mo17,97108,H9-21杂交,获得F1插入诱变群体,F1自交得F2群体.在田间观察F2单株的生物学特征及农艺学性状的表型变异,得到不同表型的突变体,对突变体进行了统计分析.在干旱胁迫下,利用远红外热成像仪对室内小钵种植的F2群体三叶期幼苗进行叶片温度的大规模扫描检测,选取叶温有明显差异的植株作为潜在突变株,共检测了38000余株,成功筛选到108株抗旱单株,121株旱敏感单株.通过重复红外温度检测、叶绿素荧光分析、叶片失水、光合特性分析和可溶性糖类、可溶性蛋白和脯氨酸含量测定对突变体进行了初步的鉴定分析.利用MuTAIL-PCR对获得的突变体进行基因克隆.该研究为深入开展玉米抗旱育种提供了实验材料.     

利用鳞翅目来源的转座子piggyBac建立高效稳定的转基因家蚕技术

piggyBac转座子元件被成功应用于家蚕转基因. EGFP荧光蛋白基因作为筛选标志, 受含有Pax-6结合位点的启动子控制, 并能在家蚕的眼部组织中特异性表达. 荧光筛选质粒和piggyBac转座子表达质粒被以混合物的形式显微注射到家蚕受精卵, 获得出生的G₀代蛾子700个, 互相交配后, 利用EGFP荧光筛选获得111个独立的转基因系. 大部分转基因系在基因组上携有2个或多个插入拷贝, 并且在整个项目过程中转基因的表型稳定遗传6代以上. 对插入位点的序列鉴定发现, 其插入位点两侧具有特异性TTAA序列, 证实转基因的插入受到piggyBac转座子的调控. 高效稳定的家蚕转基因技术的建立为家蚕后基因组的研究和蚕业工业的发展提供了基础.     

大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因克隆及其原核表达载体构建、表达

通过ＰＣＲ方法克隆出大肠杆菌株Ｈ－３０的胞嘧啶脱氨酶基因，并将其起始密码子ＧＴＧ突变为ＡＴＧ，构建了ＣＤ基因的原核重组表达载体ＰＢＶ２２０－ＣＤ，通过测定胞嘧啶脱氨酶活性筛选出ＣＤ高表达活性克隆Ｈ－３０ＣＤ－１１５－氟胸嘧啶对ＣＤ活性克隆有杀灭毒性，ＤＮＡ序列分析显示ＣＤ高表达活性克隆Ｈ－３０－ＣＤ－１１较基因文库中所报道的ＣＤ基因存在１６个位点碱基改变，引起肽链中氨基酸改变的位点有５人。     

水稻5460F细菌人工染色体文库的构建和鉴定

温敏核不育水稻在杂交水稻的生产中具有重要的应用价值，前人的研究表明，该不育性状是由隐性单基因控制的，本室首次把该基因定位于水稻的第８染色体，并将命名为ｔｍｓｌ，为了构覆盖ｔｍｓｌ基因区域的精细物理图谱并最终克隆ｔｍｓｌ基因，利用１个改进的载体ＰＥＣＢＡＬ进行了温敏核不育水稻５４６０Ｓ的可育恢复突变体５４６０Ｆ细菌人工染色文库的构建。该文库由１６８９６个克隆构成，克隆片段平均大小为１１９ｋｂ相当于水     

一个水稻窄叶突变体的鉴定和基因定位

从粳稻品种“中花11”转基因后代中发现了一个窄叶突变体. 突变体表现为植株矮化、生育期延迟、叶片变窄及内卷和结实率降低等一系列突变表型. 窄叶突变体的剑叶在饱和光下净光合速率显著低于野生型, 在灌浆期剑叶的气孔导度和蒸腾速率也明显低于野生型. 遗传学分析表明, 该窄叶突变体表型受一对隐性核基因控制. 通过对突变体T₁代和T₂后代的分子检测发现, 该突变体表型非T-DNA插入引起. 利用籼粳杂交F₂群体对突变体位点进行了基因定位, 将其定位在第12染色体长臂上SSR标记RM7018和RM3331之间. 与经典的形态标记nal3(cul3)位于相同染色体区段, 故将该突变体暂定名为nal3(t). 随后, 利用已公布的水稻序列和SSR标记, 开发了6对新的STS标记, 进一步将窄叶基因nal3(t)定位在NS10和RH12-8之间, 遗传距离分别为0.58和0.26 cM, 物理距离约136 kb, 为进一步克隆nal3(t)打下了基础.     

水稻OsEBP-89基因部分转录本中第1内含子的滞留

OsEBP-89基因是水稻中一个转录因子编码基因。该基因含有两个内含子，采用RT－PCR和Southern杂交等方法的检测结果表明，在OsEBP-89基因的部分转录本中，115bp长的第1内含子未被剪接。从水稻cDNA文库也筛选到了仍然保护有第1内含子的OsEBP-89基因的cDNA克隆。OsEBP-89基因第1内含子不完全剪接的转录本与正常成熟转录本的比例在水稻不同组织中是不同的。这是真核基因中内含子滞留的一个新的例子。     

水稻早衰叶突变体es-t的遗传分析与精细定位

突变体es-t 是经EMS诱变处理日本晴后筛选获得的, 该突变体主要表现为叶片从苗期开始黄化, 叶绿素含量显著降低, 随着其生长发育发黄的叶片伴有铁锈色的小斑点, 尤以叶尖和叶缘为甚, 表现严重的早衰现象, 故将之命名为es-t (early senescence-temporary). 扫描电子显微镜显示, 突变体叶片表面比野生型的光滑, 且气孔周围缺乏硅质化突起; 另外, 突变体的叶绿体发育不正常, 含有大量大颗粒的淀粉粒; 组织切片则显示突变体的厚壁细胞及维管束的发育表现异常. 遗传分析表明, es-t 为新发现的早衰突变体, 受一隐性基因控制, 借助图位克隆的手段将之定位于42.1 kb 的物理区间内, 为进一步克隆该基因并阐明叶片早衰的分子机制奠定基础.     

一个新的水稻叶片和雌蕊发育异常突变体的遗传分析及其基因的分子标记定位

一个水稻突变体呈现叶片无中脉、内稃比外稃长、内外稃不闭合和雌芯同源异型转化为雄蕊或雄蕊／雌蕊中间器官等突变表型。用该突变体作父本，02428，N625，中丹2号和CDR22为母本配制杂交组合进行性状遗传分析，根据F2代植侏的表型及χ^2测验结果证明突变性状是由单陷性基因控制的。选用突变体为父本，N625为母本杂交的F2群体作定位群体，利用SSLP标记和RFLP标记将与突变性状相关的基因定位在第3染色体短臂上2个相近的分子标记之间，暂称为dl(t)。     

不能利用脯氨酸为惟一碳氮源生长的费氏中华根瘤菌突变株的筛选及鉴定

费氏中华根瘤菌可以利用脯氨酸作为唯一碳、氮源生长，本研究利用转座子Tn5gusA5随机插入诱变的方法得到6000多株突变子，并从中筛选到一株脯氨酸代谢缺陷的突变子GXHN100。通过插入位点的定位及序列分析，发现插入位点位于一个未确定功能的ORF内，将该ORF命名为pmrA（Proline metabolic relative ）。通过原位杂交从构建的部分基因文库中获得一个阳性克隆pGXHN100（含有3.3Kb外源片段），序列分析表明它包含了插入基因的完整序列。将3.3Kb的pGXHN100外源片段连接到广宿主载体pLAFR₃上获得重组质粒pGXHN200,通过三亲接合，将pGXHN200导入GXHN100获得互补菌株GXHN200。植株实验发现，突变体GXHN100结有效瘤，固氮酶活与出发菌株无显著差异，但结瘤时间延迟，结瘤效率及竞争结瘤能力下降。     

玉米遗传突变体群体创制和干旱反应突变体筛选与鉴定简

利用自主性Mutator转座子玉米材料115F,330I,715D与玉米自交系材料B73,Mo17,97108,H9-21杂交,获得F₁插入诱变群体,F₁自交得F₂群体. 在田间观察F₂单株的生物学特征及农艺学性状的表型变异,得到不同表型的突变体,对突变体进行了统计分析. 在干旱胁迫下,利用远红外热成像仪对室内小钵种植的F₂群体三叶期幼苗进行叶片温度的大规模扫描检测,选取叶温有明显差异的植株作为潜在突变株,共检测了38000余株,成功筛选到108株抗旱单株,121株旱敏感单株. 通过重复红外温度检测、叶绿素荧光分析、叶片失水、光合特性分析和可溶性糖类、可溶性蛋白和脯氨酸含量测定对突变体进行了初步的鉴定分析. 利用MuTAIL-PCR对获得的突变体进行基因克隆. 该研究为深入开展玉米抗旱育种提供了实验材料.     

水稻早衰叶突变体基因psll的遗传分析和精细定位

植物叶片是最主要的光合作用器官．作物叶片生长、发育和衰老的分子机理研究与提高作物产量形成密切相关．利用水稻中花11号经C0^60辐射产生的早衰叶突变体分别与南京6号和南京11号杂交的F1及其衍生的F2群体，对早衰叶突变体进行了遗传分析和基因定位．结果表明，该早衰叶突变体是由一隐性核基因psll控制，利用SSR标记把psll定位在水稻第2染色体上．利用已经公布的水稻基因组序列，在该基因附近区域发展了34对新的STS标记，对psll进行了精细定位．以此为基础，构建了覆盖psll区域的BAC重叠群，并把目标基因定位在一个约48kb的区段上，为最终克隆目标基因奠定了基础．     

水稻阶段性返白突变体的鉴定和候选基因分析

从粳稻品种中花11 的后代中发现了一个叶色突变体sgra, 该突变体幼苗期叶色正常, 而6~8 叶期以后新生叶白化, 随后白化叶转绿. 突变体的遗传分析表明, 该突变体表型受1 对隐性核基因控制. 利用籼粳杂交F2群体对突变位点进行了基因定位, 将其定位于水稻第11 染色体的2 个标记ID343-11 和PSM415 之间, 遗传距离分别为0.9 和1.0 cM. 随后, 利用已公布的水稻序列和SSR标记, 在两标记间发展了9 对新的标记, 进一步将SGRA基因定位在IDM-2 和RM26739 之间, 物理距离约为17.6 kb. 对野生型和突变体候选区段基因组DNA 测序分析表明, 候选基因编码一个ABC 转运蛋白.     

利用SSH技术研究小鼠淋巴组织中与束缚应激相关的基因

利用差异表达基因克隆技术减数杂交法,筛选束缚应激诱导小鼠淋巴组织特异表达或高表达基因。获得了应激状态下差异表达的ｃＤＮＡ片段,克隆化后挑选克隆测序。狭窄杂交结果表明Ｌ３６和Ｌ７两个克隆为应激诱导特异高表达的ｃＤＮＡ片段。经ＧｅｎＢａｎｋ检索,Ｌ７克隆只有片段同源序列而无全长同源序列,提示可能来自新基因。用ｏｒｔｈｅｒｎ杂交估算Ｌ３６和Ｌ７的转录基因分别为８００和７００ｂｐ。     

Mutator转座子介导的玉米插入突变体库的构建及遗传评价

以Q105, WW51, 115F, V26-2, 919J为Mutator转座子供体材料, 与本地优良玉米自交系受体材料Hz85, W328以及S-Mo17^Rf3Rf3杂交, 获得26718单株的插入诱变F₁群体(M1). 田间鉴定M1单株的生物学特征及农艺学性状的表型突变, 室内考察突变单株自交果穗M2籽粒性状的突变类型, 并以斑点籽粒出现的频率评价Mu因子的转座频率. 结果表明, 在所构建的Mu介导的玉米插入突变体库中, 以W328为母本(BzBz)的M1群体平均田间表型突变频率为0.07; 以W328 × Mu的M2果穗斑点籽粒的出现频率评价的Mu转座频率为0.121802; 在22500个S-Mo17^Rf3Rf3 × Mu单株中, 发现了5个S型玉米细胞质雄性不育突变单株, 突变频率为2.2×10^-4. 利用优化的MuTAIL-PCR技术分析了99条转座子插入位点的侧翼序列, 归并整理后获得59条(每条约400核苷酸序列)非重复靶位点序列. 对59条序列非重复的Mu因子插入产生的9 bp靶位点正向重复序列进行同源性比较分析, 结果表明, Mu的插入有序列热点. 经生物信息学分析后注释了27条与玉米、水稻等植物核苷酸数据库中匹配值较高的功能序列. 利用比较基因组学方法将36条单一基因序列定位在玉米遗传图谱上, 有多条Mu插入靶位点序列定位在单个标记位点上. 分析发现, 8条Mu插入靶位点序列的预测功能与其相应的定位标记的功能具有一致性. Mu插入突变体库的构建与遗传评价为利用Mu转座子进一步发掘玉米基因、深入开展玉米功能基因组学研究搭建起重要的技术与材料平台.     

水稻散生突变体的遗传和基因定位研究

分蘖角度是构成水稻理想株型和高产育种的重要农艺性状之一. 通过对水稻散生突变体的遗传学分析认为, 该散生表型受一隐性核基因控制, 与已报道的水稻散生突变体la等位, 故将此突变体命名为la-2, 而原突变体被重新命名为la-1. 利用la-2与w11和浙福802分别杂交产生的F₂群体对LA位点进行遗传定位, 发现其与第11号染色体上的微卫星标记RM202和RM229连锁, 遗传距离分别为10.0和8.0 cM. 通过进一步在两标记间发展的6个新的分子标记, 将该基因精确地定位于约0.4 cM的区间. 为进一步克隆LA基因和探讨水稻分蘖角度的控制机制奠定了良好的基础.