胡萝卜lea基因cDNA片段的克隆及其表达特性分析

在MS培养基中加入高浓度的蔗糖 ,可使胡萝卜体细胞胚的发育静止于子叶胚阶段 ,而当蔗糖浓度恢复到正常水平时 ,静止的体细胞胚便转入胚后发育 .采用RT_PCR的方法 ,从调控状态的胡萝卜体细胞胚中获得lea基因Dc3家族一个新成员的cDNA片段 .Northern杂交结果表明 ,该基因在调控状态的胡萝卜体细胞胚中具有强表达活性 ;在解调控 1 2h的胡萝卜体细胞胚中 ,表达活性明显降低 ;解调控 2 4h之后 ,其表达活性则基本消失 .由此及相关结果推测 ,通过改变培养基中的蔗糖浓度 ,可以使悬浮培养的胡萝卜体细胞胚胎重现类似于天然种子休眠与萌发的发育过程 .     

胡萝卜lea基因cDNA片段的克隆及其表达特性分析

在ＭＳ培养基中加入高浓度的蔗糖，可使胡萝卜体细胞胚的发育静止于子叶胚阶段，而当蔗糖浓度恢复到正常水平时，静止的体细胞胚便转入胚后发育。采用ＲＴ－ＰＣＲ的方法，从调控状态的胡萝卜体细胞胚中获得ｌｅａ基因Ｄｃ３家族一个新成员的ｃＤＮＡ片段。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果表明，该基因在调控状态的胡萝卜体细胞胚中具有强表达活性；在解调控１２ｈ的胡萝卜体细胞胚中，表达活性明显降低；解调控２４ｈ之后，其表达活性则基     

水稻紫黄质脱环氧化酶基因的克隆、体外表达及酶促反应

从水稻中克隆了紫黄质脱环氧化酶（VDE）基因，其全长cDNA序列为1887bp，编码446个氨基酸，其中转运肽长98个氨基酸，构建了该基因的原核表达载体pET-Rvde，在0.4mmol/L IPTG的诱导下，外源蛋白大量表达，其分子量与天然的VDE蛋白一致，表达量随诱导时间而增加。Western杂交表明表达蛋白与VDE的多克隆抗体有免疫反应，将表达蛋白用于紫黄质的脱环氧化反应，吸收光谱及HPLC分析结果表明，表达蛋白能在体外催化紫黄质转变成为玉米黄质和环氧玉米黄质。     

JUN和FOS基因增加水稻prolamin 4a基因的表达

水稻prolamin基因的表达具有发育(开花后种子成熟过程中)和组织(胚乳)的特异性,是研究基因表达调控的理想材料。目前,关于水稻prolamin cDNA和13,10kD prolamin的基因已经定序,而对其表达特异性在分子水平上的机理,尚未见报道. 周先锦、范云六报道了prolamin 4a基因启动子的序列并在转基因烟草植株中证实了该启动子的发育和组织特异性表达功能。该启动子属于13kD prolamin基因启动子,具有与     

非编码RNA: 比较近缘物种及寻找雄性功能基因

非编码RNA是近来发现的一类具有重要功能的基因. 本文针对“果蝇近缘物种间性腺特异ncRNA表达图谱存在显著差异”一文, 讨论其涉及的内容对ncRNA研究领域发展的意义. 该文采用比较基因组分析与基因间区RT-PCR相结合的简便而有效的非编码RNA检测手段, 在黑腹果蝇中鉴定出12个性腺特异性表达的非编码RNA基因, 并发现他们在黑腹果蝇及其近缘种间的表达存在差异. 这一结论一方面暗示了同一个非编码RNA基因在物种进化过程中演化出了各自的表达调控机制, 另一方面也为性别发育生物学和进化生物学研究提供了一个有价值的ncRNA基因的研究平台.     

白芷细胞外ECBP21全长cDNA克隆

ECBP21是从白芷悬浮培养细胞外检测并纯化的一种依赖钙的钙调素结合蛋白。利用RT－PCR和5‘-RACE方法，获得其cDNA全长。ECBP21 cDNA全长947bp，编码216个氨基酸，其中N端1－25氨基酸为信号肽，26－216氨基酸为成熟蛋白肽段，而且26－45氨基酸序列与纯化ECBP21N末端测序结果完全一致。将此cDNA成熟蛋白编码区核苷酸片段导入pET-28b( )表达载体中，并在大肠杆菌表达系统中诱导表达，经CaM-Gel overlay检测证实表达蛋白具有Ca^2 依赖的钙调素结合特征，从而进一步证实了cDNA克隆的正确性。这为进一步用分子生物学方法研究植物细胞外多肽ECBP21的生物学功能奠定了基础。     

胡萝卜根特异表达水通道蛋白基因DcRB7的分离及其启动子功能分析

从胡萝卜胚cDNA文库中分离得到一条完整的cDNA片段, 序列分析表明属于水通道家族新成员, 并与烟草根特异性表达TobRB7基因高度同源, 因此命名为DcRB7. Northern杂交分析表明DcRB7在根中特异性表达. 利用反向PCR技术, 分离获得了DcRB7基因上游约650 bp的片段. 将此片段与含有GUS报告基因表达载体进行重组构建后, 以农杆菌介导转化烟草获得相应的转基因植株. 在对转基因烟草的GUS表达特性进行了组织化学鉴定和荧光定量分析后发现, 该调控区段能指导GUS基因在烟草根中优势表达, 并表现出干旱诱导的特性.     

豌豆乙酰羟酸还原异构酶基因的cDNA克隆及其表达

用cDNA差示分析法从G2豌豆总RNA中筛选到一个GA3特异诱导表达的基因片段，用该片段作探针进一步筛选G2豌豆cDNA文库，得到一个全长2036bp的cDNA序列。经分析，该cDNA含有一个1746bp的可读框，编码的蛋白质含有581个氨基酸，理论分子量为64ku,cDNA及推导的氨基酸序列分别与不同来源的乙酰羟酸还原异构酶相应序列有较高的同源性。将该基因转入表达载体中并在大肠杆菌中表达，获得了具有显著酶活性的外源蛋白。     

通过cDNA阵列技术鉴定拟南芥生长素应答基因

生长系作为一种重要的植物激素具有广泛的生理作用，但其作用的分子机理还有待深入研究，为系统地鉴定生长素应答基因，采用cDNA阵列技术检测以拟芥悬浮细胞系经IAA处理前后基因表达的变化，从13824个cDNA中克隆中筛选到50个差异表达克隆，这些生长素应答基因分别与信号转导、逆境反应、衰老、光合作用、蛋白质合成与转运等功能相关，从分子生物学角度证明了生长素的广泛作用，为研究其作用机制提供了线索，另外，初步鉴定了一个受外源生长素抑制的叶绿体蛋白酶调节亚基ClpC基因的功能，证明该基因在衰老叶片中被诱导，是一个衰老相关基因。     

采用调控培养方法提高胡萝卜体细胞胚活力的研究

自从开创人工种子研制以来,就一直存在若干研究难题,如人工种皮材料的寻找与研制,种子播种时抗微生物的侵染以及人工种子的贮藏等,至今尚未得到满意的解决,就人工种子的植物体细胞胚而言,提高胚的活力是获得高质量的人工种子的基础,也是克服有关难题的重要条件。在体细胞胚培养的研究中,曾期望通过ABA及简单的干燥脱水处理,使胚达到静止状态,有的作者也试验过利用提高蔗糖、麦芽糖和铵离子浓度达到静止状态,但均未获得理想的效果。我们用调控培养方法获得了具高活力的静止状态的胡萝卜体细胞胚,这一结果在     

玉米Cat1基因顺式元件ABRE2结合蛋白ABP9的基因克隆及功能分析

构建了授粉后17d(17dpp)的玉米幼胚cDNA基因文库，用玉米Catl基因顺式元件ABRE2通过酵母单杂交的方法筛选文库，获得3个完全相同的阳性克隆，命名为ABP9，用5′RACE的方法得到了该基因的全长cDNA序列，研究结果表明，ABP9属于bZIP类转录因子，与玉米Catl基因顺式元件ABRE2具有结合特异性，且在酵母细胞中具有转录激活功能。     

碳代谢总体调控蛋白CRP对肺炎克氏杆菌nif 启动子的抑制作用

在肠道细菌中，碳代谢总体调控蛋白CRP（也称为cAMP受体蛋白）通过PTS系统介导葡萄糖效应，调控σ70依赖型碳源分解代谢操纵子的转录活性，当自生（联合）固氮的肺炎克氏杆菌（Klebsiella pneumoniae)以不同的碳水化合物作为惟一碳源生长时，其固氮活性明显不同，且这种不同碳源对固氮活性的影响发生在基因表达调控水平上，在近缘的大肠植杆菌遗传背景下的进一步研究表明，在cAMP存在时，CRP对肺炎克氏杆菌所有的σ54依赖型nif启动子（nifB,nifE,nifF,nifH,NifJ,nifLA,nifU)都有抑制作用，序列分析结果表明，CRP的抑制作用与其在这些启动子上游的DNA顺式作用元件无直接相关性，对肺炎克氏杆菌crp基因的分离，测序结果显示，其编码的CRP蛋白与已知的大肠杆菌CRP蛋白在序列与功能上高度保守，因此认为不同碳源代谢对固氮基因的调控作用可能是由CRP－cAMP复合体介导的，这一研究工作将碳代谢调控系统和固氮调控系统通过CRP－cAMP耦联在一起，具有重要的生理学意义。σ     

链霉菌lon基因的发现及初步研究

lon基因存在于很多微生物乃至高等动物中,是属于热休克基因(heat shock gene)的一个家族.它编码的产物为La蛋白,是一种具有ATP酶活性的ATP依赖性的丝氨酸蛋白酶.在体内作为抗逆蛋白,如热休克蛋白存在.有关lon基因的研究始于80年代初期,虽然至今只有近十年的历史,但其结构、功能和调控方面的研究都已取得很大进展.目前在大肠杆菌,芽孢杆菌,黄色粘球菌及解淀粉欧文氏菌等原核微生物中都已发现lon基因的存在一些研究表明,lon基因对于黄色粘球菌的营养生长是必须的,如该基因缺失或被破坏,该菌株将不能发育生长在研究链霉菌发育调控启动子p_(TH4)下游序列的结构中,首次发现了链霉菌中lon基因     

大豆GmLlsl基因的克隆及表达调控分析

玉米的叶片坏死斑点(lethal leaf-spot 1,Lls1)基因及其拟南芥中的同功能基因已证明编码叶绿素分解代谢中的关键酶脱镁叶绿酸氧化酶(pheide a oxygenase,PaO)．为了深入研究大豆叶片衰老过程中叶绿素分解代谢的调控机制,从大豆中克隆了玉米Lls1的同源基因,其cDNA全长1817bp,命名为GmLls1(GenBank登录号：DQ154009)．序列分析表明,该基因与拟南芥、玉米、豇豆和番茄等的Lls1及其同功能基因具有很高的同源性,其编码蛋白含有典型的Rieske[2Fe-2S]结构域、非亚铁血红素铁结合域和C-末端CXXC基序,这些都是PaO功能蛋白所具有的典型结构特征．RT-PCR结果显示,在大豆叶片自然衰老、人工黑暗诱导衰老和子叶衰老3个系统中,GmLls1基因都表现出明显的衰老上调趋势．进一步分析发现,在因敲减类受体蛋白激酶rlpk2基因而导致衰老延缓的大豆转基因叶片中,GmLls1的表达显著下降,而在因过表达rlpk2而导致加速衰老的转基因叶片中,GmLls1的转录本积累明显增加,暗示RLPK2介导的信号途径可能参与调控GmLls1在大豆叶片衰老过程中的表达,而rlpk2-RNAi转基因离体叶片光照下表现出lls1突变体典型的斑状失绿坏死表型则进一步支持了上述推论．     

胡萝卜根特异表达水通道蛋白基因DcRB7的分离

从胡萝卜胚cDNA文库中分离得到一条完整的cDNA片段, 序列分析表明属于水通道家族新成员, 并与烟草根特异性表达TobRB7基因高度同源, 因此命名为DcRB7. Northern杂交分析表明DcRB7在根中特异性表达. 利用反向PCR技术, 分离获得了DcRB7基因上游约650 bp的片段. 将此片段与含有GUS报告基因表达载体进行重组构建后, 以农杆菌介导转化烟草获得相应的转基因植株. 在对转基因烟草的GUS表达特性进行了组织化学鉴定和荧光定量分析后发现, 该调控区段能指导GUS基因在烟草根中优势表达, 并表现出干旱诱导的特性.     

经ibeB基因转染的鼠胚胎干细胞分化的研究

ibeB是一个致脑膜炎大肠杆菌K1株中参与大肠杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞的基因. 以ibeB基因转染鼠胚胎干细胞, 结果表明, 大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭蛋白IbeB不但具有“侵袭”功能, 而且可诱导真核细胞向神经样细胞分化, 经ibeB基因稳定转染的鼠胚胎干细胞能特异性表达神经前体细胞标志分子——nestin. GFP标记的活细胞观察显示外源性IbeB蛋白定位于细胞核. 上述结果提示ibeB基因可能在调控nestin表达过程中发挥功能, 这为研究nestin基因的表达调控提供了资料.     

拟南芥钙调素结合蛋白激酶的克隆和特性分析

通过筛选拟南芥cDNA文库结合RACE的方法，克隆了一个全长cDNA-AtCBK1.Northem杂交和mRNA原位分析表明该基因在生长旺盛的部位和维管组织中大量表达。利用昆虫细胞表达系统，表达并纯化了重组蛋白AtCBK1，钙调素结合实验和自磷酸化、底物磷酸化分析直接证明了其酶活性受钙/钙调素调控，毛细管电泳检测其自磷酸化氨基酸为苏氨酸。系统进行分析推测AtCBK1可能来源于一个古老的CRK，与动物的CaMK在进化上可能来自不同的祖先。结果充分说明AtCBK1编码一个拟南芥中全新类型的钙调素结合的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。     

13个水稻WRKY基因的克隆及其表达谱分析

转录调控因子WRKY蛋白拥有高度保守的氨基酸序列WRKYGQK和Cys₂His₂或Cys₂HisCys锌指型结构. 利用WRKY蛋白质的保守结构域, 搜索了整个水稻基因组编码WRKY蛋白质的基因, 鉴定了97个WRKY基因, 并从4℃胁迫的水稻植株cDNA文库中获得13个WRKY基因全长cDNA克隆. Northern blotting分析结果显示, 其中10个WRKY基因的表达受到NaCl, PEG, 低温(4℃)和高温(42℃)等4种非生物逆境因子胁迫的影响, 但其诱导表达模式不论在逆境因子种类还是在诱导时间上均存在着很大的差异, 这种基因诱导表达模式的差异可能体现于它们之间的生物学功能的差异.     

利用cDNA微阵列技术筛选和鉴定NYD-SP9基因

运用cDNA微阵列杂交技术从人睾丸cDNA文库中筛选出人蛋白激酶基因，命名为NYD－SP9，NYD－SP9在成人睾丸中表达水平比胚胎睾丸高10倍，Southern印迹杂交结果表明，这一基因高表达于睾丸，而低表达于卵巢，cDNA序列的蛋白质基序磷酸化位点分析也进一步提示，它有可能参与精子发生中的信号转导过程，由于这些磷酸化位点的位置彼此很接受，在这些位点之间可能存在相互作用以调控精子发生，该基因含有一个保守的穿膜功能结构域，提示经翻译后为一跨膜蛋白，以上实验结果表明，蛋白激酶基因NYD－SP9可能在男性生殖细胞分化过程中发挥一定作用。     

根特异性表达顺式激活序列在转基因烟草中的功能分析

高等植物基因在各组织中的特异性表达需通过组织特异性启动子的调控。根是植物体的重要器官，其特异性基因的表达和调控对研究植物的生长和发育具有重要意义。通过对烟草根特异性表达基因TobRB7启动子的分析，成功分离了包含顺式激活序列 的不同长度的片段RSF1和RSF2。将RSF1和RSF2以不同方向与含有GUS编码基因的表达型载体进行重组后，以农杆菌介导转化烟草获得相应 的转基因植株。在对转基因烟草的GUS表达特性进行组织化学鉴定和荧光定量分析后发现，TobRB7启动子具有双向启动子功能，并均表现出根组织特异性。结果表明，在－823至＋70bp区域存在正反不同方向的根组织特异性调控元件，该启动子片段在反向插入和较短区域内有较强的根组织特异性表达调控功能。