农杆菌介导高等植物基因转化的影响因素

简述了近年来农杆菌转化的基本原理和载体系统的进展，同时着重阐述了不同属性农杆菌，不同植物基因型和外植体，不同再生植株的细胞起源，不同培养方法，不同药物选择以及在叶绿体与细胞核中转化等因素影响农杆菌介导高等植物基因转化，以及这个研究课题的进展现状。     

植物基因工程中Ri质粒的研究和应用

近10年来,植物基因工程获得了很大的发展,其中以农杆菌为介导的转化植物的方法已成为一种有效的基因转导手段。目前,对根癌农杆菌Ti质粒的研究和应用已日趋成熟,那末有关发根农杆菌Ri质粒的结构、功能和它的应用情况又如何呢?     

农杆菌转化水稻系统的研究

自1988年以来,水稻基因转化技术已取得显著进展,建立了转化水稻原生质体(电击法和PEG法)和完整细胞(基因枪法)的有效方法,得到外源基因稳定整合的转化植株及后代,但双子叶植物中最普遍使用的农杆菌介导法,却不能很好地应用于水稻,虽有几篇报道,但未得到转化植株,也未有转化目的基因的报道.我们尝试用农杆菌介导,将人工合成的抗菌肽基因转化水稻不定芽,得到表达外源基因的工程植株,建立了一种转化水稻的有效方法.     

表达cryIA/gna双价抗虫基因烟草兼抗棉铃虫和蚜虫

利用人工合成的、密码子优化后的雪花莲凝集素（ＧＮＡ）基因,与人工合成的ＣＦＭ ｃｒｙＩＡ构建了双价抗虫基因植物高效表达载体。通过根癌农杆菌介导转化烟草,获得２８株卡那酶素抗性植株,经ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹检测,证实了双价抗虫基因在烟草基因组中的整合,转基因烟草杀棉铃虫试验表明,４０％转基因烟草植株对棉铃虫具有高抗性;Ｂｔ杀虫蛋白ＥＬＩＳＡ检测获得与虫试较一致结果,抗虫性较强株Ｋ１１号ＣｒｙＩ     

以改建的农杆菌Ti质粒转化外源基因于单子叶植物花叶芋的研究

当前,应用改建和“解除了武装”的根瘤农杆菌的Ti质粒作为植物基因工程载体的研究得到了迅速的发展,并已建成了若干套植物基因工程的实用载体系统,运用这些系统结合叶圆盘转化法(Leaf-disc transformation)已能将不少外源基因引入双子叶植物细胞并使被转化植物产生了新的性状。但由于根瘤农杆菌宿主范围的限制,使得应用这一载体系统的研究存在着很大的局限性。迄今为止,在单子叶植物中仅有石刁柏、水仙、吊兰、黄独四种植物能够     

生物工程在树木固氮方面又结出硕果

1991年5月份,法国第七巴黎大学的科学家们菲利莆(Phelep)等利用生物工程技术,由含有两种根状农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)品系A_4或2659的木麻黄科植物Allocasuarina verticiliata培养的上胚轴,子叶扣下胚轴诱导毛状根从而获得了具固氮能力的,可以在无激素培养基上生长的并发育出异常广阔的根系统的转基因植物。通过特异的章鱼碱的存在和Southern斑点印迹分析均肯定了上述的实验结果。由此,法国的科学家们在树木固氮的生物工程研究方面取得了突破性进展,为人类能够最终利用大气     

小鼠金属硫蛋白突变体 bb 基因在生菜中的表达及高锌生菜的培育

将人工合成的金属硫蛋白结构域突变体bb基因克隆到植物高效表达载体pGPTVd35S中, 用根瘤农杆菌介导的叶盘法转化生菜品种Salinas 88, 得到了抗除草剂的转化植株. PCR和Southern印迹分析表明, bb基因已经整合到生菜基因组中. Northern和Western印迹分析表明, bb基因可以在生菜中正常转录和表达, 并能通过有性繁殖传递给后代. 不同生长条件下的转基因生菜中锌的含量都明显高于对照植株.     

小鼠金属硫蛋白突变体

将人工合成的金属硫蛋白结构域突变体ββ基因克隆到植物高效表达载体pGPTVd35S中, 用根瘤农杆菌介导的叶盘法转化生菜品种Salinas 88, 得到了抗除草剂的转化植株. PCR和Southern印迹分析表明, ββ基因已经整合到生菜基因组中. Northern和Western印迹分析表明, ββ基因可以在生菜中正常转录和表达, 并能通过有性繁殖传递给后代. 不同生长条件下的转基因生菜中锌的含量都明显高于对照植株.     

根特异性表达顺式激活序列在转基因烟草中的功能分析

高等植物基因在各组织中的特异性表达需通过组织特异性启动子的调控。根是植物体的重要器官，其特异性基因的表达和调控对研究植物的生长和发育具有重要意义。通过对烟草根特异性表达基因TobRB7启动子的分析，成功分离了包含顺式激活序列 的不同长度的片段RSF1和RSF2。将RSF1和RSF2以不同方向与含有GUS编码基因的表达型载体进行重组后，以农杆菌介导转化烟草获得相应 的转基因植株。在对转基因烟草的GUS表达特性进行组织化学鉴定和荧光定量分析后发现，TobRB7启动子具有双向启动子功能，并均表现出根组织特异性。结果表明，在－823至＋70bp区域存在正反不同方向的根组织特异性调控元件，该启动子片段在反向插入和较短区域内有较强的根组织特异性表达调控功能。     

小鼠金属硫蛋白突变体ββ基因在生菜中的表达及高锌生菜的培育

将人工合成的金属硫蛋白结构域突变体ββ基因克隆到植物高效表达载体pGPTVd35S中，用根瘤农杆菌介导的叶盘法转化生菜品种Salinas88，得到了抗除草剂的转化植株，PCR和Southern印迹分析表明，ββ基因已经整合到生菜基因组中，Northern和Western印迹分析表明，ββ基因可以在生菜中正常转录和表达，并能通过有性繁殖传递给后代，不同生长条件下的转基因生菜中，锌的含量都明显高于对照植株。     

植物基因工程的新突破——植物RNA病毒作为基因工程载体系统的现状与展望

植物基因工程领域研究工作的快速发展,日益引起人们的关注。在将外源顺序导入植物寄主中去的植物基因工程的载体系统中,冠瘿瘤农杆菌的Ti质粒和植物花椰菜花叶病毒是两类研究得最多的载体系统。冠瘿瘤农杆菌以许     

根癌农杆菌介导的CryⅠA(b)基因在哈茨木霉菌中的转化

根癌农杆菌介导的遗传转化是植物基因工程中常规方法, 利用这一转化方法, 将CryⅠA(b)基因转入生防真菌哈茨木霉中, 转化率约为60～180个转化子/106个孢子. 通过对转化子的RT-PCR检测和Southern 杂交分析表明, CryⅠA(b)基因已整合进哈茨木霉菌基因组中, 而且在转录水平上得到表达. 转化子都能够稳定遗传. 对转化子抑菌活性和杀虫活性测定表明, 转化子不但保持了原菌株良好的抑菌活性, 而且表现出一定的杀虫效果. 兼有杀虫防病双重作用的基因工程哈茨木霉菌的构建显示了生物技术在生防真菌遗传改良中的应用潜力.     

存在水稻中新型农杆菌毒性区基因的信号分子

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒毒性区基因所编码的特殊的接合系统将介导T-DNA由农杆菌向高等植物的运动和转移.在双子叶植物中,该系统可通过二元调节系统被许多植物酚类激活.然而,对单子叶植物,尤其是禾本科作物而言,有关毒性区基因诱导因子的报道甚少.我们曾采用带有vir::lacZ融合基因的农杆菌系列菌株,研究了水稻不同组织、不同发育时期的渗出液及提取液对农杆菌毒性区基因的激活作用,发现只有在幼穗分化期至抽穗扬花期的叶片才能检测到较强的诱导活性.我们纯化了水稻中的毒性区诱导信号分子(RVS),其中一个为3,5-二羟-3’,4’-亚甲二氧基-5’-亚甲二氧基-5’-甲氧基-β-羰基二氢查耳酮(C_(17)H_(14)O_7).RVS的诱导方式与乙酰丁香酮(AS)相似,均随诱导物浓度和时间变化而变化.结果表明:在水稻中存在着毒性区基因诱导的信号分子,但只有在特定组织及特定发育时期才可被明显检测到.     

根癌农杆菌介导的Cry IA（b）基因在哈茨木霉菌中的转化

根癌农杆菌介导的遗传转化是植物基因工程中常规方法，利用这一转化方法，将Cry IA(b)基因转入生防真菌哈茨木霉中，转化率约为60～180个转化子／10^6个孢子．通过对转化子的RT-PCR检测和Southern杂交分析表明，Cry IA(b）基因已整合进哈茨木霉菌基因组中，而且在转录水平上得到表达．转化子都能够稳定遗传．对转化子抑菌活性和杀虫活性测定表明，转化子不但保持了原菌株良好的抑菌活性，而且表现出一定的杀虫效果．兼有杀虫防病双重作用的基因工程哈茨木霉菌的构建显示了生物技术在生防真菌遗传改良中的应用潜力．     

C3—C4中间型植物Flaveria anomala中甘氨酸脱羧酶P—蛋白亚基上游调控序列在转基因水稻中的表达

将C3-C4中间型植物Flaveria anomala中甘氨酸脱羧酶(GDC)P-蛋白亚基基因(gdcsP)的上游调控序列与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因编码区以及CaMV终止子融合,构建植物表达载体.采用农杆菌介导方法转化水稻,并在转基因水稻中分析了GUS的表达活性和特异性.结果表明,在水稻中gus嵌合基因特异地在木质部和韧皮部表达,在不同器官及组织中表达活性也有所差异,其中以根中最高,茎秆次之,叶再次,而在成熟胚乳中没有表达.在转基因水稻中,gdcsP启动子的表达也受水稻发育时期的调控,随植物组织成熟度的增加而降低.     

根癌农杆菌介导的Cry1A(b)基因在木霉菌中的转化

根癌农杆菌介导的遗传转化是植物基因工程中常规方法，利用这一转化方法，我们成功地将CryⅠA(b)基因转入生防真菌哈茨木霉中，转化率约为60~180个转化子/10⁶个孢子 。通过对转化子的RT-PCR检测和Southern 杂交分析表明，CryⅠA(b)基因已整合进哈茨木霉菌基因组中，而且在转录水平上得到表达。转化子都能够稳定遗传。对转化子抑菌活性和杀虫活性测定表明，转化子不但保持了原菌株良好的抑菌活性，而且表现出一定的杀虫效果。兼有杀虫防病双重作用的基因工程哈茨木霉菌的构建显示了生物技术在生防真菌遗传改良中的应用潜力。     

酚类化合物能促进致瘤农杆菌对单子叶植物鸭跖草的转化

致瘤农杆菌能够侵染受伤的植物细胞,并继而将其Ti质粒上的一段DNA(即T-DNA)转移至植物基因组,使植物产生冠瘿瘤。农杆菌的Ti质粒是目前可资利用的高等植物基因工程的最好载体。早期实验表明:除百合目和天南星目的部分单子叶植物外,农杆菌的宿     

胡萝卜根特异表达水通道蛋白基因DcRB7的分离及其启动子功能分析

从胡萝卜胚cDNA文库中分离得到一条完整的cDNA片段, 序列分析表明属于水通道家族新成员, 并与烟草根特异性表达TobRB7基因高度同源, 因此命名为DcRB7. Northern杂交分析表明DcRB7在根中特异性表达. 利用反向PCR技术, 分离获得了DcRB7基因上游约650 bp的片段. 将此片段与含有GUS报告基因表达载体进行重组构建后, 以农杆菌介导转化烟草获得相应的转基因植株. 在对转基因烟草的GUS表达特性进行了组织化学鉴定和荧光定量分析后发现, 该调控区段能指导GUS基因在烟草根中优势表达, 并表现出干旱诱导的特性.     

应用低能离子束介导法获得水稻转基因植株

水稻转基因的研究自1988年首次获得转基因植株以来,近几年又取得了很大进展,这一方面是由于水稻原生质体培养技术的不断改进和提高,使得以原生质体为受体系统的PEG和电激法介导的转基因研究更趋于成熟,尽管这一途径技术难度大并存在着基因型限制,但仍以其较好的可靠性而被认为是最富成效的方法;另一方面、新近发展起来的基因枪.激光微束、超声波等物理手段介导的植物转基因方法,都减去了原生质体培养的步骤,并在很大程     

兔防御素NP-1基因在转基因烟草中的表达及其对烟草青枯病的抗性研究

从兔子肝脏细胞中扩增到防御素NP_1成熟肽的编码序列 ,长约 2 0 0bp .将此片段插入到切除了GUS编码序列的pBI1 2 1质粒载体中 ,构建成植物表达载体 pBIC_35SNP1 .通过根癌农杆菌介导的叶盘法 ,将pBIC_35SNP1导入烟草细胞中 ,并获得了经Southern杂交证实的转基因植株 .进一步的Northern杂交证明防御素NP_1基因能够在转基因植株中正常转录 .抗菌实验表明转基因植株增强了对烟草青枯病的抗性并延缓了烟草青枯病的发病