家蚕细胞质多角体病毒的以双链RNA为模板的RNA复制酶的分离与重组

昆虫的细胞质多角体病毒是双链RNA病毒群中的成员之一。细胞质多角体病毒含有10双条链RNA基因和核酸复制酶。文献[2]已报道了核酸复制酶可以以基因一复制酶的形式分离出来。核酸复制酶含有三种蛋白亚基,表现了较高的RNA多聚酶和转甲基酶活力。     

杆状病毒运载的乙型肝炎病毒表面抗原基因(preS2-S)在家蚕体内的高效表达

利用核型多角体病毒中多角体蛋白基因的强启动基因建立的表达载体系统,被认为是极有潜力的新型表达载体系统。我们组建了插入乙型肝炎病毒表面抗原基因(HBV preS2-S)的重组家蚕核型多角体病毒BmNPVS后,用重组病毒感染家蚕做了进一步的研究。发现在重组病毒感染的5龄蚕的血淋巴中每毫升含HBsAg 7-10μg,每条蚕的蚕体组织中还含     

磷酸化修饰动态调控流感病毒复制

磷酸化是一种常见的蛋白质翻译后修饰形式,调控蛋白质的活性、稳定性、细胞内定位和蛋白质互作等功能.在真核细胞中,丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸是最常见的磷酸化位点.在流感病毒复制的生命周期中,病毒蛋白可被宿主激酶磷酸化修饰,并调节其核质穿梭、信号转导等功能,从而调控病毒的生长、复制和致病力.本文就近年来关于流感病毒内部核蛋白、基质蛋白1、非结构蛋白1的磷酸化修饰位点和其生物学功能进行综述,为深入了解流感病毒复制周期及抗病毒药物研发提供理论基础.     

海灰翅夜蛾核型多角体病毒P49蛋白的表达及其抑制细胞凋亡的机制

一个新克隆的海灰翅夜蛾核型多角体病毒（SINPV）的p49基因可抑制病毒感染引起的昆虫细胞Sf9的凋亡。用杆状病毒表达系统表达的P49蛋白的氨基酸序列与推导的氨基酸序列致，证明p49基因编码序列经克隆后能够正确表达。体内标记显示，p49基因在感染早期及晚期均可表达，以多角体基因启动子驱动p49基因的表达只是在晚期，但表达量明显高于wtSINPV合成的P49蛋白。研究结果证实，SINPV的p49基因像其他杆状病毒的凋亡抑制基因（p35)一样也是一个早期基因，但在晚期也可表达，与多角体基因启动子比较，p49基因的启动子是一个较弱的启动子。P49蛋白在体外可被人Caspase及家蚕Caspase所切割，切割后均产生约10和40ku的2个片段。P49蛋白又可明显抑制人Caspase-及家蚕Caspase对其特异底物的切割，证明P49的凋亡抑制与下游Caspase有关。     

作物抗旱生理性状遗传研究进展

用ＲＦＬＰ分子标记对作物抗旱性状的基因定位研究表明：小麦ＡＧＡ调节位点在５Ａ染色体长臂上,渗透调节由单隐性基因控制,位于７Ａ染色体的短臂上。水稻染色体３,７和８上有控制渗透调节基因位点,其中染色体８上的ＲＧ１位点最为重要。玉米染色体７上有控制气孔调节的重要位点,染色体３上有控制ＡＢＡ含量,叶片水势和叶片膨压以及根系拉力的位点变色本４和８上分别有控制胚根和须根数目的基因位点。番茄Ｂ,Ｆ和Ｑ３条染以体     

表达卫星RNA和外壳蛋白的高抗黄瓜花叶病毒的转基因烟草

研究证明病毒外壳蛋白基因在转基因植物中产生抗病毒侵染的早期抗病性,而卫星基因产生抗病毒复制的晚期抗性,但由于两种基因的各自的局限性,以其中的任一基因单独转化植物,都难以获得抗病效果良好的工程植物,本实验室利用植物基因工程方法构建了包含黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因和卫星基因的嵌合基因植物转化载体(pRCPI),     

烟草花叶病毒及番茄花叶病毒弱毒疫苗N14基因组重组体的构建与侵染性分析

用基因交换的方法将烟草花叶病毒普通株（中国分离物，ＴＭＶ－Ｃｖ和番茄花叶病毒弱毒疫苗Ｎ１４基因组的运动蛋白（ＭＰ）、外壳蛋白（ＣＰ）基因编码区和３＇非编码区嵌合于Ｎ１４和ＴＭＶ－ＣＶ ５＇非编码区和复制酶基因的下游，构建重组病毒克隆ｐＴＮ和ｐＮＴ，并进行体外转录和烟草侵染试验结果 ｐＴＮ和 ｐＮＴ体外转录物对烟草均具侵染性：前者感染枯斑三生烟（ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｂａｃｕｍ ｃｖ．Ｓａｍｓｕｎ ＮＮ），等量感染的枯斑形成数比 ＰＴＭＶ－Ｃｖ少；感染普通烟（ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｂａｃｕｍ ｃｖ． Ｈｕａｎｇｍ－ｉａｏｙｕ，黄苗榆品种），出现典型系统症状，但叶片畸形率较低．后者感染枯斑三生烟，等量感染的枯斑形成数比ｐＮ１４多；感染普通烟仍不出现系统症状．结果表明：重组病毒ＴＮ和ＮＴ仍能在试验用烟草中增殖，前者在普通烟上基本表现为ＴＭＶ－Ｃｖ的强病毒性状，后者在普通烟上表现为Ｎ１４的弱病毒性状； ＴＭＶ－ＣＶ和 Ｎ１４的复制酶与 ＭＰ， ＣＰ和 ３＇非编码区之间为非严紧型连接，两者在类似的各亚基因组之间可进行功能互补．初步推测，Ｎ１４复制酶编码基因的突变区对Ｎ１４的致弱起主要作用；其运动蛋白编码基因的突变区对被侵染烟草     

双拷贝v-cath基因的重组AcMNPV的构建与功能

利用AcMNPV穿梭载体Bac-to-Bac系统构建了分别由标状病毒极早期基因iel启动子和极晚期基因ph启动子控制的AcMNPV组织蛋白酶基因v-cath表达的两种双拷贝重组杆状病毒。用这两种重组病毒感染细胞主 幼虫，研究了不同时相v-cath基因的表达及细胞和幼虫死亡的机理。SDS－PAGE和Western blot分析结果表明：在感染Sf9细胞12h后（12hpi)，重组病毒dciAcMNPV的晚期基因v-cath在早期基因iel启动了驱动下得到表达。到48hpi，重组病毒dcdAcMNPV中v-cath基因在晚期和极晚期ph启动子驱动下高水平表达，阴性对照v-cath缺陷型病毒（ncAcMNPV)则没有V－CATH蛋白表达。毒力实验表明它们的杀虫活性大小依次为dcdAcMNPV＞dciAcMNPV＞野生型AcMNPV＞ncAcMNPV。根据双拷贝重组病毒的毒力和幼虫的死亡特性，AcMNPV的v-cath基因是一个毒力辅助因子和与虫体液化死亡有关的基因。所构建的重组病毒dcdAcMNPV由于是通过改变病毒自身基因的表达时相和拷贝数而提高了杀虫效率，因而不存在田间释放时的安全性隐患，有望成为一种新型的病毒杀虫剂。     

导致田间烟草曲叶病的又一病毒(非中国烟草曲叶病毒)

对病毒分离物ＤＮＡ序列分析的结构表明，除曾报道的中国烟草曲叶病毒，还存在另一种能引起我国广西地区烟草曲叶病的双生病毒。该病毒ＤＮＡ－Ａ由２７３４个核苷酸组成，与ＴｂＬＣＶ－ＣＨＩ的已知的部分序列不同。其大基因间隔区（ＬＩＲ）长２６９ｎｔ，病毒链有两个ＯＲＦ：ＡＶ１（１１５ａａ）和ＡＶ２（外壳蛋白基因，２５６ａａ）；病毒互补链有４个ＯＲＦ：ＡＣ１（复制酶基因，３６１ａａ）、ＡＣ２（反式激活蛋白，１３     

TNV-A~C亚基因组表达及基因编码产物对局部枯斑症状的影响

利用烟草坏死病毒A中国大豆分离物(Tobacco necrosis virus A Chinese isolate,TNV-AC)的全长侵染性cDNA克隆构建系列突变体进行体外转录.在枯斑寄主苋色藜(Chenopodium amaranticolor)上的侵染性检测结果表明,TNV-AC亚基因组RNA1的转录起始位点位于基因组RNA的G2184,亚基因组RNA2的转录起始位点位于基因组RNA的G2460.进一步分析表明,亚基因组RNA1中p8和p6基因的翻译灭活突变可导致病毒在苋色藜上的侵染症状消失,但不影响病毒在烟草原生质体中的复制,说明p8和p6基因产物可能影响病毒在细胞之间的移动,是病毒造成枯斑所必需的基因.通过原核表达产物分析,证明了亚基因组RNA2中外壳蛋白(coat protein,CP)基因的可读框起始于基因组RNA的2612~2614位AUG.CP可读框核苷酸替换或缺失突变分析表明,完整的CP蛋白虽不是病毒建立侵染所必需的,但其翻译起始密码子区域的核苷酸序列保守性及可读框核酸序列的完整性对病毒侵染苋色藜后产生枯斑的数量、显症时间和病毒RNA的积累量具有明显影响.综合以上结果,对TNV-AC的cp基因在侵染枯斑寄主苋色藜过程中的其他功能进行了讨论.     

一种新的中心体常驻蛋白的鉴定

利用膜特异结合抗体洗脱法，用一例自身免疫病人血清鉴定了一种新的中心体蛋白３１／２９抗原。免疫荧光结果显示这种抗原定位于中心体处，不依赖于细胞周期的变化，属于一种中心体常驻蛋白。为了研究细胞核周期与中心体复制之间的协调关系，利用此抗血清以及Ｃｅｎｔｒｉｎ和γ－微管蛋白（γ－ｔｕｂｕｌｉｎ）抗体研究了Ｖ７９－８细胞在人工诱导产生早熟染色体凝集（ＰＣＣ）现象时其中心体复制周期的变化。结果发现在羟基脲抑制     

人工改造的Cry1Ac和Cry1Ie基因在烟草中共表达对棉铃虫有更好的杀虫活性

利用叶盘转化法获得了携带Cry1Ac, Cry1Ie和同时携带这两个基因的3种类型转基因烟草. 利用ELISA法测定转基因烟草叶片中Bt蛋白含量, 在携带两种Bt基因的转基因烟草中, Cry1Ac和Cry1Ie蛋白分别占总蛋白的0.173%和0.131%. 在携带单个基因的烟草中, Cry1Ac和Cry1Ie蛋白的含量分别为0.182% 和0.124%. 分别用野生型棉铃虫(Helicoverpa armigera)和Cry1Ac抗性棉铃虫的初孵幼虫在这3种类型的转基因烟草叶片上进行虫试, 并以未转基因烟草为负对照. 实验结果表明, 携带Cry1Ie基因的转基因烟草对这两种棉铃虫都有杀虫活性, 而携带Cry1Ac基因的转基因烟草仅对野生型棉铃虫有抗性, 携带两种Bt基因的烟草比仅含其中一个基因的烟草对这两种棉铃虫均有更好的杀虫效果. 该结果表明, 这两种Bt基因在转基因烟草中能够协同作用, 提高了烟草对害虫的杀虫效果. 同时, 转入两个Bt杀虫基因有可能成为延缓农业害虫对转基因作物产生抗性的新途径.     

TNV-AC亚基因组表达及基因编码产物对局部枯斑症状的影响

利用烟草坏死病毒A中国大豆分离物(Tobacco necrosis virus A Chinese isolate, TNV-AC)的全长侵染性cDNA克隆构建系列突变体进行体外转录. 在枯斑寄主苋色藜(Chenopodium amaranticolor)上的侵染性检测结果表明, TNV-A^C亚基因组RNA1的转录起始位点位于基因组RNA的G²¹⁸⁴, 亚基因组RNA2的转录起始位点位于基因组RNA的G²⁴⁶⁰. 进一步分析表明, 亚基因组RNA1中p8和p6基因的翻译灭活突变可导致病毒在苋色藜上的侵染症状消失, 但不影响病毒在烟草原生质体中的复制, 说明p8和p6基因产物可能影响病毒在细胞之间的移动, 是病毒造成枯斑所必需的基因. 通过原核表达产物分析, 证明了亚基因组RNA2 中外壳蛋白(coat protein, CP)基因的可读框起始于基因组RNA的2612~2614位AUG. CP可读框核苷酸替换或缺失突变分析表明, 完整的CP蛋白虽不是病毒建立侵染所必需的, 但其翻译起始密码子区域的核苷酸序列保守性及可读框核酸序列的完整性对病毒侵染苋色藜后产生枯斑的数量、显症时间和病毒RNA的积累量具有明显影响. 综合以上结果, 对 TNV-A^C的cp基因在侵染枯斑寄主苋色藜过程中的其他功能进行了讨论.     

猪瘟病毒基因组非编码区的定性、定量与结构分析

猪瘟病毒是猪瘟的病原体，弄清其基因组的复制与表达是研究猪瘟致病机理、研制抗病毒药物的核心，基因组的非编码区（UTR）是复制和表达的主要调节区，为了确定复制与表达位点在非编码区的具体位置以及主要特征，对猪瘟病毒石门株以及其他毒株基因组的3′和5′非编码区进行了生物信息学的定性、定量与结构分析，分别得到17个毒株的3′UTR和56个毒株的5′UTR与调节复制、表达起始有关的位点以及共有的保守序列和结构成分，这些顺式调控元件可能是复制起始识别位点、宿主细胞转录因子的结合位点和核糖体起始蛋白质合成的作用位点，据此，对猪瘟病毒复制与表达的机理进行了探讨，为进一步实验提供了非常明确的方向，同时也为与猪瘟病毒同科的丙型肝炎病毒、其他瘟病毒以及其他正链RNA病毒基因组复制的研究奠定了基础。     

植物反转录转座子功能研究进展

反转录转座子(retrotransposon),是一类以RNA为中介,在反转录酶的参与下,进行自我复制并整合到基因组其他位点中的转座元件(transposableelements,TEs).反转录转座子是许多真核生物基因组的主要组成部分,在高等植物如玉米、小麦等作物中含量丰富.这些反转座子的功能及生物学意义一直以来都存在争议,但越来越多研究表明,它们对于邻近基因的表达调控以及整个生物体基因组的进化有着深远的影响.本文主要从反转座子与非编码RNA的联系及其转座过程所产生的基因结构变异、反转座基因等方面,概述了植物中反转座子功能的相关研究进展.     

多角体完整重组病毒的构建及苏芸金杆菌截短δ内毒素基因的表达

杆状病毒由于其特异的宿主专一性,对有益昆虫、人畜无害和具有持续性和流行性等优点而广泛用于生物防治.但其主要缺点是毒力不高,杀虫速度慢,限制了它的应用.曾有人分别克隆苏芸金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)全长δ内毒素cryIA(c),cryIA(b)基因到杆状病毒多角体蛋白基因ocu(occlusion)启动子下游构建重组病毒,但并没有提高杀虫速度.其原因可能是昆虫细胞内缺少碱性条件,不能降解全长毒素基因表达的原毒素有活性的毒性片段.在转基因植物中,3′半端截短的cryIA(b)基因的表达量比全长基因高10倍,并且只有截     

我国现有的3类转Bt基因抗虫棉品系棉铃虫抗性的遗传分析

我国主有要３类转Ｂｔ基因抗虫棉，都已培育出品种或杂交种并在生产上推广利用。遗传分析表明，山西９４－２４、中心９４和Ｒ１９３类转Ｂｔ基因抗虫棉亲本品系对棉铃虫的抗性各由－对显性主基因控制，它们的抗虫基因非等位。山西９４－２４与Ｒ１９的Ｂｔ基因可能整合在陆地棉品种的同一梁色体上，表现为连锁遗传，山西９４－２４、中心９４、Ｒ１９３个抗虫棉品系间互交杂种抗虫性与亲本类似，表明抗虫基因在杂合状态下无共抑制现     

鸡减蛋综合征病毒(EDSV)的基因组特点

在完成鸡减蛋综合征病毒中国株ＡＡ２全基因组核苷酸序列测定的基础上,对其基因组的结构特点进行了分析,结果表明：ＡＡ２株基因组具有腺病毒科成员的某些结构特点,尽管核苷酸及氨基酸序列的同源性较低但是位于Ｅ２区中编码与病毒繁殖和基因具有复制相关的一些酶类或调节蛋白,以及组装病毒颗粒所需的结构蛋白等与其他腺病毒相似。     

一种简单易行的重组方法——三引物PCR法

报道了一种不需要限制性内切酶和连接酶的重组DNA方法－三引物PCR法（TP－PCR），TP－PCR反应体系中有2种模板和3种引物，从而在同一个反应体系中产生一个重组DNA分子，这种方法的主要优点是快速，高效且不依赖连接片段的限制酶位点，用这种方法已成功构建了融合蛋白基因－sck基因。     

烟草花叶病毒及番茄花叶病毒弱毒疫苗N14基因组重组体的构建与侵染性分析

用基因交换的方法将烟草花叶病毒普通株（中国分离物，ＴＭＶ－Ｃｖ）和番茄花叶病毒弱毒疫苗Ｎ１４基因组的运动蛋白（ＭＰ）、外壳蛋白（ＣＰ）基因编码区和３’非编码区嵌合于Ｎ１４和ＴＭＶ－Ｃｖ５’非编码区和复制酶原下游，构建重组病毒克隆ＰＴＮＴ和ＰＮＴ，并进行体外转录和烟草染试验。结果ｐＴＮ和ｐＮＴ体外转录物对烟草均具侵染性：前者感染枯斑三生烟（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔｏｂａｃｕｍｃｖ．ＳａｍｓｕｎＮＮ），等