一株晚花和镉敏感拟南芥突变体的分离与鉴定

为了进一步挖掘拟南芥响应Cd胁迫的分子机制,从化学诱导型拟南芥突变体库(约6 000株系)中筛选获得Cd敏感突变体,通过测量经Cd处理后拟南芥植株的根长变化获得Cd响应突株系,然后单株收种并鉴定,最终获得一株对Cd胁迫敏感的突变体。Thermal asymmetric interlaced-PCR(TAIL-PCR)发现这株突变体T-DNA的插入定位于基因At1g35820和At1g35830之间。进一步分析表明这个突变体也是FLC(Flowering locus C)依赖的晚花突变体,将这株突变体命名为fcr(flowering and cadmium related gene)。FLC在拟南芥开花调控网络中起枢纽作用,并且是开花正调控基因Suppressor of overexpression of co 1 (SOCI)的抑制因子。在该突变体中FLC的表达明显高于野生型植株,而FLC下游基因SOCI的表达明显低于野生型植株,但FLC上游基因的表达变化不明显。进一步实验发现,突变体fcr中调节环境因素和春化作用的基因High expression of osmotically responsive gene 1(HOS1)表达量显著增加。通过以上结果我们推测,突变体fcr中的晚开花和Cd敏感表型可能是HOS1基因过量表达所致。     

大豆滞绿突变体的T-DNA插入位点分析

通过农杆菌介导的子叶节转化法获得的大豆T-DNA插入突变体ls-1是一个滞绿突变体,该突变体同时表现出花器官异常和种子败育的表型.通过染色体步移的方法分析发现T-DNA插到大豆基因组的7号染色体上,对测序获得的插入位点序列进行了PCR验证.进一步通过半定量RT-PCR和生物信息学分析,推测突变体表型的产生可能由于T-DNA插入编码S1型核酸内切酶的基因Glyma.07G191100和编码线粒体中交替型NAD(P)H脱氢酶的基因Glyma.07G191200之间,使二者表达受到影响造成的.该研究为后续的基因功能研究奠定了基础.     

拟南芥18srRNA参与隐花色素介导的信号传导途径的研究

通过筛选以拟南芥蓝光受体隐花色素双突变体cry1cry2为遗传背景的激活标签突变体库,得到一株SCC98-D株系,该突变体具有早开花,下胚轴变短,并具有花瓣数目增加等表型,彻底恢复了cry1cry2的晚开花和长下胚轴表型.通过Tail-PCR的方法克隆得到SCC98-D突变体中激活标签插入位点的侧翼序列,通过对该侧翼序列测序发现插入位点在18srRNA的1751bp处,运用RT-PCR方法分析插入位点周围基因的表达,发现只有18srRNA的表达被激活,由此证实了18srRNA参与隐花色素介导的信号传导途径.     

一株拟南芥镉敏感突变体的筛选及表型分析

利用不同浓度梯度的CdCl2对拟南芥Col-0生态型进行处理,确定了筛选镉敏感突变体的适合浓度为90μmol/L.以镉对幼苗根长生长抑制程度为指标,对拟南芥化学诱导激活标签(XVE)T-DNA插入突变体库种子进行筛选.首先在不含有雌激素的1/2MS培养基进行大规模筛选,挑选根长抑制明显的植株,单株收取种子.在T3代复筛过程中用含有浓度为90μmol/L CdCl2的1/2 MS固体培养基筛选到一株敏感突变体csr-2.并进行了雌二醇诱导过表达表型验证.运用TAIL-PCR技术确定该植株的T-DNA插入位点位于At2g36130,并对该基因的序列进行了初步的生物信息学分析.     

拟南芥角果角度相关基因SPA的分子鉴定与功能分析

利用T-DNA插入突变的方法从拟南芥中筛选得到1个角果果柄生长角度变小的突变体,克隆得到该突变基因为SPA基因,并利用PCR和RT-PCR方法验证了T-DNA的插入位点;将SPA基因转入spa突变体后,互补植株角果角度恢复到野生型水平．推测SPA基因可能在调控角果角度方面具有重要功能．关键词 拟南芥;角果角度;SPA基因;TAIL-PCR     

拟南芥活性氧响应基因GDI功能初步分析

从拟南芥(Arabidopsis thaliana)T-DNA插入突变体库中筛选分离到活性氧敏感突变体gdi并克隆出相应基因GDI,生物信息学分析发现该基因具有多个ABA及氧化胁迫相关顺式作用元件,定量PCR及GUS染色结果表明该基因主要在花器官中表达,激光共聚焦实验显示GDI蛋白在细胞质中广泛分布.     

一个新的拟南芥雄性不育突变体的鉴定

前期研究表明,高度不育的infer1含有arf8-1和fer1-1.利用TAIL-PCR,研究组已经证实fer1-1为一个T-DNA插在At4g33050基因(鳊码Fer1蛋白)的突变体.于是,研究组从ABRC(the Ambidopsis Biological Re-souce Center)购买了At4g33050的另一个T-DNA插入突变体fer1-2.在fer1-2与arf8-1的杂交后代F2中,得到了一个与infer1明显不同的部分雄性不育突变体,命名为infer2,该不育株的所有后代均为部分不育.表型鉴定表明infer2在花发育、花的形态结构、角果的形态结构、植株的营养生长和植株的育性等方面与infer1比较存在明显差异.分子标记分析表明infer2仅含有arf8-1的分子标记而不含有fer1-2的分子标记.因此,可以确定infer2是一个不同于infer1的新的拟南芥雄性不育突变体.infer1和infer2均可作为植物雄性不育分子机制研究的良好材料.     

拟南芥At5g66070基因在ABA处理下的初步研究

本研究以拟南芥为实验材料,探索基因At5g66070在植物激素ABA处理条件下的相关生理功能.结果表明,在10μMABA处理下,该基因的表达量明显升高,表明该基因受到ABA的诱导.亚细胞定位发现AT5G66070定位在细胞核.通过DNA及RNA水平筛选鉴定At5g66070基因T-DNA插入纯合突变体,然后经根瘤农杆菌介导法进行遗传转化,筛选获得过表达转基因株系.表型分析发现经ABA处理后,突变体相对于野生型而言根长较短,表明突变体对ABA更为敏感.气孔关闭实验发现10μM ABA能诱导突变体气孔关闭,而野生型和过表达无显著影响.以上结果表明At5g66070在拟南芥的ABA胁迫响应中起负调控作用.     

拟南芥中一个新的constans等位基因及特性

植物开花是由内外信号途径共同调控的,CONSTANS是长日照途径上控制开花的基因.在筛选拟南芥滞绿突变体的过程中筛选到一个晚花突变体,工作名称为fnc25.后来证实为一个新的constans突变体co-9.在长日照条件下该突变体植株高大,叶片呈深绿色,莲座叶数目增多,开花延迟,寿限显著延长;春化处理和外源施加赤霉素对其开花时间几乎没有响应,在短日照条件下开花时间几乎不变.测序发现co-9中CO基因编码区中有10个碱基的缺失导致了CO蛋白C末端92个氨基酸没有被合成,这其中包含一个CCT结构域.CO基因的功能缺失很可能是导致co-9晚花的原因.RT-PCR实验表明co-9中CO直接调控的基因FT的mRNA水平显著下调,而另一个调控的基因SOC1的mRNA水平和野生型相比没有改变.说明CO通过不同的结构域作用于下游目的基因,一个结构域的改变只影响下游一个目的基因的表达,导致co-9的晚花表型.     

缺失AtArm基因导致拟南芥耐热性下降

生物信息学数据表明,At3g09350基因编码一种受高温诱导的armadillo,beta-catenin repeat蛋白,但其生物学功能迄今不详,我们利用基因组DNA PCR、RT-PCR和Western-blotting方法,对该T-DNA插入拟南芥突变体进行了筛选,获得At3g09350基因被敲除的T2代纯合突变体,通过表型分析,我们发现,该突变体的获得耐热性明显下降,呈现热敏感表型.分子进化分析结果表明,该基因为微牛物和动物Hsp70s的核苷酸交换因子的同源物,它的缺失可能导致Hsp70s分子伴侣活性下降,进而导致拟南芥耐热性下降.     

拟南芥突变体lac8-2和lac8-3的鉴定

本课题组已通过基因工程方法证实,拟南芥At5g01040的编码蛋白Lac8具有漆酶活性.本研究通过PCR扩增技术,成功筛选出Lac8基因的T-DNA插入突变体lac8-2和lac8-3的纯合子.RT-PCR分析表明,突变体中没有Lac8基因的表达.因此,lac8-2和lac8-3均可作为Lac8基因的功能缺失突变体,这为进一步研究Lac8基因在拟南芥生长发育中的功能奠定了材料基础.     

珙桐AP2/ERF家族相关基因的克隆及功能鉴定

为探究AP2/ERF类转录因子在珙桐开花调控及花器官发育中的作用,本研究通过从实验室珙桐不同发育时期苞片和叶片的转录组数据中筛选出调控珙桐苞片发育相关AP2/ERF家族基因DiAP2-1、DiDREB-1和DiRAV-1,经过生物信息学分析、基因克隆及功能鉴定初步研究了目的基因在珙桐苞片发育过程中的调控机制.亚细胞定位实验显示DiAP2-1主要定位于细胞质,DiDREB-1和DiRAV-1主要定位于细胞核.对目的基因在珙桐中的表达模式分析发现DiAP2-1和DiRAV-1在苞片发育过程中表达量逐渐降低,DiDREB-1只在苞片第三时期高表达,推测DiDREB-1、DiRAV-1属于A类基因,DiAP2-1属于B类基因.表型实验显示DiDREB-1和DiRAV-1转基因拟南芥株系较野生型表现为明显的早花,DiAP2-1同源基因对应的拟南芥突变体与同一时期野生型拟南芥对比表现为花瓣减少且萼片大,角果呈短粗状且败育.对关键开花调控基因表达模式分析发现DiDREB-1和DiRAV-1异源表达后使其他促花因子表达量上调进而使拟南芥花期提前.以上结果表明,AP2/ERF类转录因子DiAP2-1、D...     

基于荧光标记双向筛选的拟南芥CRISPR基因编辑突变体库构建

突变体库是研究基因功能的重要工具。拟南芥种质资源库(ABRC)储藏了几乎涵盖所有基因的突变体材料,其中T-DNA插入突变体占绝大多数。然而,当在T-DNA插入突变体中进行遗传转化或与其他转基因报告系统进行杂交时容易引起转基因沉默,阻碍了相关研究的开展,甚至产生错误结论。甲基磺酸乙酯(Ethyl Methane Sulfonate, EMS)诱变和快中子诱变技术可获得非转基因突变体,但这两种方法均为随机诱变技术,需要通过基因定位来确认突变位点,无法实现基因靶向敲除。CRISPR/Cas9可以对目的基因进行靶向编辑,获得不携带转基因的突变体。拟南芥中尚无利用CRISPR/Cas9进行高通量突变体库构建的报道。本研究共设计900条sgRNAs靶向300个RNA通路相关基因,通过合成sgRNA混池文库、引入DsRed2荧光筛选标记、将DNA条形码和二代测序技术相结合,实现了对转基因阳性苗的高通量鉴定和分型,并对T2代具有发育缺陷的无荧光植株进行负向筛选,成功鉴定到了不含转基因的smd3-b和rlua4突变体。     

玉米大斑病菌StNPS6基因缺失突变体的转录组与蛋白质组差异表达分析

用T-DNA插入法构建一个玉米大斑病菌突变体库, 并筛选到一株致病力明显下降的突变体. 该突变体T DNA插入位点为非核糖体肽合成酶基因6（StNPS6基因）的上游启动子区. 先敲除StNPS6基因, 再对StNPS6基因敲除突变体和野生型进行转录组差异表达分析及蛋白质组差异表达分析. 结果表明: 在1 767个差异表达基因中的上调表达基因903个, 下调表达基因864个; 在突变体中鉴定30个差异表达蛋白质中的上调表达蛋白质8个, 下调表达蛋白质22个.     

拟南芥抗盐突变体的筛选

盐胁迫是影响植物生长发育的非生物胁迫因素之一,目前发现的盐胁迫信号途径的基因还非常有限.发掘新的耐盐相关基因对于了解植物的盐胁迫响应机制和改善作物的耐盐性具有非常重要的意义.从EMS突变体库中筛选突变体是一种经典的正向遗传学方法,有可能筛选到从T-DNA插入突变体库中无法发现的新基因.本实验用160mmol/L NaCl作为盐胁迫的筛选条件,以在含盐平板上长出绿色子叶作为筛选指标筛选抗盐(Salt Resistant,ST)的EMS突变体,初步筛选到了140株ST突变体,其中84株收到了种子,第二代进行抗盐表型确定后,得到了15株表型稳定的ST突变体,均表现出明显的抗盐表型,并对其中的一些突变体做了初步的表型及基因定位分析.     

拟南芥中一个参与盐胁迫应答基因的T-DNA插入纯合突变体的鉴定及表型分析

本研究以拟南芥为试验材料,探索基因at5g66070在受到非生物胁迫的表达情况,并研究其抗逆特性.结果表明,在NaCl处理下,该基因的表达量明显升高,表明该基因受到盐的诱导.通过PCR和RT-PCR在DNA和RNA水平上筛选鉴定at5g66070基因T-DNA插入纯合突变体.分析了野生型拟南芥与突变体在不同浓度NaCl处理下,其萌发率,根长以及苗期的生长差异.结果发现,相对于野生型来说,突变体对盐更敏感.具体来说,在含有150mMNaCl的MS培养基中,突变体的萌发率比野生型要低,根长比野生型要短,同时突变体幼苗更容易出现枯萎,萎黄症状.     

拟南芥网格蛋白重链突变体的遗传分析

利用PCR方法分离筛选了拟南芥网格蛋白重链T-DNA插入突变体chc1和chc2,并观察了CHC功能缺失后对植株发育的影响.结果表明：拟南芥网格蛋白重链CHC1或CHC2功能缺失引起部分植株发育异常,表现出生长素相关的发育表型,如幼苗子叶出现棒状、喇叭状和扇形等各种异常表型;通过人工杂交未能获得chc1chc2纯合双突变体,表明CHC1和CHC2功能同时缺失可能引起花粉致死或胚胎致死.这些遗传分析结果表明CHC在植物发育过程中具有重要的生物学功能.     

SPL转录因子调控植物花发育及其分子机制研究进展

SPL(squamosa promoter-binding protein-like)转录因子是植物所特有的一类基因家族,广泛存在于绿色植物中,在植物生长发育中具有重要作用。花发育是植物生殖发育中最为重要的一个过程,涉及不同发育方式的转变,即开花决定、花的发端和花器官发生与发育。简要综述了SPL基因的结构与功能并着重阐述了SPL基因在植物花发育过程中的分子机制及生物学功能。最后总结出: SPL转录因子可直接或间接通过参与光周期途径,赤霉素途径及年龄途径来调控植物的开花时间; SPL基因可通过直接激活下游花分生组织特异基因,如LEAFY(LFY),从而调控植物的成花转变; SPL基因可通过与下游花器官特征基因相互作用来调控花器官及其育性的发育,如调控花序、花柄的长度与外形及花器官的大小; SPL基因可调控植物大小孢子发生及雌雄配子体发育。据拟南芥的相关研究结果,初步构绘出拟南芥开花调控中的分子机制。     

拟南芥AtHHR2基因的功能初步研究

为了研究拟南芥Highly Homologous RING domain 2基因(At5g43200)在盐胁迫逆境的功能,通过DNA及RNA水平鉴定了该基因的T-DNA插入突变体athhr2,并通过根瘤农杆菌介导法进行遗传转化,筛选获得了athhr2/ATHHR2互补转基因株系.对突变体、互补转基因株系及野生型进行盐胁迫处理,对其萌发率、脯氨酸及叶绿素水平进行检测,发现盐处理后缺失突变体的萌发率降低,脯氨酸和叶绿素含量低于野生型,互补株系的萌发率、脯氨酸和叶绿素含量均高于野生型.以上结果证明AtHHR2基因在拟南芥的盐胁迫响应中起正调控作用.