一株拟南芥晚花突变体的分子分析

植物的开花时间直接控制植物营养生长期和生育期的长短,在相当程度上决定着繁育的成功与否,也与植物的产量和质量性状密切相关.拟南芥花期改变突变体是植物开花调控机制研究重要的植物材料.研究利用前期研究中获得的一株稳定遗传的、晚花表型的T-DNA插入拟南芥突变体pex2为材料,对其进行开花相关表型分析、T-DNA插入位点鉴定及插入位点基因转录分析等研究,结果表明:pex2突变体中存在单一的T-DNA插入,该插入位点位于PEX2基因下游约1 800 bp处,且该位点的插入引起了PEX2全长转录产物的缺失.该研究为进一步探索pex2突变体晚花机制及拟南芥PEX2基因与晚花表型之间的相关性研究,提供了研究材料.     

拟南芥雄性不育突变体opw(only pollen wall)候选突变基因的克隆

在T-DNA插入突变体Salk_059463株系的群体中,筛选到两株雄性不育突变体,对TDNA序列上的一对引物进行PCR鉴定,结果表明:其基因组中没有T-DNA插入.遗传分析表明这两株雄性不育突变体由同一单个隐性基因控制,引起不育的主要原因是从花药发育的第8期开始,小孢子细胞质内容物逐渐减少直至消失,到花药发育的第12期,药室内的小孢子只剩下一个花粉壁空壳,故该突变体命名为opw(only pollen wall).利用图位克隆的方法对OPW基因进行了定位,结果表明OPW基因位于第二条染色体上分子标记T28M21和T3G21之间的12 kb区间内,该区间内一共有21个基因注释.通过克隆区间内的基因并测序发现opw-1突变体基因组中At2g40140基因编码序列的外显子在第289和第290个碱基之间插入了一个A碱基,而opw-2突变体基因组中At2g40140基因编码序列的外显子在第412和第413个碱基之间插入了一个T碱基,造成的编码序列移码使第424至第426碱基成为终止密码子,故At2g40140是编码OPW的候选基因.     

棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体功能基因及生物学性状分析

【目的】分析棉花黄萎病致病菌相关基因的功能揭示其中致病机制。【方法】通过ATMT法构建了大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)650个T-DNA插入突变体。利用hiTAIL-PCR技术获得17株T-DNA插入体侧翼基因序列,通过blast比对分析表明,其中16个基因序列编码酶或蛋白。【结果】突变体的生物学性状与野生型菌株Vd991相比,出现黄色菌丝型2株,中间菌丝型6株;部分突变体在生长速率(7株)、产孢量(14株)和粗毒素产量(4株)上都发生了具有统计学意义的变化(p0.05);致病力测定表明,9株突变体的致病力较野生型有所降低,在p0.05水平具有统计学意义。【结论】该研究为大丽轮枝菌致病基因的筛选和鉴定提供了理论基础。     

利用转录组测序分析大豆矮小突变体中差异表达基因

植株高度是影响农作物产量的重要性状,本实验以大豆矮小突变体为研究材料,发现GA3处理可以部分恢复其矮化表型。为了探究其至矮的分子机制,运用RNA-Seq技术测序分析了野生型和突变体的转录组差异,结果表明有多个与植物激素相关的基因差异表达,其中Glyma19g01590与植物激素GA调节有关,生物信息学分析表明差异表达基因Glyma19g01590的开放阅读框有594 bp,推测编码198个氨基酸,该蛋白具有GASA(Gibberellic Acid-Stimulated in Arabidopsis)保守区域,GASA保守区域与GA调节有关。半定量RT-PCR实验表明Glyma19g01590在突变体中的表达水平明显高于野生型,qRT-PCR实验表明Glyma19g01590在突变体的表达量大约是是野生型的24倍。根据以上结果推测Glyma19g01590基因是导致大豆矮小表型的因素之一。     

缺失AtArm基因导致拟南芥耐热性下降

生物信息学数据表明,At3g09350基因编码一种受高温诱导的armadillo,beta-catenin repeat蛋白,但其生物学功能迄今不详,我们利用基因组DNA PCR、RT-PCR和Western-blotting方法,对该T-DNA插入拟南芥突变体进行了筛选,获得At3g09350基因被敲除的T2代纯合突变体,通过表型分析,我们发现,该突变体的获得耐热性明显下降,呈现热敏感表型.分子进化分析结果表明,该基因为微牛物和动物Hsp70s的核苷酸交换因子的同源物,它的缺失可能导致Hsp70s分子伴侣活性下降,进而导致拟南芥耐热性下降.     

棉花黄萎病菌 T-DNA 插入突变体功能基因及生物学性状分析

【目的】分析棉花黄萎病致病菌相关基因的功能揭示其中致病机制。【方法】通过 ATMT 法构建了大丽轮枝菌(Verticillium dahliae ) 650 个 T-DNA 插入突变体。利用 hiTAIL-PCR 技术获得 17 株 T-DNA 插入体侧翼基因序列,通过blast 比对分析表明,其中 16 个基因序列编码酶或蛋白。【结果】突变体的生物学性状与野生型菌株 Vd991 相比,出现黄色菌丝型 2 株,中间菌丝型 6 株;部分突变体在生长速率( 7 株)、产孢量( 14 株)和粗毒素产量( 4 株)上都发生了具有统计学意义的变化(p <0.05 );致病力测定表明, 9 株突变体的致病力较野生型有所降低,在 p <0.05 水平具有统计学意义。
     

拟南芥突变体lac8-2和lac8-3的鉴定

本课题组已通过基因工程方法证实,拟南芥At5g01040的编码蛋白Lac8具有漆酶活性.本研究通过PCR扩增技术,成功筛选出Lac8基因的T-DNA插入突变体lac8-2和lac8-3的纯合子.RT-PCR分析表明,突变体中没有Lac8基因的表达.因此,lac8-2和lac8-3均可作为Lac8基因的功能缺失突变体,这为进一步研究Lac8基因在拟南芥生长发育中的功能奠定了材料基础.     

利用TAIL-PCR方法克隆拟南芥干旱主效基因NCED3

利用远红外成像技术筛选得到一株T-DNA插入的干旱敏感突变体,并成功利用TAII,PCR技术克隆到该突变基因为NCED3,该基因编码植物体内ABA合成的关键限速酶,突变体在干旱胁迫下不能合成ABA而表现出不耐干旱的特性.最后通过PCR及RT PCR方法验证了TAIL-PCR结果的的靠性.     

拟南芥At5g66070基因在ABA处理下的初步研究

本研究以拟南芥为实验材料,探索基因At5g66070在植物激素ABA处理条件下的相关生理功能.结果表明,在10μMABA处理下,该基因的表达量明显升高,表明该基因受到ABA的诱导.亚细胞定位发现AT5G66070定位在细胞核.通过DNA及RNA水平筛选鉴定At5g66070基因T-DNA插入纯合突变体,然后经根瘤农杆菌介导法进行遗传转化,筛选获得过表达转基因株系.表型分析发现经ABA处理后,突变体相对于野生型而言根长较短,表明突变体对ABA更为敏感.气孔关闭实验发现10μM ABA能诱导突变体气孔关闭,而野生型和过表达无显著影响.以上结果表明At5g66070在拟南芥的ABA胁迫响应中起负调控作用.     

拟南芥角果角度相关基因SPA的分子鉴定与功能分析

利用T-DNA插入突变的方法从拟南芥中筛选得到1个角果果柄生长角度变小的突变体,克隆得到该突变基因为SPA基因,并利用PCR和RT-PCR方法验证了T-DNA的插入位点;将SPA基因转入spa突变体后,互补植株角果角度恢复到野生型水平．推测SPA基因可能在调控角果角度方面具有重要功能．关键词 拟南芥;角果角度;SPA基因;TAIL-PCR     

一株拟南芥镉敏感突变体的筛选及表型分析

利用不同浓度梯度的CdCl2对拟南芥Col-0生态型进行处理,确定了筛选镉敏感突变体的适合浓度为90μmol/L.以镉对幼苗根长生长抑制程度为指标,对拟南芥化学诱导激活标签(XVE)T-DNA插入突变体库种子进行筛选.首先在不含有雌激素的1/2MS培养基进行大规模筛选,挑选根长抑制明显的植株,单株收取种子.在T3代复筛过程中用含有浓度为90μmol/L CdCl2的1/2 MS固体培养基筛选到一株敏感突变体csr-2.并进行了雌二醇诱导过表达表型验证.运用TAIL-PCR技术确定该植株的T-DNA插入位点位于At2g36130,并对该基因的序列进行了初步的生物信息学分析.     

基于荧光标记双向筛选的拟南芥CRISPR基因编辑突变体库构建

突变体库是研究基因功能的重要工具。拟南芥种质资源库(ABRC)储藏了几乎涵盖所有基因的突变体材料,其中T-DNA插入突变体占绝大多数。然而,当在T-DNA插入突变体中进行遗传转化或与其他转基因报告系统进行杂交时容易引起转基因沉默,阻碍了相关研究的开展,甚至产生错误结论。甲基磺酸乙酯(Ethyl Methane Sulfonate, EMS)诱变和快中子诱变技术可获得非转基因突变体,但这两种方法均为随机诱变技术,需要通过基因定位来确认突变位点,无法实现基因靶向敲除。CRISPR/Cas9可以对目的基因进行靶向编辑,获得不携带转基因的突变体。拟南芥中尚无利用CRISPR/Cas9进行高通量突变体库构建的报道。本研究共设计900条sgRNAs靶向300个RNA通路相关基因,通过合成sgRNA混池文库、引入DsRed2荧光筛选标记、将DNA条形码和二代测序技术相结合,实现了对转基因阳性苗的高通量鉴定和分型,并对T2代具有发育缺陷的无荧光植株进行负向筛选,成功鉴定到了不含转基因的smd3-b和rlua4突变体。     

拟南芥中一个参与盐胁迫应答基因的T-DNA插入纯合突变体的鉴定及表型分析

本研究以拟南芥为试验材料,探索基因at5g66070在受到非生物胁迫的表达情况,并研究其抗逆特性.结果表明,在NaCl处理下,该基因的表达量明显升高,表明该基因受到盐的诱导.通过PCR和RT-PCR在DNA和RNA水平上筛选鉴定at5g66070基因T-DNA插入纯合突变体.分析了野生型拟南芥与突变体在不同浓度NaCl处理下,其萌发率,根长以及苗期的生长差异.结果发现,相对于野生型来说,突变体对盐更敏感.具体来说,在含有150mMNaCl的MS培养基中,突变体的萌发率比野生型要低,根长比野生型要短,同时突变体幼苗更容易出现枯萎,萎黄症状.     

玉米大斑病菌StNPS6基因缺失突变体的转录组与蛋白质组差异表达分析

用T-DNA插入法构建一个玉米大斑病菌突变体库, 并筛选到一株致病力明显下降的突变体. 该突变体T DNA插入位点为非核糖体肽合成酶基因6（StNPS6基因）的上游启动子区. 先敲除StNPS6基因, 再对StNPS6基因敲除突变体和野生型进行转录组差异表达分析及蛋白质组差异表达分析. 结果表明: 在1 767个差异表达基因中的上调表达基因903个, 下调表达基因864个; 在突变体中鉴定30个差异表达蛋白质中的上调表达蛋白质8个, 下调表达蛋白质22个.     

拟南芥AtHHR2基因的功能初步研究

为了研究拟南芥Highly Homologous RING domain 2基因(At5g43200)在盐胁迫逆境的功能,通过DNA及RNA水平鉴定了该基因的T-DNA插入突变体athhr2,并通过根瘤农杆菌介导法进行遗传转化,筛选获得了athhr2/ATHHR2互补转基因株系.对突变体、互补转基因株系及野生型进行盐胁迫处理,对其萌发率、脯氨酸及叶绿素水平进行检测,发现盐处理后缺失突变体的萌发率降低,脯氨酸和叶绿素含量低于野生型,互补株系的萌发率、脯氨酸和叶绿素含量均高于野生型.以上结果证明AtHHR2基因在拟南芥的盐胁迫响应中起正调控作用.     

拟南芥活性氧响应基因GDI功能初步分析

从拟南芥(Arabidopsis thaliana)T-DNA插入突变体库中筛选分离到活性氧敏感突变体gdi并克隆出相应基因GDI,生物信息学分析发现该基因具有多个ABA及氧化胁迫相关顺式作用元件,定量PCR及GUS染色结果表明该基因主要在花器官中表达,激光共聚焦实验显示GDI蛋白在细胞质中广泛分布.     

水稻OsDTH13基因编辑突变体的创制与分析

为了揭示水稻的PEBP基因家族成员OsDTH13的功能,以粳稻品种中花11为实验材料,利用CRISPR/Cas9技术创建了该家族成员OsDTH13的基因编辑突变体,对获得的编辑突变体进行测序分析确定其编辑类型.选择目的基因编码区的2个靶点,将其构建到基因编辑表达盒中获得了重组载体,并将重组载体导入农杆菌中,通过农杆菌介导的遗传转化法获得13株T_0代转基因阳性植株.经过测序鉴定,发现5株在靶点位置发生了编辑,其中2株为单碱基插入,3株为小片段的缺失.通过自交获得了T_1代纯合突变体植株.对获得的纯合突变体进行验证,发现其可以稳定遗传到下一代,这表明CRISPR/Cas9重组载体成功地对OsDTH13进行了编辑.     

拟南芥atfes1a突变体种子的热敏感性分析

根据基因芯片数据等生物信息学资料,我们锁定一些未知的且被高温诱导的基因,并获得了一个推测编码蛋白含armadillo/beta-catenin repeat(简称ARM)结构域的突变体salk-021784,该突变体缺失AtFes1A基因,该基因编码一种受高温诱导的ARM 蛋白.利用抗体检测了在拟南芥种子发育过程中AtFes1A的热诱导表达特征, 通过表型分析发现,热处理后的突变体种子萌发率明显低于热处理后的野生型,表明AtFes1A蛋白与拟南芥耐热有关.     

一株晚花和镉敏感拟南芥突变体的分离与鉴定

为了进一步挖掘拟南芥响应Cd胁迫的分子机制,从化学诱导型拟南芥突变体库(约6 000株系)中筛选获得Cd敏感突变体,通过测量经Cd处理后拟南芥植株的根长变化获得Cd响应突株系,然后单株收种并鉴定,最终获得一株对Cd胁迫敏感的突变体。Thermal asymmetric interlaced-PCR(TAIL-PCR)发现这株突变体T-DNA的插入定位于基因At1g35820和At1g35830之间。进一步分析表明这个突变体也是FLC(Flowering locus C)依赖的晚花突变体,将这株突变体命名为fcr(flowering and cadmium related gene)。FLC在拟南芥开花调控网络中起枢纽作用,并且是开花正调控基因Suppressor of overexpression of co 1 (SOCI)的抑制因子。在该突变体中FLC的表达明显高于野生型植株,而FLC下游基因SOCI的表达明显低于野生型植株,但FLC上游基因的表达变化不明显。进一步实验发现,突变体fcr中调节环境因素和春化作用的基因High expression of osmotically responsive gene 1(HOS1)表达量显著增加。通过以上结果我们推测,突变体fcr中的晚开花和Cd敏感表型可能是HOS1基因过量表达所致。