microRNA对植物生长发育和病毒侵染的调控

microRNA (miRNA)是一类在真核生物中广泛存在的大小约22 nt的非编码小分子单链RNA, 它可以通过对靶标RNA的剪切或抑制靶标RNA的翻译调控靶标基因的表达. miRNA不仅参与了植物器官的形态建成, 还参与调控植物的信号转导系统等与生长发育相关的基因表达调控过程. 与植物抗病毒RNA沉默途径一样, miRNA途径也受到病毒沉默抑制子的干扰. 本文简述了miRNA介导的RNA调控途径和siRNA介导的RNA沉默路径的异同, 并对近几年miRNA在植物生长发育调控以及与病毒相互作用的研究进展进行了综述, 以求进一步理解真核生物基因表达调控的多层次性及复杂性.     

肿瘤基因治疗新策略—RNA干扰

RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA介导的基因沉默现象. 目前介导RNAi的方法很多, 包括采用非病毒性和病毒性载体介导. 最近研究发现, 以病毒为载体介导RNAi具有显著的优越性. 病毒载体通过表达70 bp左右的发夹结构RNA (shRNA), 在Dicer酶的催化作用下, 切割成21 bp左右的双链小分子干扰RNA (siRNA), 从而有效沉默靶向基因. 运用RNAi技术可设计一系列有效的抗癌策略, 如沉默癌基因、促进调亡、调控细胞周期、抗血管生成以及提高传统化疗、放疗的疗效等. 这一技术开辟了肿瘤基因治疗的新途径. 本文就RNAi技术在肿瘤基因治疗中的应用与研究作一评述.     

甜菜坏死黄脉病毒RNA5对病毒致病性的影响

利用甜菜坏死黄脉病毒(Beet necrotic yellow vein virus, BNYVV) RNA5全长侵染性cDNA克隆体外转录获得的RNA5体外转录物, 与只含有RNA1, 2以及RNA1, 2和3的两个BNYVV突变株BNYVV-Hu0和BNYVV-Hu3的RNAs分别混合, 并接种于寄主植物番杏(Tetragonia expansa)和甜菜(Beta vulgaris L). 结果表明, RNA5是BNYVV中除RNA3以外的另一个病毒致病性相关分子, 它的存在能够提高病毒的侵染效率和在寄主体内的积累水平, 并与RNA3协同作用, 导致病毒侵染后的症状表现加重.     

TNV-A~C亚基因组表达及基因编码产物对局部枯斑症状的影响

利用烟草坏死病毒A中国大豆分离物(Tobacco necrosis virus A Chinese isolate,TNV-AC)的全长侵染性cDNA克隆构建系列突变体进行体外转录.在枯斑寄主苋色藜(Chenopodium amaranticolor)上的侵染性检测结果表明,TNV-AC亚基因组RNA1的转录起始位点位于基因组RNA的G2184,亚基因组RNA2的转录起始位点位于基因组RNA的G2460.进一步分析表明,亚基因组RNA1中p8和p6基因的翻译灭活突变可导致病毒在苋色藜上的侵染症状消失,但不影响病毒在烟草原生质体中的复制,说明p8和p6基因产物可能影响病毒在细胞之间的移动,是病毒造成枯斑所必需的基因.通过原核表达产物分析,证明了亚基因组RNA2中外壳蛋白(coat protein,CP)基因的可读框起始于基因组RNA的2612~2614位AUG.CP可读框核苷酸替换或缺失突变分析表明,完整的CP蛋白虽不是病毒建立侵染所必需的,但其翻译起始密码子区域的核苷酸序列保守性及可读框核酸序列的完整性对病毒侵染苋色藜后产生枯斑的数量、显症时间和病毒RNA的积累量具有明显影响.综合以上结果,对TNV-AC的cp基因在侵染枯斑寄主苋色藜过程中的其他功能进行了讨论.     

TNV-AC亚基因组表达及基因编码产物对局部枯斑症状的影响

利用烟草坏死病毒A中国大豆分离物(Tobacco necrosis virus A Chinese isolate, TNV-AC)的全长侵染性cDNA克隆构建系列突变体进行体外转录. 在枯斑寄主苋色藜(Chenopodium amaranticolor)上的侵染性检测结果表明, TNV-A^C亚基因组RNA1的转录起始位点位于基因组RNA的G²¹⁸⁴, 亚基因组RNA2的转录起始位点位于基因组RNA的G²⁴⁶⁰. 进一步分析表明, 亚基因组RNA1中p8和p6基因的翻译灭活突变可导致病毒在苋色藜上的侵染症状消失, 但不影响病毒在烟草原生质体中的复制, 说明p8和p6基因产物可能影响病毒在细胞之间的移动, 是病毒造成枯斑所必需的基因. 通过原核表达产物分析, 证明了亚基因组RNA2 中外壳蛋白(coat protein, CP)基因的可读框起始于基因组RNA的2612~2614位AUG. CP可读框核苷酸替换或缺失突变分析表明, 完整的CP蛋白虽不是病毒建立侵染所必需的, 但其翻译起始密码子区域的核苷酸序列保守性及可读框核酸序列的完整性对病毒侵染苋色藜后产生枯斑的数量、显症时间和病毒RNA的积累量具有明显影响. 综合以上结果, 对 TNV-A^C的cp基因在侵染枯斑寄主苋色藜过程中的其他功能进行了讨论.     

烟粉虱传播植物病毒特性及机制研究进展

烟粉虱是一类小型刺吸式口器昆虫,目前被认为是一个包含数十个隐存种的隐存种复合群.近年来随着进出口贸易的增加,烟粉虱在世界范围内急速扩散.烟粉虱主要通过传播植物病毒危害植物,对世界范围内的多种作物、蔬菜以及园林植物等造成巨大危害.目前可由烟粉虱传播的植物病毒涵盖5个属400多个种,其中菜豆金黄花叶病毒属为单链DNA病毒且均由烟粉虱以持久循环型方式传播,其余4个属均为单链RNA病毒并由烟粉虱以半持久型或非持久型方式传播.明确烟粉虱传播植物病毒的生物学特性,解析烟粉虱与病毒间的互作机制将为阻断烟粉虱传播植物病毒提供新方法、新思路.本文分别对烟粉虱传播不同属病毒的特性进行了综述,并着重讨论了烟粉虱与菜豆金黄花叶病毒属病毒的互作机制.菜豆金黄花叶病毒属病毒跨越烟粉虱中肠、唾液腺和卵巢屏障的过程需要多种介体蛋白的参与.烟粉虱不同隐存种传播同一种病毒的能力往往存在差异,而这种差异性传播往往与病毒穿过不同烟粉虱体内屏障的能力有关.同时,烟粉虱免疫系统在抵御病毒侵染过程中发挥重要作用.此外,多项研究表明病毒在烟粉虱体内存在复制迹象.     

基于分子信标对肿瘤细胞ING1转录水平调控的定量检测

利用分子信标检测技术, 结合建立的ING1分子信标/cRNA杂交标准曲线, 定量检测了药物处理, 基因转染和p53 RNA干扰(RNAi)等对肿瘤细胞ING1 mRNA表达水平的影响. 结果发现: 在低表达ING1的肿瘤细胞系MCF-7中, 5-FU处理和ING1基因稳定转染均能诱导细胞中ING1 mRNA表达水平升高; 在ING1表达水平正常的CNE2肿瘤细胞中, 利用RNAi 沉默p53表达引起ING1 mRNA表达水平降低. 这些细胞中ING1 mRNA表达水平在7.7×10^-16~53.4×10^-16 mol/mg总RNA. 该方法不仅能从转录水平上为基因表达调控效果提供定量依据, 而且有望用于信号通路途径中多基因转录水平的相互调节研究.     

从灭活病毒诱导的培养细胞中鉴定鱼类抗病毒相关基因

紫外线灭活的草鱼出血病病毒(GCHV)能诱导鲫鱼囊胚培养细胞(CAB)产生高滴度的干扰素并抵抗病毒入侵, 其机制可能是通过诱导一组抗病毒相关基因的表达, 而使寄主细胞建立起抗病毒状态. 利用抑制性差减杂交技术, 构建了灭活病毒诱导鱼类培养细胞基因差异表达的差减cDNA文库. 从差减文库中筛选鉴定出272个差异cDNA片段, 测序分析发现它们为69个基因, 其中46个为已知基因的同源物, 23个为未知的假定基因. 已知基因包括Ⅰ型干扰素信号通路的基因Stat1和Jak1, 抗病毒基因Mx和Viperin, 以及一系列干扰素激活基因或免疫相关基因. 23个未知的假定基因多数具有富含AU成分的序列. 虚拟Northern杂交和RT-PCR进一步证实这些基因在灭活病毒诱导的细胞中差异表达. 意味着灭活GCHV不仅能诱导CAB细胞分泌干扰素, 而且还导致一系列重要抗病毒相关基因或免疫相关基因的表达, 揭示鱼类干扰素系统的信号转导途径和抗病毒机制与哺乳类基本相似.     

从人到线虫的RNAa现象

RNA干扰(RNAi)原理的发现,使人们认识到小RNA-Argonaute通路介导的基因调控总是负性的,即导致基因表达沉默.2006年RNAa(RNA activation)现象的发现颠覆了这一看法,也引发争议.RNAa首先发现于人等哺乳类细胞,是由靶向基因启动子的、小RNA指导的RNAArgonaute通路对基因转录/表观遗传的正性调控.在RNAa过程中,小RNA与Argonaute蛋白形成RNA-蛋白复合物并进入胞核,与染色体上的靶位点结合,导致靶位点的组蛋白修饰等表观遗传的改变从而在转录水平激活基因表达.最近多项在线虫中的研究显示,线虫内源性22G-RNA指导Argonaute蛋白CSR-1在表观遗传水平促进内源性基因表达,以及微小RNA介导的RNAa,从而确立了RNAa是一种至少从线虫到人细胞进化保守的细胞机制,并揭示了小RNA基因调控通路的复杂性和功能多样性.     

丙肝病毒全基因组cDNA克隆侵染细胞培养体系的建立

以含有丙肝病毒全基因组cDNA的重组质粒(pHCV)为材料, 通过基因转染、重组痘病毒辅助使之在HeLa细胞中表达HCV病毒体, 建立了一种新的HCV体外细胞培养系统. 采用RT-PCR, 荧光定量RT-PCR, 链特异性RT-PCR, 免疫印迹, 免疫电子显微镜和电子显微镜负染技术跟踪检测HCV的增殖效率, 结果显示, 该培养体系中有HCV正链RNA的合成和HCV结构蛋白、非结构蛋白的表达, 并组装成直径约47 nm的HCV病毒体, 病毒体可被偶联有胶体金的抗HCV结构蛋白E2的单抗标记; 该体系产生的HCV病毒体滴度达107基因拷贝/mL, 远远高于病人血清中的HCV基因拷贝数, 也高于迄今报道的任何一种HCV细胞培养体系的病毒滴度. 检测结果证明, 转染细胞裂解上清中的HCV病毒体可以感染肝癌细胞系Huh7, 并在感染细胞中增殖和合成负链RNA中间体, 病毒滴度达106基因拷贝/mL.     

放线菌素D对烟草花叶病毒核糖核酸合成的影响

久已知道放线菌素D(AMD)强烈抑制依赖于DNA的RNA合成,但AMD对RNA病毒(包括噬菌体)的复制有无抑制作用的看法还不一致。Snger和Knight(1963)报告烟草花叶病毒RNA的合成不受AMD的抑制,因而认为病毒RNA的合成与DNA的样板功能无关。我们过去的实验证明,在TMV侵染之前或侵染的同时使离体烟叶的叶柄吸收AMD溶液(40微克/克组织)能显著抑制TMV的增殖,而在侵染之后24小时吸入同样剂量的AMD,     

小分子RNA的切除活动

自1989年发现基因沉默现象以来,关于小分子RNA不同作用的新报告接连不断.这些作用,包括调控信使RNA(mRNA)转译成蛋白质;确定染色体的构象;调节干细胞的更新;抗病毒和可能引起有害突变遗传因素的保护作用.动植物中的小分子RNA分为三类,即miRNA,siRNA和与Piwi相互作用的piRNA.miRNA是由基因组编码,被加工成22个碱基对,和同源mRNA相互作用,调节它们的转译活动,并对发育过程产生影响的一类分子.siRNA的长度是21个碱基对,由双链RNA前体产生,这些前体包括病毒和同系转位子在内.而最近才发现的piRNA,是存在于果蝇和动物的种系内,一般是由25个碱基对组成,和可转移的成分及另外一些序列相似.     

miR156介导的高等植物年龄途径研究进展

自然界生命体的生长发育和形态建成都与"年龄"密不可分."年龄"是一个不可逆的过程,所有生物都将经历幼年期到成年期,最终走向衰老和死亡.在植物体内,一个小分子RNA,miR156控制了幼年期到成年期的转化,它是目前唯一已知的年龄分子标记.miR156的表达量随着年龄的增长而逐渐减少,调控了植物生长发育和环境应答等多个过程.本文综述了植物体内miR156介导的年龄途径的最新研究进展,以及年龄调控miR156表达的分子机制.     

棉铃虫(Heliothis armigera Hübn)血球细胞单层培养

近年来,昆虫病毒在组织培养中的感染和增殖的研究,已有很大的进展。本文报道棉铃虫血球细胞的单层培养方法及结果,为研究昆虫病毒与宿主细胞间的相互关系,提供技术手段。Hink和Ignoffo曾建立美洲棉铃虫(Heliothis Zea)成虫卵巢的细胞系。但棉铃虫(H.armigera)幼虫血球细胞的单层培养,还未见有报道。自1978年4月以来,棉铃虫血球细胞的体外培养先后进行了二十余次,获得成功。材料大多数是用人工饲料单管饲养的5龄左右的健康幼虫,饥饿24小时后,用自来水洗净虫体,进     

HBx对HBV复制的调控

乙型肝炎病毒(HBV)是导致肝细胞肝癌(HCC)发生发展的重要诱因之一. HBV在感染细胞后进行病毒DNA的复制、病毒蛋白的合成以及新病毒颗粒的包装和释放等步骤,其中病毒感染细胞逃避宿主免疫后,就可能通过HBV复制产生子代病毒、形成持续感染、诱导肝癌的发生发展.机体中HBV的复制受到多种因素的影响,而乙型肝炎病毒的X蛋白(HBx)对于HBV复制的影响是其中一个重要因素.本文在对HBx蛋白的结构组成及其分布做简要阐述的基础上,重点综述HBx通过不同的修饰途径来调控HBV的复制,以及HBx通过mi RNA来调节HBV复制的进程.     

你问我答

问：患感冒时为什么浑身关节痛？答：我们体内的免疫功能持续不断地与病毒、细菌抗争,流感等病毒如果在鼻、喉、支气管等处增殖,免疫功能就会活跃起来击退病毒。在这个过程中,白血球等与病毒抗争的免疫细胞会分泌一种叫做＂细胞活素＂的蛋白质,这种在细胞之间传递信息的物质对大脑发挥作用使大脑发热。 免疫细胞因此得以增进     

重组慢病毒介导的人凝血因子Ⅸ cDNA在培养细胞和血友病B小鼠中的表达

为探索慢病毒载体介导的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ) cDNA在培养细胞中的表达水平, 及重组慢病毒应用于血友病B基因治疗的可行性, 分别构建由肝特异性启动子ABP调控的hFⅨ的慢病毒载体FAXW, 以及由泛肽-C调控的hFⅨ慢病毒载体FUXW; 用磷酸钙法, 将慢病毒载体与包装质粒CMVΔR8.2和包膜质粒VSV-G共转染产毒细胞293 T, 以制备重组慢病毒. 重组FUXW病毒分别感染293 T, BHK和L-02细胞, 经检测皆有hFⅨ蛋白表达. 重组FAXW病毒感染细胞48 h后, 仅在L-02细胞检测到hFⅨ高表达(630 ng/10⁶细胞), 而在其他感染细胞中hFⅨ表达较低. 将重组FAXW病毒经尾静脉途径注射入血友病B小鼠体内, 小鼠血浆中可检测到接近治疗水平的hFⅨ抗原(45 ng/mL), 且持续时间超过60 d. 上述结果表明, 慢病毒载体介导的基因转移为血友病B基因治疗提供了极有潜力的方法.     

水稻条纹叶枯病毒分子生物学的研究——外壳蛋白分子量、氨基酸组成和N末端

水稻条纹叶枯病是水稻的主要病害之一,其病原为水稻条纹叶枯病毒(Rice stripe virus,RSV)。RSV通过灰稻虱(Laodephax striatellus)等三种介体传毒,能侵染水稻、小麦、玉米等37种禾本科植物,引起严重减产。Koganezawa首次报道了RSV具有分枝线状结构,Toriyama提出RSV是三组分病毒,含有一种分子量为32000的外壳蛋白(CP)及4种单链RNA,最近他又在RSV颗粒中发现了相应的4种双链RNA。在我国水稻条纹叶枯病亦广     

甜菜坏死黄脉病毒RNA4的菌传功能分析

构建了甜菜坏死黄脉病毒（BNYVV）RNA4全长核苷酸序列以及5种编码区突变体的侵染性cDNA克隆，不同结构伯RNA4体外转录物与只含有RNA1，2和3的BNYVV分离物总RNAs混合后分别接种寄主植物番杏（Tetragonia expansa）作为毒源，繁殖后接种甜菜，利用无毒甜菜多黏菌(Polymyxa betae）进行传毒实验，结果表明，RNA4编码区内各种缺失突变均能显著地抑制多黏菌的传播，但插入4个碱基的移码突变体对传毒没有影响，说明BNYVVRNA4中的部分核苷酸序列对于被真菌介体高效传播是必需的，并且可能是在RNA水平上具有功能。     

利用RNA干扰技术敲减rlpk2基因的表达可以延缓大豆叶片衰老

叶片衰老是受细胞内部遗传程序控制的、植物叶片发育过程的最后一个阶段, 对启动和调控这一过程的分子机制及衰老信号的传递途径的研究具有重要意义. 从人工诱导衰老的大豆叶片中克隆到一个新的LRR型类受体蛋白激酶基因rlpk2 (GenBank登录号: AY687391), 无论在前期人工诱导衰老系统还是叶片自然发育过程中, 该基因在大豆叶片中的表达水平都表现出明显的衰老上调趋势. 利用RNA干扰技术(RNA interference, RNAi)“敲减”(knock-down)该基因的表达, 可以明显延缓转基因大豆叶片无论自然发育还是营养缺乏胁迫引起的衰老进程, 转基因植株叶片具有比较致密的表面结构及较高的叶绿素含量.