重组腺相关病毒基因药物三种滴度的比较与分析

采用酶联免疫吸附测定(ELISA)、实时荧光定量聚合酶链反应(Q-PCR)和转导方法对重组腺相关病毒(rAAV)的衣壳滴度、基因组滴度、转导滴度进行定量,并比较衣壳滴度/基因组滴度(P/GC)和基因组滴度/转导滴度(GC/TU).实验结果表明:3批rAAV的平均衣壳滴度为3.65×10¹³ P·mL^-1,平均基因组滴度为8.67×10¹¹ GC·mL^-1,平均转导滴度为9.85×10⁹ TU·mL^-1,P/GC平均值为41.70,GC/TU平均值为88.20,P/GC和GC/TU平均值接近于AAV2标准品,说明文中方法的制备工艺成熟、稳定,制备的rAAV感染活性较高.     

表达Kallistatin的9型重组腺相关病毒的制备及其体外表达效率

采用三质粒磷酸钙共转染生产系统,制备出可以表达内源性抗肿瘤血管生成因子(Kallistatin)的9型重组腺相关病毒(rAAV2/9)和2型重组腺相关病毒(rAAV2/2).rAAV经银染法鉴定其纯度;采用WesternBlotting法比较rAAV2/9和rAAV2/2外壳蛋白的大小;qPCR方法检测rAAV的滴度.使用rAAV2/9-Kal-listatin和rAAV2/2-Kallistatin分别感染人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)后,RT-PCR和ELISA法分别检测Kallistatin的mRNA和蛋白表达水平.结果表明:纯化的病毒纯度达到98%以上;rAAV9外壳蛋白比rAAV2的大.感染HUVEC后,rAAV2/9介导Kallistatin在mRNA和蛋白表达水平都要比rAAV2/2高.     

脑心肌炎病毒pCMV-HA-VP2表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的:构建脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis Virus,EMCV)衣壳蛋白VP2基因的真核表达载体pCMV-HA-VP2,并在HEK293细胞中表达.方法:提取EMCV的总RNA,RT-PCR扩增VP2基因,酶切后构建带HA标签的真核表达质粒pCMV-HA-VP2,运用脂质体介导法将其转染至HEK293细胞中,分别进行过表达检测、Westernblotting分析及IFA检测来验证VP2基因的转录及表达情况.结果:重组表达载体pCMV-HA-VP2构建成功,转染至HEK293细胞中,VP2蛋白和HA标签融合表达成功.结论:EMCV衣壳蛋白VP2基因的真核表达载体pCMV-HA-VP2在HEK293细胞中的成功表达,为EMCV衣壳蛋白的功能研究提供理想的实验材料,同时也为EMCV感染机制及其受体研究奠定基础.     

稳定表达绿色荧光蛋白的HEK293T细胞的构建

为探讨绿色荧光蛋白(GFP)在传代细胞中是否能随细胞的增殖稳定表达,构建稳定表达GFP的细胞系统,选取HEK293T细胞,使用第三代慢病毒包装系统,包装表达了GFP的慢病毒,然后用包装好的慢病毒去侵染HEK293T细胞.通过细胞成像技术统计了不同代数细胞的荧光强弱并计算细胞形态大小,利用膜片钳记录了HEK293T细胞的电流-电压(I-V)曲线.实验结果显示,GFP能随细胞的增殖稳定表达,被慢病毒侵染后的细胞的形态及基本电生理活动与正常细胞相比,没有产生显著差异.     

真核表达肝药酶UGT1A9可溶重组蛋白方法探索

UDP-葡萄糖醛酸基转移酶(UGTs)是人体重要的肝脏药物代谢酶,其底物选择性、催化机制等研究因难以获得可溶性全酶而受到限制.本研究以制备UGT1A9可溶重组蛋白为研究目标,通过筛选重组蛋白表达体系、融合标签种类及linker长度,优化重组蛋白表达纯化条件和方法,实现了重组UGT1A9的大量制备.HEK293F细胞分泌表达的His₈-MBP-NSAS-UGT1A9(氨基酸25-466)重组蛋白经Ni-TED亲和纯化介质从培养基上清液中分离,洗脱产物经SDS-PAGE、Western blot及MS检测鉴定为目的蛋白,通过Bradford法测得重组蛋白最终产量为2 mg/L,纯度达到95%以上.本研究建立了一种人源药物代谢酶UGT1A9的可溶重组蛋白表达纯化方法,为UGT1A9及UGTs同工酶的药物代谢、催化机制及结构解析研究奠定基础.     

慢病毒介导稳定表达HBcAg的P815/c细胞株的建立及鉴定

研究旨在建立稳定表达HBcAg的P815/c細胞株,为评价针对HBcAg的乙肝疫苗的免疫效果提供体外感染的细胞模型。通过构建携带HBcAg基因的慢病毒表达载体质粒pLenti-Ubc-HBcAg-EGFP-3FLAG4RES-Puro,载体质粒携帯有加强型绿色荧光蛋白(eGFP)及嘌呤霉素(Puromycin)抗性标记基因,与包装质粒pLP1、pLP2以及包膜质粒pLP/VSVG共转染人胚肾293T细胞进行包装,得到携帯有HBcAg基因的重组慢病毒颗粒LV-HBcAg-Puro。经纯化、鉴定后转染小鼠肥大瘤细胞株P815细胞72h后,通过加入并维持2μg/mL的嘌呤霉素杀死未被有效感染的细胞,药物筛选约10 d后,免疫荧光及流式细胞仪检测表达GFP的细胞比例在98%以上,Western Blot可检测到转染后细胞内HBcAg的蛋白表达。成功构建稳定表达HBcAg基因的细胞株P815/C,为研究小鼠体内针对HBcAg的疫苗诱发的CTL反应提供了细胞杀伤实验的靶细胞。     

重组人源抗血管内皮生长因子单克隆抗体的制备及鉴定

通过优化密码子获得带有信号肽的人源抗血管内皮生长因子（VEGF）抗体的重链和轻链DNA序列, 分别构建表达载体pcDNA VEGFH和pcDNA VEGFV, 将表达载体共转染HEK 293细胞后, 与C6胶质瘤细胞共培养, 并将所得蛋白进行分离纯化. 实验结果表明: pcDNA VEGFH和pcDNA VEGFV共转染HEK 293F细胞, 可显著抑制C6细胞增殖（P<0.01）; 转染24~144 h后的细胞培养上清液中均有蛋白表达; 所得纯化蛋白和标准品一致; 纯化所得抗体蛋白能明显抑制C6细胞增殖（P<005~001）, 与标准品抑制效果相似.     

重组人源抗血管内皮生长因子单克隆抗体的制备及鉴定

通过优化密码子获得带有信号肽的人源抗血管内皮生长因子（VEGF）抗体的重链和轻链DNA序列, 分别构建表达载体pcDNA VEGFH和pcDNA VEGFV, 将表达载体共转染HEK 293细胞后, 与C6胶质瘤细胞共培养, 并将所得蛋白进行分离纯化. 实验结果表明: pcDNA VEGFH和pcDNA VEGFV共转染HEK 293F细胞, 可显著抑制C6细胞增殖（P<0.01）; 转染24~144 h后的细胞培养上清液中均有蛋白表达; 所得纯化蛋白和标准品一致; 纯化所得抗体蛋白能明显抑制C6细胞增殖（P<005~001）, 与标准品抑制效果相似.     

氧化应激促进重组腺相关病毒2型体外转导分析

为揭示氧化应激在重组腺相关病毒2型(rAAV2)转导中的作用,以过氧化氢(H₂O₂)和铁过载(Fe-NTA)氧化应激为模型,在293T,LO-2,Hela,A549细胞中,从转基因表达量、阳性细胞数、基因组数和病毒衣壳分布等方面研究氧化应激对rAAV2转导的影响.实验结果表明:H₂O₂和Fe-NTA能促进rAAV2转导,转基因表达量、阳性细胞数、基因组数与对照组相比的差异具有显著的统计学意义;细胞转导12 h后,氧化应激组核周围衣壳分布数目显著比对照组多,氧化应激能够促使rAAV2长时间聚集在细胞核周围;当氧化应激产生的活性氧(ROS)被N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)消除,则氧化应激促rAAV2转导作用消失,说明氧化应激通过ROS发挥促进rAAV2转导作用.     

四环素调控表达系统调节EGFP和HBV前核心蛋白在哺乳动物细胞中表达

构建新型四环素调控的增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因和乙肝病毒(HBV)前核心蛋白基因的表达载体,利用脂质体转染哺乳动物细胞.流式细胞术检测结果说明:应用此系统四环素可使EGFP在CHO细胞中的表达提高18倍,在SSMC-7721细胞与HEK293细胞中的表达分别提高5倍和接近2倍.并且,四环素可有效地诱导HBV的前核心蛋白基因在肝癌细胞系中的表达.     

CRISPR/Cas9基因转录激活技术的建立及其应用

建立基于CRISPR/Cas9的基因转录激活技术,实现在HEK293细胞中激活cGAS基因的转录。首先利用慢病毒载体构建稳定表达Cas9的HEK293细胞;并采用Real-time PCR和western blot方法鉴定Cas9蛋白质表达效果。再选取不同靶序列,分别构建用于激活cGAS基因转录的sgRNA载体,将构建好的序列载体与CRISPR体系工具质粒共转染至稳定表达Cas9的HEK293细胞中。采用Real-time PCR方法检测细胞中内源cGAS的转录激活效果。成功建立了基于CRISPR/Cas9的基因转录激活技术,并在c GAS基因阴性表达的细胞中激活基因的转录。     

“双碳”背景下山东自然保护地碳汇功能及价值

以山东省自然保护地为研究对象,系统分析了自然保护地内不同生态系统的碳汇功能及其差异性,并针对碳汇价值实现路径进行了探索研究。结果表明,山东省自然保护地的碳汇总量为2.99×10⁶ t/a,其中森林生态系统碳汇最高(1.20×10⁶ t/a),随后依次为农田生态系统(9.09×10⁵ t/a)、近海生态系统(5.22×10⁵ t/a)、滨海湿地生态系统(2.27×10⁵ t/a)、内陆湿地生态系统(1.28×10⁵ t/a)、草地生态系统(0.04×10⁴ t/a),其碳汇总价值为1.23×10⁹元,单位面积碳汇价值为7.61×10³元/hm²。鉴于自然保护地的碳汇价值,本研究从基于自然保护地生态补偿的角度对碳汇价值实现路径进行了讨论分析,提出了碳交易与生态补偿相结合的框架体系。     

Controlled expression of enhanced green fluorescent protein and hepatitis B virus precore protein in mammalian cells

A novel tetracycline regulation expression system was used to regulate the expression of enhanced green fluorescent protein (EGFP) and hepatitis B virus precore protein in the mammalian cell lines with lipofectAMINE. Flow cytometry assays showed that application of the system resulted in about 18-fold induction of EGFP expression in CHO cell lines and 5-fold induction in SSMC-7721 cells and about 2-fold in the HEK293 cells. Furthermore, the effective use of this system for the controlled expression of HBV precore protein gene in hepatocellular carcinoma cells was tested.     

汉滩病毒囊膜糖蛋白g2基因重组腺病毒的构建与表达

获得汉滩病毒G2 基因 ,构建其重组腺病毒并在HEK2 93细胞中包装表达 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础。设计引物采用PCR从含汉滩病毒 \|76 1 1 8株M基因的M5 6质粒扩增出糖蛋白G2 基因片段 ,并将其克隆入腺病毒载体Adeno XviralDNA ,筛选获得重组腺病毒DNA ,转染HEK2 93细胞 ,包装、扩增后得到汉滩病毒G2 基因重组腺病毒原种 ;并在感染细胞内初步表达 ,用ELISA检测表达产物。得到了含汉滩病毒G2 基因的重组腺病毒 ,其滴度约为 1 0 10 pfu/mL ,同时在感染的HEK2 93细胞中检测到汉滩病毒糖蛋白G2 的表达。含汉滩病毒糖蛋白G2 基因重组腺病毒的成功构建 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础     

黑河市森林火灾碳排放的计量估算研究

根据黑河市森林调查的实测数据和1971—2011年间森林火灾的统计资料,采用地理信息系统(GIS)技术,通过大量野外火烧迹地的调查,结合实验室的控制实验,确定森林火灾碳排放的各计量参数,并利用排放因子的方法,估算了黑河市41年间森林火灾碳排放量和含碳气体排放量。结果表明:41年间黑河市森林火灾碳排放量为4.00×10⁷ t,年均排放量为9.76×10⁵ t,约占全国年均森林火灾碳排放量的8.63%; 含碳气体CO₂、CO、CH₄和非甲烷烃(NMHC)的排放量分别为1.24×10⁸、6.51×10⁶、4.30×10⁵和3.47×10⁵ t,年均排放量分别为3.01×10⁶、1.59×10⁵、1.05×10⁴和8.46×10³ t,分别占全国年均森林火灾各含碳气体排放量的7.42%、5.86%、9.37%和7.49%。研究发现针阔混交林型的森林火灾面积占总过火林地面积的42.73%,由于该林型燃烧效率较低,其森林火灾中的碳排放量仅占排放总量的29.61%,且CO₂的排放因子较低,其CO₂排放量仅占CO₂总排放量的30.11%。同时研究表明,黑河市年均碳排放对该市的碳循环与碳平衡产生重要影响,针对研究结果提出了合理的林火管理路径。     

中子辐照对纳米金刚石颗粒的影响——Raman光谱分析

利用Raman光谱对经中子辐照处理的纳米金刚石微粉进行了分析,中子能量为0.5～10MeV,辐照剂量10¹⁶～10¹⁷ n·cm^-2。中子辐照引起缺陷及应力使Raman峰发生宽化和红移。同时,在中子引入的能量的作用下,纳米金刚石中部分sp²杂化的石墨相转变为sp³杂化的金刚石相。     

Β2上α次殆星映射的一类有界构造

利用凸映射的构造方法,给出单位球Β²上的α次殆星映射的有界构造,推广单位球Β²上星形映射的结果.作为应用,建立α次殆星映射与Löewner链的关系,从Löewner链角度刻画Β²上α次殆星映射的性质,且给出f为α次殆星映射的两个等价命题.     

腺病毒介导ERK-2基因在生长板软骨细胞中的表达

目的:构建ERK-2基因重组腺病毒载体,检测构建的腺病毒感染原代大鼠生长板软骨细胞的效率以及目的基因的表达。方法:将ERK-2 cDNA亚克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同转染E.Col.i B J5183,将筛选、鉴定的重组腺病毒质粒线性化后转染HEK293细胞进行病毒颗粒的包装;流式细胞术检测不同感染复数(MO I)ERK-2重组腺病毒感染原代培养的大鼠肋生长板软骨细胞的效率,W estern b lot检测腺病毒感染的生长板软骨细胞中ERK-2蛋白的表达。结果:成功构建ERK-2重组腺病毒,MO I 50的腺病毒感染原代生长板软骨细胞的效率大于90%,感染的生长板软骨细胞中ERK-2表达显著增加。结论:构建的重组腺病毒可介导ERK-2基因在原代大鼠生长板软骨细胞中高表达。     

粤港澳大湾区红树林湿地鸟类承载力评估与提升对策——以深圳湾福田红树林为例

针对湿地生态健康评价中的鸟类承载力评估问题,建立底栖动物去灰分干重(AFDW)的换算方法, 优化湿地鸟类体型分类标准。以深圳湾福田红树林湿地为例, 通过计算底栖动物总资源量、可支持水鸟总热值和水鸟种群的野外代谢率, 评估福田红树林湿地的水鸟承载力。结果表明: 1) 福田红树林湿地底栖动物的总资源量具有明显的季节特征, 冬季(4.67×10⁴kg)<春季(6.08×10⁴ kg)<夏季(8.00×10⁴ kg)<秋季(1.23×10⁵ kg), 以秋季为例, 不同生境的单位面积资源量为红树林植被区(89.22 g/m²)>滩涂区(3.58 g/m²)>基围鱼塘区(0.22 g/m²); 2) 湿地不同季节可支持水鸟的总热值为冬季(1.03×10⁸ kJ)<春季(1.36×10⁸ kJ)<夏季(1.76×10⁸ kJ)<秋季(2.70×10⁸ kJ); 3) 福田红树林湿地水鸟种群野外代谢率为467.27 kJ/d; 4) 秋季、冬季和春季是候鸟迁徙期, 福田红树林湿地对水鸟的承载力分别为6431, 2438和3235只, 而实际观测数据高于研究结果, 说明当前福田红树林湿地对水鸟的承载力不足, 不能满足候鸟迁徙季节的鸟类食物需求, 湿地水鸟可能存在数量下降的风险。建议从加强红树林的保护与恢复重建、开展基围鱼塘生态修复和功能提升工程、强化鸟类和底栖动物的动态监测3个方面, 继续加大对福田红树林湿地的生态保护力度, 以期提高底栖动物总资源量, 进而提升红树林湿地的鸟类承载力。