TBSV病毒瞬时表达载体构建及其表达

为了深入理解植物RNA病毒载体表达系统,初步建立了利用TBSV病毒表达载体在寄主植物烟草中表达外源蛋白的技术体系.以番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus,TBSV)为材料,构建了含报告基因sGFP的WY1,WY2等2个重组病毒表达载体,并将载体导入农杆菌GV3101用于侵染烟草植株叶片;利用农...     

番茄Pti基因瞬时表达与互作检测

丁香假单胞菌所导致的细菌性斑点病是影响番茄产量和品质的重要病害,而番茄色氨酸苏氨酸激酶(Pto)是植物识别、防御这一病原菌的重要抗性蛋白。文章通过克隆番茄Pti(Pto interaction protein)基因Pti4、Pti5和Pti6,分别构建植物表达载体,利用农杆菌介导方法在烟草叶片中进行瞬时表达和western blotting检测,并进一步利用免疫共沉淀技术,在植物体系中检测了它们与番茄Pto蛋白的相互作用。实验结果表明,利用所构建Pti4、Pti5和Pti6基因植物表达载体,在烟草中获得了预期大小Pti4、Pti5和Pti6蛋白,并在植物体系中验证了它们与Pto蛋白的相互作用。该工作为深入研究Pti基因在番茄分子免疫途径的功能奠定了基础。     

通过瞬间表达测定植物花药花粉特异基因启动子的时空表达性

通过瞬间表达快速测定了ＴＡ２９（烟草花药特异基因）和Ｚｍ１３（玉米花粉特异基因）启动子在一些植物中的时空表达性，结果表明，ＴＡ２９启动子在烟草和番茄的花药中具有时空表达性，而Ｚｍ１３启动子在油菜花粉中无任何表达，这为一些植物构建或转化雄性不育和恢复基因提供了理论依据．此外，还讨论了用基因枪转化的瞬间表达方法，测定植物花药花粉特异基因启动子时空表达性的可行性     

PuFAD8基因过表达载体的构建及其在番茄中的遗传转化

脂肪酸去饱和酶8(fatty acid desaturase 8,FAD8)是FAD基因家族成员，可参与催化不饱和脂肪酸的合成进而影响果实香气。为进一步研究PuFAD8基因的功能及其与番茄果实挥发性物质的关系，文章构建了模式植物番茄PuFAD8基因的过表达载体，通过农杆菌介导遗传转化、植物组织培养技术获得番茄PuFAD8基因过表达植株。结果表明，番茄PuFAD8基因过表达载体构建成功，并获得番茄过表达植株，以便进一步研究该基因的分子功能，为明确其在番茄果实成熟过程中挥发性物质的调控机制奠定了基础。     

以提高乙肝病毒表面抗原表达量和免疫原性为目的的番茄果实特异表达载体的构建

为了提高乙肝病毒表面抗原基因在番茄果实中的表达量和免疫原性,采用克隆的E8番茄果实特异表达启动子和乙肝病毒表面抗原M蛋白基因构建了植物表达载体pBIES2, 及只含有乙肝病毒表面抗原S蛋白的表达载体pBIES,并将它们分别导入根癌农杆菌LBA4404中.最后对该载体的优越性进行了讨论.     

丙型肝炎病毒E2基因在转基因番茄植株中的表达

以T-E1E2为模板扩增得到丙型肝炎病毒包膜蛋白基因E2,构建该基因的植物表达载体p35s-E2．通过农杆菌介导的叶盘法转化番茄子叶．转基因番茄植株叶片总DNA的PCR、Southern blot检测结果表明,E2基因已整合进了转基因番茄植株基因组中;RT-PCR,Western blot分析证实E2基因在转基因番茄植株叶片中表达．     

CMV启动子克隆及其在植物体内的表达

根据细胞肥大病毒CMV启动子基因序列设计引物,PCR扩增目的基因后,利用基因重组技术成功构建具有Kan抗性和GUS intron报告基因的植物表达载体LpPCG,并将重组质粒转化到烟草叶片中.通过CMV启动子指导的GUS intron基因在烟草叶片内的瞬时性表达,比较了其植物表达特性.结果表明:CMV启动子可启动GUS在植物体内的表达,其表达活性相当于2×35S启动子的(80.4±26.6)％.     

通过瞬间表达测定植物花药花粉特异基因启动子的时空表达式

通过瞬间表达快速测定了ＴＡ２９和Ｚｍ１３启动子在一些植物中的时空表达性，结果表明，ＴＡ２９启动子在烟草和番茄的花药中具有地空表达性，而Ｚｍ１３启动子在油菜花粉中无任何表达，这为一些植物构建或转化不育和恢复基因提供了理论依据。     

蜡梅CpPR-4基因的克隆及植物表达

在现有的蜡梅cDNA文库的基础上克隆了蜡梅病程相关蛋白4基因,并将其克隆至植物表达载体pCAM-BIA2301g上,构建了该基因的融合表达载体pCAMBIA2301g/CpPR-4,转入至大肠杆菌LBA4404后利用叶盘法转化至烟草并进行相关功能分析,通过抗病性实验及低温胁迫实验分析,转基因烟草对病毒无明显抗性,对低温不利环境有一定抗性.     

番茄胞嘧啶甲基转移酶同源基因SlMET1功能研究

真核生物中,DNA甲基化作为表观遗传学修饰的重要手段之一,影响了植物的大量生长发育过程。文章通过生物信息学分析确定番茄中的胞嘧啶甲基转移酶同源基因(SlMET1)并对其进行进化关系的分析;利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术从番茄cDNA中扩增出胞嘧啶甲基转移酶同源基因(SlMET1)全长,构建SlMET1与绿色荧光蛋白融合表达载体,通过在烟草瞬时表达系统,对其进行亚细胞定位;实时定量PCR分析SlMET1基因在番茄不同组织中的表达模式;同时,构建SlMET1与HA标签蛋白融合表达载体,通过免疫共沉淀分析其与DDB1的相互关系。研究结果表明:SlMET1基因在番茄各个时期和组织中都有表达,其中,叶片和花中表达量较高,在果实的变色期和红果时期表达量较低;通过绿色荧光融合蛋白载体的表达,确定SlMET1基因只在番茄细胞核中表达;通过免疫共沉淀分析确定SlMET1和DDB1之间存在相互作用。该研究为研究DDB1以表观遗传学的方式调控植物生长发育过程奠定了理论基础。     

含有MAR序列的植物表达载体pBI121-MARs的构建

将MAR（Matrix Attachment Region）构建到外源基因表达框的两侧．可以促进外源基因的表达．减少转基因沉默。实验利用PCR方法从普通烟草基因组中分离到一段MAR序列，将其正向重复插入到植物表达载体pBI121肛葡糖醛酸酶（β-glucuronidase，GUS）基因表达框的两侧，形成一个新的植物表达载体。     

基因沉默抑制子HC-Pro表达载体的构建

RNA沉默广泛存在于植物等大多数真核生物中,能够防御外源基因的入侵和调控基因表达等.然而,基因沉默抑制子HC-Pro蛋白的具体功能的研究并不十分清楚.本文重点介绍了基因沉默抑制子HC-Pro的表达载体pBI121-HC-Pro的构建及HC-Pro基因在烟草(Nicotiana benthamiana)中的稳定表达.并利用半定量RT-PCR技术检测了目的基因HC-Pro的表达,检测结果表明我们获得了HC-Pro基因稳定表达的转基因烟草株系,为进一步深入研究基因沉默抑制子HC-Pro的功能奠定了实验基础.     

大肠杆菌菌毛抗原K88与热稳定肠毒素ST融合基因植物表达载体的构建及其在烟草中的初步表达

利用DNA重组技术,将编码大肠杆菌黏附素蛋白K88与热稳定肠毒素ST的融合基因的序列片段克隆到植物表达载体pCANBIAl3O2中,成功地构建了植物重组表达质粒pCANBIA—K88-ST,并将其转化农杆菌EHAl05．利用农杆菌介导法转化烟草,并初步获得转化体。为K88-ST基因的进一步研究奠定了基础。     

苜蓿花叶病毒复制酶基因全长cDNA植物表达载体的构建和对烟草的转化

将苜蓿花叶病毒中国分离株(Alfalfa mosaic virus Chinese isolate，A1MV-Ch)的复制酶P2亚基(90 kD蛋白)基因的全长cDNA构建到植物表达载体pROKⅡ中，得到重组植物表达载体pAIMV-FL．用三亲融合法导入农杆菌LBA4404，并转化烟草，经PCR检测，获得了含全长cDNA的转基因烟草植抹．     

杂交鹅掌楸LhARF2基因启动子的克隆及瞬时表达分析

生长素响应因子(Auxin response factor, ARF)参与调控植物生长发育的多个途径。本研究利用Tail-PCR技术从杂交鹅掌楸中克隆LhARF2基因5′端上游2 637 bp序列,即pLhARF2启动子,并利用生物信息学软件PlantCARE分析其包含的调控元件,发现其含有启动子必需元件TATA-box和CAAT-box,以及压力响应、激素响应、光信号转导和代谢循环过程元件。构建pLhARF2-pCAMBIA1300:GUS植物表达载体并瞬时浸染本氏烟草叶片,利用GUS组织化学染色法鉴定烟草叶片中瞬时表达活性,发现在烟草叶片中有蓝色斑块,但颜色较浅。实验结果推测杂交鹅掌楸pLhARF2启动子可以调控GUS基因活性,为下一步研究启动子遗传转化的组织表达活性奠定了基础。     

抗汉滩病毒单抗3G1 scFv植物表达载体的构建

利用PCR方法，从含有3G1 scFv基因的重组质粒中扩增出抗体基因，并使基因两端携带合适的限制性酶切位点．将其克隆人植物表达载体pBI121，构建获得3G1 scFv-pBI121重组质粒．酶切鉴定及测序结果均证明重组质粒构建成功，将重组植物表达载体转入农杆菌LBA4404，为进一步构建转基因植物的研究奠定了基础．     

泛素和PR1a信号肽融合基因植物表达载体的构建

泛素（Ubiquitin）融合蛋白策略在近年来已被应用于在植物中提高外源蛋白的产量。信号肽（Signal Peptide）使外源蛋白定向运输到细胞内的特定部位。本研究是在植物高效表达载体pBin438的基础上，采用三引物PCR法（TP-PCR）技术，将拟南芥（Ambidopsis）泛素基因与烟草病程相关蛋白PR1a基因的信号肽序列体外重组；并将重组的融合基因定向克隆到植物表达载体pBLG中，获得了含有泛素和PR1a信号肽序列的植物表达载体pBLG-UP。这为进一步验证外源基因在植物体内的高效表达奠定了基础。     

植物中外源蛋白Netrin-1的瞬时表达

植物瞬时表达系统具有安全、快速、经济和高效的特点,已经成为近些年来国内外的研究热点之一.本研究利用来源于烟草花叶病毒TMV的载体30B成功构建了植物瞬时表达载体p35S-30B-Netrin-1,并在烟草中成功地表达了神经轴突细胞导向生长因子-1(Netrin-1).利用报告基因进一步对植物瞬时表达体系进行了优化研究,确定了利用烟草瞬时表达外源蛋白Netrin-1的最适条件,为将来在植物中进行外源蛋白的瞬时表达和快速生产奠定了实验基础.     

番茄红素β环化酶基因RNAi植物表达载体的构建及遗传转化

番茄红素是类胡萝卜素合成途径中重要的中间产物,本研究探讨了在番茄中通过RNAi手段提高番茄红素含量的依据,由Genbank中番茄红素β环化酶(Lyc-β)序列设计2对引物,通过高保真PCR扩增出2段Lyc-β基因的高度保守片段。根据RNAi的原理将该基因片段构建成为具有RNA干扰作用的植物表达载体,将该干扰载体通过农杆菌介导转化的叶盘法转入烟草中。经过PCR鉴定证明,干扰载体已经转入烟草中。