外源一氧化氮调控三角褐指藻响应氮胁迫的作用研究

为探究外源一氧化氮(Nitric Oxide,NO)对三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)响应氮胁迫的作用,本研究通过添加外源NO供体硝普钠(Sodium Nitroprusside,SNP)及NO清除剂[2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-teramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide,cPTIO],探讨外源NO对氮胁迫条件下的三角褐指藻细胞密度、叶绿素含量、叶绿素荧光参数、岩藻黄素含量、油脂相对含量等的影响。结果表明,缺氮会抑制三角褐指藻细胞的生长,显著降低叶绿素a (chla)含量与光合效率,降低岩藻黄素含量,增加脂质合成。与氮正常情况下相比,在缺氮条件下添加200 μmol/L SNP可在一定程度上缓解缺氮对三角褐指藻生长、叶绿素含量、光合效率与岩藻黄素积累的抑制,并能显著促进油脂的积累。在缺氮条件下添加50 μmol/L cPTIO对三角褐指藻的生长、叶绿素含量、光合效率及物质积累影响不大。本研究可为探明外源NO调控三角褐指藻响应氮胁迫的作用机制提供基础数据,也为进一步提高逆境条件下三角褐指藻的生物量及促进成分积累量提供参考依据。     

氮源及其浓度对三角褐指藻生长及其脂肪酸组成的影响

为研究氮源的种类和浓度对三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)生长及脂肪酸组成的影响,用含有不同浓度的NO-3和NH4 在叉培养基中对三角褐指藻进行培养,测定了其生长及脂肪酸的组成.结果表明,以NH4 为氮源时三角褐指藻的比生长速率大于硝酸钠;在NH 4为2.1 mmol/L时三角褐指藻达到最高比生长速率.三角褐指藻的主要脂肪酸是14: 0、16:0、16:1和20:5n-3(二十碳五烯酸,EPA).以NO-3为氮源时,EPA和高度不饱和脂肪酸(PUFAs)含量随着NO-3浓度增加先上升后下降,在1.0 mmol/L时的EPA占总脂肪酸质量分数比达到最高(16.9%).当氯化铵浓度大于3.9 mmol/L时,EPA的含量占总脂肪酸质量分数比随浓度的增加较大,在8.0mmol/L达到26.1%.     

三角褐指藻和小球藻营养成分的对比分析

通过检测三角褐指藻和小球藻的蛋白质、糖、色素、游离氨基酸及不饱和脂肪酸的含量,比较了三角褐指藻和小球藻的营养价值.结果发现:在单个细胞中,三角褐指藻的蛋白质、糖、叶绿素a、类胡萝卜素、游离氨基酸的含量高于小球藻;在1个生长周期(12,d)中,三角褐指藻累积的蛋白质、糖、游离氨基酸、棕榈油酸、二十碳五烯酸(EPA)也高于同龄的小球藻,但叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素、油酸、亚油酸、亚麻酸及二十碳烯酸的累积量却低于小球藻.综合分析,三角褐指藻的营养价值不比小球藻低,具有潜在的开发前景.     

二酰基甘油转移酶对三角褐指藻油脂积累及相关环境因子响应的研究

本文应用RT-PCR和RACE方法扩增出三角褐指藻二酰基甘油转移酶(Ptdgat)全长cDNA,其完整编码框(ORF)为1587 bp,编码528个氨基酸.基于克隆所得Ptdgat的ORF构建了反向互补RNA干扰载体,并用基因枪PDS-1000/He转化野生型三角褐指藻,筛选到了所需的阳性转基因藻.实时荧光定量PCR(qPCR)结果揭示:含Ptdgat RNA干扰结构的转基因藻的二酰基甘油转移酶的表达水平比野生型三角褐指藻该酶的表达水平有显著降低;野生型藻和转基因藻的油脂含量定量分析结果揭示:含RNAi干扰结构的转基因三角褐指藻油脂含量也明显低于野生型三角褐指藻.另外本文也揭示了适当浓度的外源培养因子铁、硅和脱落酸(ABA)提高了三角褐指藻Ptdgat基因的表达水平及其油脂含量.     

乙酸乙酯对三角褐指藻生长的影响

以三角褐指藻为研究对象,研究了不同质量浓度的乙酸乙酯对其生长的影响。结果表明,在质量浓度低于1.8g/L时,乙酸乙酯对三角褐指藻的生长不产生负面影响,并能提高三角褐指藻的细胞密度和部分脂肪酸的质量分数。其中,细胞密度提高了35%,C18∶0、C18∶2和C20∶5等几种具有经济价值的脂肪酸在总脂肪酸中所占的质量分数分别提高了15.32%,23.15%和31.13%。另外,光合作用活性测定结果表明,加入乙酸乙酯后,三角褐指藻的最大光合作用速率P_max降低、呼吸作用速率R_d增加,这证明了乙酸乙酯是以有机碳源的形式被藻细胞利用,三角褐指藻以混合营养的方式生长。     

同源重组敲除三角褐指藻基因的研究

为探索应用基因敲除技术研究三角褐指藻基因功能的研究体系,本文以三角褐指藻甘油激酶基因作为靶基因,构建了同源重组基因敲除载体,利用微弹轰击法将该载体成功转化至三角褐指藻中,经100μg/mL Zeocin筛选和PCR验证获得了34个阳性转基因藻株;并进一步对三角褐指藻甘油激酶基因敲除转基因藻株的甘油激酶表达量和生长两方面进行分析,结果显示胞外甘油兼养不影响转基因藻细胞生长,甘油激酶不表达或表达量降低.本文通过构建敲除载体,完成了遗传转化,筛选获得阳性转基因藻,并进一步研究了转基因藻的性状,最终建立了应用同源重组基因敲除技术靶向研究三角褐指藻基因功能的研究体系.     

三角褐指藻PPDK基因RNAi载体的构建和基因枪转化

三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的全基因组序列已经公布,为了把RNAi的技术应用于三角褐指藻的相关研究中,以C4途径关键酶丙酮酸磷酸二激酶基因(PPDK)为试验对象,构建了用于表达与PPDK部分序列同源的发夹RNA(hpRNA)的载体pPPDKi,并用基因枪方法成功将PPDKi和Zeocin抗性基因sh ble共转化到三角褐指藻细胞中.摸索出的较优基因枪转化的条件为:使用50%海水f/2培养基预培养的藻进行微粒轰击,轰击压力10.5 MPa,钨粉直径1.0 μm,轰击距离6.5 cm.PCR 检测结果表明,在Zeocin筛选的阳性藻株中约有60%同时整合了PPDKi序列.将其中6株共转化的转基因藻与野生型藻的生长速率进行比较,发现它们的生长受到4.6%～10.7%的抑制.这可能是PPDKi的表达影响了丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)的活性,从而进一步影响了三角褐指藻的生长,但也有可能是外源片段的插入影响了其他基因的正常表达,导致细胞活动异常.     

猪粪废水用于三角褐指藻培养的研究

研究了以猪粪废水培养一株三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的可行性.结果表明:猪粪废水经30g/L盐水适当稀释后可直接用于三角褐指藻的培养,无需添加其他营养物质.在污水稀释率为25倍时,藻细胞可良好地生长,最高密度为合成培养基的1.52倍.同时三角褐指藻有效去除了污水中的氮磷,总氮、氨氮和总磷的去除率分别为23%,93%和93%.与合成培养基养殖的藻相比,猪粪废水养殖的三角褐指藻的二十碳五烯酸和多不饱和脂肪酸的含量略有上升,实现了培养三角褐指藻转化废水为生物量并积累多不饱和脂肪酸的资源化.     

几种单胞藻对火腿许水蚤脂肪酸组成的影响

采用气相色谱分析法测定了几种常用单胞藻及其投喂培养的火腿许水蚤的脂肪酸组成.结果表明,金藻8701和三角褐指藻分别具有较高的DHA和EPA含量,比较适合作为桡足类饵料.金藻8701及其与三角褐指藻、绿色巴夫藻、亚心形扁藻等组合作为混合饵料投喂时,培养的火腿许水蚤的几种重要必需脂肪酸(ARA、EPA、DHA)的含量都较高,其中,以金藻8701和绿色巴夫藻按体积比1∶1作为混合饵料时,火腿许水蚤的DHA/EPA值接近2∶1,更有利于其作为海水仔稚鱼的优质饵料.     

氮磷铁营养浓度对不同品系三角褐指藻生长影响的比较研究

三角褐指藻是海水养殖动物幼体较为理想的活饵料,已在水产育苗生产中得到了广泛应用。国内外学者对三角褐指藻培养液的营养组成进行过不少研究,但所得结论差异较大 [1, 2, 3]。但对不同品系的研究较少,只有 Hayward(1968)[6]研究了不同品系三角褐指藻的营养盐组成差异。为探明两种新分离品系三角褐指藻人工培养的营养需求,我们用正交试验比较了不同氮磷铁营养盐对不同品系三角褐指藻生长的影响,以期更好地为水产养殖服务。 1材料与方法 1.1试验材料 　　藻种：厦门海区三角褐指藻单种培养品系（ XS003）,浙江海区三角褐指藻单种品系…     

甘油激酶基因对三角褐指藻理化性质的影响

为了探索甘油激酶(glycerol kinase,GK)基因对三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)生长的影响,以GK基因过表达藻株、干扰藻株和野生型藻株为研究对象,测定了其生长情况、GK基因转录水平、GK活性、脂质含量和金藻昆布多糖等参数.结果显示:转基因藻株的比生长速率与野生型藻株无显著差异;过表达藻株GKOE1-8、GKOE7-1的转录水平显著上调,GK活性增强了3.55倍和2.58倍,中性油脂含量增加64.95%和18.49%,金藻昆布多糖含量增加50.89%和42.11%;而干扰藻株GKRNAi3-1、GKRNAi4-1的转录水平则显著下调,伴随着GK活性降低52.34%和6.64%,中性油脂含量减少26.88%和16.98%,金藻昆布多糖含量减少16.99%和10.62%.研究结果表明:在三角褐指藻中,过表达甘油激酶基因可以促进中性油脂和金藻昆布多糖等生物活性物质的积累,这为通过基因工程的手段获得产油率高的转基因藻株提供了参考.     

光暗周期对3种海洋浮游硅藻胞外多糖生产的影响

3种海洋浮游硅藻,网纹三角藻(Triceratiumreticulum),骨条藻(Skeletonemasp.)和三角褐指藻(Phaeodacty lumtriconutum)培养在3种不同的光暗周期下,研究了光暗周期对硅藻胞外多糖生产的影响.结果表明,光暗周期对硅藻胞外多糖生产的影响具有种间特异性,且与细胞生长周期有关.网纹三角藻和三角褐指藻在长光照条件下(L/D:16/8h),胞外多糖含量较高,前者最大值出现在生长期前期,而后者则在生长期后期;骨条藻在短光照条件下(L/D:8/16h)胞外多糖含量较高,最大值出现在生长期后期.3种硅藻中,网纹三角藻的胞外多糖的产量最高,达103～104pg/cell,中肋骨条藻和三角褐指藻则较低.光暗周期可能影响了细胞内光吸收总量、细胞分裂模式及细胞内有机物质的合成,从而影响到胞外多糖的生产分泌.     

三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutm) 油脂富集培养的研究

探讨了营养盐铁、硅及植物激素脱落酸(ABA)单因子对三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的生长、油脂含量(%干重)及油脂产量的影响.采用光密度值OD450评价微藻的生长状况,以溶剂浸提法提取油脂.结果表明:(1)铁处理组中,铁浓度在0～46.57 μmol/L范围内时,藻的生长速率随铁浓度提高而增大;铁浓度为11.64 μmol/L时,油脂含量达30%,高于其它铁浓度培养;当铁浓度为11.64 μmol/L时,油脂产量最高--是无铁培养的2.8倍;(2)硅处理组中,低含量硅盐(4.6 μmol/L)不仅促进了藻的生长而且提高了油脂含量,油脂产量比高含量硅盐(42.6 μmol/L)培养提高了40%;(3)ABA处理组中,1 mg/L ABA不仅促进了藻的生长而且提高了油脂含量,油脂产量比对照提高了50%;5 mg/L ABA虽提高了油脂含量但却抑制了藻的生长,油脂产量和对照相当;15 mg/L ABA抑制了藻的生长、降低了油脂含量.用气相色谱分析微藻的脂肪酸组成,结果显示:1 mg/L ABA明显影响了三角褐指藻的脂肪酸组成,以高产量油脂(4.6 μmol/L硅盐、1 mg/L ABA培养)为原料制备出的生物柴油的质量将会提高.     

超声波对三角褐指藻脂肪酸组成的效应研究

研究了超声波对三角褐指藻脂肪酸组成的影响,在三角褐指藻整个生长期中每隔１２ｈ对其培养液进行超声辐射,结果表明,在较短超声作用时间下不饱和脂肪酸,占总脂肪酸的百分比有明显的增加,尤其是Ｃ１８：３百分含量得到大幅度的提高。     

海洋硅藻三角褐指藻生长及光合作用对阳光UV辐射的响应

以海洋硅藻三角褐指藻为研究对象,将其置于全波段阳光辐射(PAB,280-700 nm)、阳光辐射滤除UV-B(PA,320-700 nm)以及光合有效辐射PAR(P,400-700 nm)3种辐射处理下进行培养,以探讨阳光UVR对其生长及光合作用的影响.研究发现,在低PAR条件下(日辐射剂量小于1.34 MJ/m2时),UVR的存在对三角褐指藻的生长表现促进作用;而随着辐射剂量的增加,UVR对生长的抑制效应突显.在73.6 w/m2 UV-A及2.24 W/m2UV-B辐射水平下,三角褐指藻PSⅡ的有效光化学效率下降为P处理下的24%,碳酸酐酶活性被完全抑制,其光合固碳速率被抑制84%,表明高辐射水平下UVR显著抑制三角褐指藻的光合作用,从而导致生长速率降低.     

海洋硅藻三角褐指藻生长及光合作用对阳光UV辐射的响应

以海洋硅藻三角褐指藻为研究对象,将其置于全波段阳光辐射（PAB, 280—700nm）、阳光辐射滤除UV-B（PA, 320—700nm）以及光合有效辐射PAR （P, 400—700nm）3种辐射处理下进行培养,以探讨阳光UVR对其生长及光合作用的影响.研究发现,在低PAR条件下（日辐射剂量小于1.34MJ/m2时）,UVR的存在对三角褐指藻的生长表现促进作用;而随着辐射剂量的增加,UVR对生长的抑制效应突显.在73.6W/m2 UV-A及2.24W/m2 UV-B辐射水平下,三角褐指藻PSⅡ的有效光化学效率下降为P处理下的24%,碳酸酐酶活性被完全抑制,其光合固碳速率被抑制84%,表明高辐射水平下UVR显著抑制三角褐指藻的光合作用,从而导致生长速率降低．     

重金属Zn~(2+)2种暴露方式对三角褐指藻生长繁殖及光系统Ⅱ的影响

为探究重金属对海洋微藻的毒性胁迫效应,研究了重金属Zn~(2+)2种不同暴露方式下三角褐指藻种群生长状况、叶绿素a含量、光系统(PSII)的最大光能转化效率(Fv/Fm)以及相对光合电子传递率(rETR)的变化状况。采用2种暴露方式:一种暴露方式为0.5 mg/L低剂量连续5 d刺激三角褐指藻,旨在模拟自然水体低剂量暴露对微藻的影响,另一种参照三角褐指藻EC50浓度5 mg/L一次性刺激三角褐指藻。结果表明:2种暴露方式下,三角褐指藻生长、叶绿素a含量及rETR有显著性差异。当在5 mg/L重金属Zn~(2+)一次性刺激下,除Fv/Fm外,三角褐指藻的种群数量、叶绿素a含量及rETR均显著下降,随着暴露时间的不断增加,这些指标均在第4天后恢复增长;当在0.5 mg/L重金属Zn~(2+)持续5 d刺激下,除Fv/Fm外,三角褐指藻种群数量、叶绿素a含量以及r ETR指标均在出现先正常增长再降低的情况。     

原油水溶性组分对2种微藻的毒性效应及微藻对石油烃的降解研究初探

为探索石油水溶性成分(WAF)对海洋微藻的毒性效应及海洋微藻对其的降解,研究了96 h内不同浓度WAF暴露下2种海洋微藻的细胞密度、生长率及抑制率,并在实验完成时测定微藻培养液中WAF的剩余量。实验结果表明低浓度的WAF能促进2种微藻的生长,当WAF浓度大于2.90 mg/L时,小球藻的生长受到抑制,当WAF浓度大于6.97 mg/L时,三角褐指藻的生长受到抑制,且呈现明显的剂量-时间效应。相对于小球藻,三角褐指藻对高浓度WAF的耐受性较强,受到的抑制较轻。96 h时,2种微藻培养液中的WAF浓度均有显著降低,但三角褐指藻实验组中WAF浓度降幅较大,其可能的原因是三角褐指藻对WAF的耐受性较强,藻细胞密度较高,从而对WAF有较高的降解效率,因此可用于降解含有WAF的污染海水。     

三角褐指藻对不同形态铁的吸收和利用

分别向天然海水中添加不同浓度的FeCl_3、铁的乙二胺四乙酸络合物(Fe-EDTA)和铁的去铁胺络合物(FeDFO),对三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)进行培养,研究其对不同形态铁的吸收和利用.每天测定藻细胞密度及体系液相中和藻细胞内外的铁浓度.结果表明:不同浓度的FeCl3和Fe-EDTA均可促进三角褐指藻生长,不同浓度的Fe-DFO均会抑制其生长.FeCl_3培养体系中,铁主要分布在藻细胞外;Fe-EDTA和Fe-DFO的培养体系中,铁主要存在于液相中.液相铁浓度均随培养时间的增加而减少,细胞内外铁浓度均随培养时间的增加而增加.3种形态铁的三角褐指藻生物可利用性由高到低依次为FeCl_3Fe-EDTAFe-DFO.该结果可为海水中铁的生物可利用性研究提供参考.     

RNA干扰PEPC对三角褐指藻油脂含量的影响

本文应用生物信息学和RT-PCR方法分别获得了三角褐指藻两个PEPC全长cDNA,分别称为:PtPEPC1和PtPEPC2,前者完整开放阅读框3030bp,编码1009个氨基酸,后者完整开放阅读框2634bp,编码877个氨基酸;基于克隆所得PtPEPC的ORF构建了反向互补RNA干扰载体pPha-PtPEPC1RNAi和pPha-PtPEPC2RNAi,并用轰击法(PDS-1000/He)转化野生型三角褐指藻,筛选鉴定到了所需的阳性转基因藻;实时定量RT-PCR结果揭示:含PtPEPC RNA干扰结构的转基因藻的PEPCase基因的表达水平比野生型三角褐指藻该酶的表达水平有显著降低;野生型藻和转基因藻的油脂含量定量分析结果揭示:含RNAi干扰结构的转基因三角褐指藻油脂含量也明显高于野生型三角褐指藻,油脂增幅达2%~12%.