人工神经网络耦合遗传算法优化细菌纤维素发酵培养基

细菌纤维素作为新型生物材料,已成为生物材料研究热点,但产量低限制了其进一步应用。选择合适的优化策略是实现产量提高的一个重要方法。本文在正交和均匀设计实验传统建模方法的基础上,运用人工神经网络模型结合遗传算法优化汉氏葡糖醋杆菌(Komagataeibacter hansenii HDM1-3)产细菌纤维素发酵培养基。结果表明,最佳培养基配方为葡萄糖3.98%、牛肉膏0.34%、酵母膏0.19%、磷酸氢二钠0.22%、磷酸氢二钾0.46%、乙醇2.23%。在此配方下,细菌纤维素产量最高达到2.87 g·L~(-1),与优化前培养基的产量相比提高了1.18倍。本研究优化了细菌纤维素发酵培养基参数,为细菌纤维素高产发酵及工业化推广应用提供了依据。     

PadR对须糖多孢菌丁烯基多杀菌素生物合成及转运相关蛋白表达的影响

为研究padR基因表达对须糖多孢菌(Saccharopolyspora pogona)次级代谢产物生物合成及相关蛋白表达的影响,在对须糖多孢菌基因组测序结果的基础上,从基因组中克隆了padR基因上、下游同源臂,利用融合PCR将硫链丝菌素抗性基因插入上、下游同源臂之间,将融合片段与穿梭载体pOJ260连接,构建敲除载体pOJ260-UHA-tsr-DHA。通过接合转移将其导入野生型须糖多孢菌中,通过同源臂双交换获得须糖多孢菌敲除菌株S.pogona-ΔpadR。经HPLC检测分析,敲除菌株次级代谢产物丁烯基多杀菌素产量与原始菌株相比提高了27.3%,且有7个转运相关蛋白出现表达上调。这一研究表明padR基因的敲除能够有效促进须糖多孢菌丁烯基多杀菌素的生物合成。该研究对优化须糖多孢菌丁烯基多杀菌素的生物合成途径具有一定的指导意义,为研究padR基因表达在链霉菌次级代谢产物合成中的作用打下了基础。     

产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca) α-乙酰乳酸脱羧酶基因(BudA)的克隆及生物信息学分析

以Klebsiella oxytoca(K.oxytoca)HD79为出发菌株,根据α-乙酰乳酸脱羧酶基因序列相似的特点,利用Primer5.0设计一对引物,以K.oxytoca HD79为模板,PCR扩增,获得K.oxytoca HD79基因片段Bud A,此片段经测序显示长度为780 bp,无碱基缺失。利用生物信息学软件对该序列进行了同源性分析、氨基酸组成分析、疏水性分析、磷酸化位点预测、亚细胞定位分析及二、三级结构预测。结果表明,该片段为K.oxytoca HD79的α-乙酰乳酸脱羧酶基因序列。对该酶进行的生物信息学特异性分析为其构建产2,3-丁二醇的工程菌株提供一定的理论参考。     

λRed技术构建产酸克雷伯氏菌乙酸激酶基因缺失突变株

乙酸是2,3-丁二醇典型代谢途径中的主要副产物之一,并对2,3-丁二醇的代谢产生影响。乙酸激酶(acetate kinase,ack)是乙酸生成途径中的关键酶,敲除ack基因,理论上可以阻断乙酸的产生,从而提高2,3-丁二醇的产量和得率。本文利用λRed技术构建乙酸激酶基因敲除重组质粒p T-LKR,通过酶切、纯化获得线性片段ack L-Kanr-ackR,将其电转化至Klebisella oxytoca HD79中,卡那霉素抗性筛选阳性转化子。结果表明,经PCR及测序验证K.oxytoca HD79乙酸激酶缺失工程菌株构建成功,为后续进一步提高2,3-丁二醇的产量和扩大菌株选择范围奠定基础。     

中国正常人群中先天性代谢疾病相关基因的DNA变异位点分布频率的研究

为从整体层面研究我国正常人群先天性代谢缺陷DNA变异位点分布及频率,在88例中国正常人基因组DNA样本中,使用Haloplex序列捕获技术结合Illumina Miseq二代测序平台对10种先天性代谢缺陷的78个候选致病基因进行统一靶向测序,利用SureCall软件分析测序数据及质控;并用SIFT和Polyphen软件以及dbSNP数据库进行突变位点分析和功能预测;用SHEsis在线软件分析SNP/SNV的等位基因频率;此外用PyMOL对两个文献中尚未报道的位点进行蛋白结构功能分析。本实验共检出514个DNA变异位点,其中99个为错义变异。在这99个错义变异中,有2个是已报道的先天性代谢缺陷致病位点,且该位点在本研究人群中的分布频率高于亚洲数据库频率。本研究为中国人群先天性代谢缺陷的基因筛查提供了一定的理论依据。     

大熊猫粪便微生物多样性分析及纤维素降解产氢菌的筛选鉴定

利用宏基因组测序技术对大熊猫粪便微生物进行了多样性分析,发现大熊猫粪便样品中含有大量可以降解纤维素的厌氧微生物种类,如梭菌科、瘤胃菌科和毛螺菌科等,因此,将熊猫粪便样品作为降解纤维素微生物菌种分离的来源具有可行性。采用刚果红染色法从大熊猫粪便样品中筛选具有降解纤维素产氢能力的菌株,分离获得1株纤维素降解产氢菌株Cel10,根据菌株的形态和生理生化特征并结合分子生物学,鉴定菌株Cel10属于缓纤维梭菌(Clostridium lentocellum),其16S rDNA序列的同源性为98%。菌株Cel10在pH 4.0～8.0、温度25～50℃范围内可以利用纤维素进行生长,其最适pH 7.0,最适生长温度37℃。本文丰富了大熊猫肠道纤维素降解菌的种类,为木质纤维素类农产品加工废弃物的开发和综合利用提供了良好的菌种资源和科学依据。     

基于细胞色素P450单加氧酶介导的4-甲酚氧化降解途径的天麻素生物合成

为实现天麻素的微生物异源生产,将谷氨酸棒状杆菌中4-甲酚降解相关基因cre HIJEFD和药用植物红景天来源的尿苷二磷酸糖基转移酶基因ugt分别克隆至载体pRSFDuet-1和p ACYCDuet-1,转化大肠杆菌后获得重组菌株S1.在S1中诱导关键酶表达后,外源添加4-甲酚,生物转化后对产物进行定性和定量分析.最终以5mmol/L 4-甲酚为底物,重组菌株S1在30℃诱导培养48 h后转化产物中有天麻素生成,产量达到1.5 mmol/L,摩尔转化率为30.3%.本研究实现了从4-甲酚到天麻素的生物转化,可为芳烃化合物降解与天然药物分子生物合成相偶联提供新的思路,并且具有一定的产业化应用前景.     

反硝化细菌Y39-6的基因组及生理生化特征研究

菌株Y39-6是从哈尔滨周边地区地下水中分离的一株假单胞菌，具有异养反硝化和自养脱氮能力，由于假单胞菌属内的菌种鉴定存在复杂性，对菌株Y39-6的具体分类仍有争议。通过获得菌株Y39-6的全基因组序列，进行比较基因组学分析，分析了菌株的碳源利用和脂肪酸含量特征，对菌株的生理生化特征进行了系统研究。发现菌株Y39-6与模式菌Pseudomonas veronii CIP 104663T的基因组相似性更高，G+C的含量接近，共有基因数量最多，为368个，碳源利用特征相似，可以确定菌株Y39-6属于Pseudomonas veronii菌种。菌株Y39-6有15个特有基因，主要脂肪酸为C16∶0和C17∶0 cyclo,含量分别为22.05%和21.25%,与Pseudomonas veronii菌种的其他菌株相比，存在明显的特异性。通过以上研究，确定了菌株Y39-6的分类地位和生物学特征，为菌株Y39-6的进一步应用提供了生物学参考依据。     

戊型肝炎病毒ORF2片段在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定

为了寻求新型表达系统来研制戊型肝炎病毒基因工程疫苗，利用Pichia pastoris表达系统表达戊型肝炎病毒(HEV)结构区ORF2基因．利用PCR扩增HEV ORF2基因，然后将ORF2基因按正确的阅读框融合到Pichia postoris分泌型表达载体pPIC9K的a-因子信号肽编码序列3’端，重组表达载体在电击转化毕赤酵母，经过含G418的营养缺陷型培养基(RDB)筛选、重组酵母基因组总DNA进行PCR鉴定后，证实HEV ORF2基因已经整合到酵母基因组中并得到重组转化子．表型鉴定后对G418具有不抗性的重组菌株诱导表达，用双抗体夹心法ELISA筛选了表达外源蛋白的重组菌株，再经SDS-PAGE与Western blot证实ORF2基因在Pichia pastoris中实现了分泌表达，而且重组蛋白具有较强的特异性与生物学活性；同时用双抗体夹心法证实在Pichia pastoris表达的上清中存在衣壳蛋白聚体．     

中国常染色体显性遗传骨胳石化症(Ⅱ型)家系突变基因筛查研究初报

为寻找骨胳石化症Ⅱ的致病基因,从一患该病的家系成员收集血液,制备基因组DNA.应用PCR（聚合链式反应）技术和直接测序分析ClCN7的24个外显子,寻找基因变异.结果表明,除一些内含子中存在个别多态性外,所有成员均未检测到ClCN7基因突变,提示该基因不是本病常见的致病基因,在这个家系中ADOⅡ可能归因于其他基因的突变.     

中国常染色体显性遗传骨胳石化症(II型)家系突变基因筛查研究初报

为寻找骨胳石化症II的致病基因,从一患该病的家系成员收集血液,制备基因组DNA.应用PCR(聚合链式反应)技术和直接测序分析ClCN7的24个外显子,寻找基因变异.结果表明,除一些内含子中存在个别多态性外,所有成员均未检测到ClCN7基因突变,提示该基因不是本病常见的致病基因,在这个家系中ADOII可能归因于其他基因的突变.     

苏云金芽胞杆菌cry7Ab9基因的克隆与杀虫活性的测定

以辽宁省千山市的22株苏云金芽胞杆菌进行PCR cry型的cry7类基因鉴定,对cry7类基因进行克隆表达及生物活性测定,为cry基因储备奠定基础.菌株QZG121经比对后发现含有cry7Ab基因.克隆该基因全长序列为3 417 bp,编码1 138个氨基酸残基,相对分子质量为130 000,并在Gene Bank中登记,基因登录号为GU936713,由苏云金芽胞杆菌国际命名委员会正式命名为cry7Ab9.通过构建原核表达系统获得cry7Ab9基因表达蛋白,并进行暗黑鳃金龟幼虫杀虫活性的测定,7天校正死亡率10 mg.L-1为11.11%、100 mg.L-1为25.93%;两周校正死亡率10 mg.L-1为33.33%、100 mg.L-1为48.15%,LC50为289.99 mg.L-1.     

一株蜡样芽孢杆菌对麦麸降解作用的研究

通过测定发酵过程中发酵液的纤维素酶、半纤维素酶活、可溶性总糖和还原糖浓度以及底物残渣重、残渣结晶度、傅立叶红外光谱和表面结构的变化来研究蜡样芽孢杆菌(Bacillus sp.X10-1-2)对麦麸的降解作用。结果发现:菌体产酶的同时进行木质纤维素的降解和糖化,发酵液中纤维素酶和半纤维素酶的活性分别于菌株培养到第12h和48h达到最大,总糖和还原糖含量分别于4h和12h达到最高值,降解5d后麦麸的结晶度未发生明显变化。通过分析底物残渣的傅立叶红外光谱可知,此菌株对麦麸的降解以半纤维素为主。麦麸中木质纤维素的各主要成分纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为2.72%、25.61%和1.09%。利用扫描电镜观察麦麸降解5d后的残渣,可观察到,Bacillus sp.X10-1-2主要降解了底物内表面蜂巢结构的边缘骨架。     

麻疹病毒CC47疫苗测序分析及与其他A基因型病毒株比较

对长春-47(CC47)麻疹病毒减毒活疫苗即CC47疫苗进行测序分析,并与其他A基因型病毒株进行了比较。通过RT-PCR法扩增了6个编码基因,用双脱氧链终止法对产物进行自动测序。对结果进行比较分析发现,CC47疫苗有13个特有的氨基酸改变分别位于N,P和L蛋白,可以看做是该疫苗株的"疫苗标签"。通过构建系统发生树,分析了11株麻疹病毒的亲缘关系。本研究完善了CC47疫苗基因组信息,提供了对麻疹流行进行监测和对病毒减毒基因学基础进行进一步研究的潜在目标。     

紫杆柽柳谷胱甘肽硫转移酶基因的烟草转化

将所克隆的紫杆柽柳谷胱甘肽硫转移酶基因(TaGST)构建成植物表达载体pBI-TaGST,通过农杆菌介导法将其转入烟草W38(Nicotiana tabacum cv.W38),获得了转基因的烟草植株.转基因植株的PCR和RT-PCR检测表明,该目的基因已经整合到烟草基因组上.     

3个拟南芥紫色酸性磷酸酶基因的cDNA克隆及体外表达

根据拟南芥基因组测序结果，用RT-PCR的方法，克隆到3个可能的紫色酸性磷酸酶cDNA的序列(At-PAP20，AtPAP21，AtPAP22)，半定量PCR的结果表明，3个PAPs在细胞中都是组成型表达的,把PAPs的0RF分别与荧光蛋白基因序列和组氨酸标签融合，并在昆虫细胞表达系统中得到表达，荧光信号分布在细胞质中，显示这3个基因的产物在细胞质中发挥作用。     

嗜热硫氧化硫化杆菌一新菌株的分离与鉴定

从云南腾冲酸性热泉富集物中分离到一株适度嗜热喜酸菌YN22.该菌革兰氏染色阳性,直杆状或微弯,长约1.6~2.8μm,直径0.4~0.7μm.该菌能在25~60℃下生长,最适生长温度为53℃;生长pH为1.0~5.0,最适pH为1.5;化能自养型,0.025%(w/V)的酵母提取物对其生长有明显的促进作用,在酵母提取物存在的情况下能快速氧化Fe2 ,但对S0和还原型硫化物的氧化能力较低.16s rDNA系统发育分析表明,该菌与嗜热硫氧化硫化杆菌(Sulfobacillus thermosulfidooxidans)的16s rDNA序列相似性达99%.YN22基因组DNA的G C含量为47.3 mol%,与嗜热硫氧化硫化杆菌模式菌株VKM B-1 269非常接近,后者基因组DNA的G C含量为47.5 mol%.基于形态特征、生理生化特性、系统发育学和G C含量的分析结果,YN22应归于硫化杆菌属(Sulfobacillus),为嗜热硫氧化硫化杆菌(Sb.thermosulfidooxidans)的一新菌株.这是国内首次分离,并经多种方法鉴定、确认的嗜热硫氧化硫化杆菌,从而为我国浸矿微生物的基础和应用研究提供了最典型的适度嗜热菌种.     

东北红豆杉紫杉二烯合成酶cDNA克隆及其与紫杉醇产生菌基因组DNA的Southern杂交(英文)

为进一步研究紫杉二烯合成酶的作用机理和紫杉醇生物合成代谢调控机制,采用RT-PCR技术从东北红豆杉(Taxus cuspidata)树叶中获得了紫杉二烯合成酶基因片段,将该片段克隆在载体pGEMT-easy vector上,并转化到E.coliJM109中,经EcoRI酶切鉴定后,对阳性克隆进行序列测定,获得紫杉二烯合成酶基因片段长度为909 bp,编码303个氨基酸,与GenBank中收录的紫杉二烯合成酶的同源性达到98%;对获得的紫杉二烯合成酶基因和紫杉醇产生菌HQD33基因组DNA进行了Southern杂交。结果初步证实了紫杉二烯合成酶存在于通过内生真菌发酵生产紫杉醇的生物合成途径中。为利用分子生物学手段研究通过内生真菌发酵生产紫杉醇生物合成的代谢调控和构建高产紫杉醇基因工程菌株提供了强有力的理论指导。     

基于转录组鉴定鼓槌石斛花温度胁迫响应基因

为研究鼓槌石斛花在温度胁迫应答方面的基因表达差异，对其在低温和高温胁迫下进行Illumina技术转录组测序．结果表明，组装获得321 734个单基因，其中141 464个基因在Nr,COG等4个数据库中获得注释．低温和高温胁迫分别识别了3 830,10 430个应答基因．在应答基因中，发现多个CBL,CBF和热激蛋白等基因成员．鼓槌石斛花低温胁迫应答可能与“损伤应答”“细胞外区”“血红素结合”等多个过程有关；高温胁迫应答可能与“缺水应答”“核”“ATP结合”等多个过程有关．这些差异基因为解析鼓槌石斛非生物胁迫应答机制提供帮助．