益气养阴活血配伍对缺血心肌差异基因表达的影响

本研究在既往建立的大鼠缺血心肌基因差异表达谱基础上, 探讨了益气养阴、活血及其配伍中药对缺血心肌差异基因表达影响及可能的作用机制. 采用冠状动脉左前降支结扎法制备大鼠AMI模型, 造模后将大鼠随机分为5组: 模型组、美插洛尔组、益气养阴组、活血组和益气养阴活血组, 并设正常组和假手术组, 假手术组只穿线不结扎, 术后24 h给予正常组和假手术组等体积生理盐水, 给予其他各组相应药物灌胃. 第8天截取心肌缺血区组织, 光学显微镜观察病理形态, 分别应用荧光定量PCR及化学比色法检测目标基因mRNA表达水平和翻译蛋白酶活性. 结果显示, 模型组HE染色可见心肌组织缺血区心肌肿胀、炎细胞浸润和细胞溶解, 各用药组病理改变较模型组均明显较轻, 益气养阴组、活血组能量代谢相关基因细胞色素C氧化酶5a (Cox5a)和ATP合酶5e (ATP5e)基因表达量和酶活性均出现了下调趋势, 而益气养阴活血配伍组Cox5a, ATP5e对应的蛋白酶活性显著下降(P < 0.05). 这表明能量代谢作用通路相关基因的异常表达是引起AMI心肌损伤的重要分子机制之一, 益气养阴活血配伍中药影响COX5a, ATP5e等能量相关功能基因的表达是其抗心肌缺血的可能机制, 较单纯益气养阴、活血效果理想.     

冠心病差异基因表达谱的构建及目标基因的功能分析

选择经冠脉造影证实的冠心病患者16例和健康对照者8例, 抽提RNA, 筛选冠心病相关差异基因, 构建冠心病差异基因表达谱, 并使用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)对目标基因进行鉴定. 另按原标准筛选冠心病患者30例和健康对照者40例, 验证目标基因IL-8的临床相关性. 在此基础上, 以12例健康自愿者为对象, 研究IL-8对血小板聚集率、血小板活化和血小板聚集形态学的影响. 结果表明, 冠心病相关的差异基因共有107个, 其中分子功能和生物学途径涉及炎症免疫反应的有14个(13.1%); 通路显著性分析发现, 冠心病相关有意义通路共15个, 其中有4个涉及炎症免疫反应. 目标基因鉴定结果与基因芯片检测结果一致. 冠心病患者血清IL-8水平(83.21 ± 34.33 pg/mL)显著高于健康对照者(63.34 ± 36.36 pg/mL) (P < 0.05). 血小板聚集率、血小板活化和血小板聚集形态学结果显示, IL-8具有诱导血小板活化的作用. 本文从核酸水平揭示了冠心病与炎症免疫反应的相关性, 目标基因IL-8可能通过影响血小板的活化程度而参与了冠心病的发病过程.     

基于玛氏骨条藻(Skeletonema marinoi)转录组的碳固定代谢途径分析

以玛氏骨条藻(Skeletonema marinoi)转录组信息为基础,分析了其碳固定代谢途径,共发现18种酶对应的34个编码基因,构建了玛氏骨条藻进行碳固定代谢途径的通路图.这些编码基因的序列比对结果表明,其与假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)的同源基因具有较高的一致性.对这些样品进行数字基因表达谱的差异基因分析,获得了不同生长时期碳固定代谢途径酶编码基因的差异表达情况.通过分析发现,C3和C4代谢途径中存在表达差异的基因分别有7和3个,其中果糖-1,6-二磷酸酶和丙酮酸磷酸双激酶的编码基因表达在指数生长期之后出现显著上调.这有助于对玛氏骨条藻碳固定代谢途径中关键编码基因调控过程的解析,为进一步研究硅藻的固碳机制奠定了基础,也为深入了解碳的生物地球化循环提供了新的研究方向.     

生物信息学研究揭示乳腺癌组织分化中可能的microRNA调控通路

microRNA (miRNA)被广泛报道能参与乳腺癌的病理发生发展过程. 但是, 在这些病理过程中, miRNA通过哪些信号通路来参与这些过程还不甚清楚. 例如, 在乳腺癌的组织学分级分化过程中, 人们对于miRNA如何与其靶标基因相互作用来调控乳腺癌的分化还知之甚少. 本研究通过计算的方法研究miRNA在乳腺癌组织学分级分化过程中的作用. 通过寻找miRNA靶标基因集合在基因芯片数据中乳腺癌Ⅰ级和Ⅲ级间显著差异表达, 鉴定了15个候选miRNAs, 其中9个关键的miRNAs通过调控差异表达的靶基因来参与6个重要的信号转导通路. 在这些通路中, TGF-β信号通路中一个主要的抑制分子SMAD7蛋白被预测为上面几个关键miRNAs的靶标基因. SMAD7既能被miRNA直接调控又能被miRNA调控的信号通路调控, 进而影响TGF-β信号通路在乳腺癌组织分化中的作用. 因此, 我们推测TGF-β信号通路作为一个核心通路在miRNA调控乳腺癌的组织分化过程中起重要作用. 预测靶标基因在乳腺癌Ⅰ级和Ⅲ级的分类性能在另外3个独立的乳腺癌数据集上得到进一步验证. 3个预测差异表达的关键miRNAs也通过实时荧光定量PCR在10个不同组织分级的乳腺癌病人样本中得到验证.     

胡萝卜根特异表达水通道蛋白基因DcRB7的分离及其启动子功能分析

从胡萝卜胚cDNA文库中分离得到一条完整的cDNA片段, 序列分析表明属于水通道家族新成员, 并与烟草根特异性表达TobRB7基因高度同源, 因此命名为DcRB7. Northern杂交分析表明DcRB7在根中特异性表达. 利用反向PCR技术, 分离获得了DcRB7基因上游约650 bp的片段. 将此片段与含有GUS报告基因表达载体进行重组构建后, 以农杆菌介导转化烟草获得相应的转基因植株. 在对转基因烟草的GUS表达特性进行了组织化学鉴定和荧光定量分析后发现, 该调控区段能指导GUS基因在烟草根中优势表达, 并表现出干旱诱导的特性.     

水稻光温敏核不育系培矮64S在不同光周期/温度下表达谱的变化

用含3328 个基因的cDNA 阵列分析了水稻光温敏核不育系培矮64S 于长日照/高温及短日照/低温下幼穗的基因表达谱特征. 统计数据表明, 以短日照/低温(花粉可育)为参比, 长日照/高温(花粉不育) 下表达丰度显著变化的基因高达14.60%, 482 个基因下调表达, 仅4 个基因上调表达. 以实时荧光定量PCR 技术对所有上调表达基因和随机选择的9 个下调表达基因进行了检测, 各基因表达丰度的变化趋势一致, 验证了cDNA 阵列杂交结果的可靠性. 这些差异表达基因几乎涉及所有的细胞生物学反应, 但MAPK 同系物MMK1 和MMK2 在mRNA 水平表现出截然不同的基因表达特征, 大量参与信号传导的信号分子的表达丰度也发生明显变化. 可以推测, 花粉形态建成及相应的生理功能所需要的程序性转录调控受严重干扰可能是MAPK 信号传导途径发生显著改变所导致.     

急性低氧胁迫下海月水母HIF-1α基因的表达

许多研究表明,水母能够耐受低氧环境,但是并不清楚其生理与分子机制.本研究根据海月水母转录组测序结果,获得了海月水母低氧诱导因子(HIF)的部分基因序列,利用实时荧光定量PCR方法检测海月水母HIF基因在低氧条件下(溶解氧约为0.5 mg L-1)的表达变化情况.结果表明,在低氧条件下,海月水母幼体HIF-1α的基因相对表达量经过一定时间的培养后显著高于对照组;以管蛋白基因为内参基因,HIF-1α基因相对表达量在培养3,6,12,18,48和72 h时分别为参照组(饱和溶解氧)的83.2%,102.4%,122.8%,301.3%,140.3%和150.7%.表明低氧环境中海月水母HIF基因表达量在转录水平有极为显著的增加,这为从分子水平揭示水母耐受低氧环境的机制提供了新的视点.     

胡萝卜根特异表达水通道蛋白基因DcRB7的分离

从胡萝卜胚cDNA文库中分离得到一条完整的cDNA片段, 序列分析表明属于水通道家族新成员, 并与烟草根特异性表达TobRB7基因高度同源, 因此命名为DcRB7. Northern杂交分析表明DcRB7在根中特异性表达. 利用反向PCR技术, 分离获得了DcRB7基因上游约650 bp的片段. 将此片段与含有GUS报告基因表达载体进行重组构建后, 以农杆菌介导转化烟草获得相应的转基因植株. 在对转基因烟草的GUS表达特性进行了组织化学鉴定和荧光定量分析后发现, 该调控区段能指导GUS基因在烟草根中优势表达, 并表现出干旱诱导的特性.     

调控水稻异倍性杂交种子败育的相关基因分析

MADS29是控制水稻(Oryza sativa L.)种子饱满程度的基因,它通过调控母体组织细胞退化和维持体内激素平衡来影响种子发育.水稻异倍性杂交往往产生败育种子,为了探讨MADS29等种子发育相关基因是否参与其调控,本研究以4份水稻材料(2个二倍体;2个四倍体)构建4个自交组合(对照)和8个杂交组合(正反交),对花粉粒育性、花粉管萌发及伸长、种子发育及MADS29等相关基因表达进行分析.结果表明:(1)异倍性杂交均可正常受精,但杂交种子败育;(2)石蜡切片结果显示,授粉后3 d(3 day after pollination,3 DAP),与对照相比,4n×2n胚乳已进入细胞化时期,但细胞数量较少;而2n×4n胚乳处于合胞体时期,游离核周围未形成细胞壁,胚乳细胞化时期滞后;(3)实时荧光定量PCR(q RT-PCR)表明,6 DAP和8 DAP,MADS29、生长素基因和母体组织细胞程序化死亡(PCD)相关基因的相对表达量在杂交种子中均明显高于对照;淀粉合成基因在杂交种子中的相对表达量显著低于对照.本实验结果表明,在水稻异倍性杂交中,MADS29高表达,生长素基因和母体组织PCD相关基因表达上调,淀粉合成相关基因表达下调,导致胚乳发育异常、种子败育,说明MADS29的高表达导致异倍性杂交种子败育,是一种有别于二倍体水稻种子发育的新型调控方式.     

水稻低磷胁迫基因表达谱分析

磷是植物生长发育所需的大量营养元素之一, 当周围环境中磷缺乏时, 植物往往通过扩大根系范围来增加对土壤中磷的吸收, 同时调节一些生化代谢途径, 增加磷酸酶、有机酸等物质的分泌从而活化土壤中固定的难溶性磷. 本研究利用水稻全基因组寡核苷酸芯片对水稻中早18分别在正常营养条件和低磷胁迫处理条件下6, 24, 72 h 3个时间点的根部和地上部材料进行基因表达谱分析. 研究结果共鉴定出低磷胁迫差异表达基因1207个, 其中根部差异表达基因795个, 地上部差异表达基因450个, 根部和地上部共同出现的差异表达基因38个. 功能分析表明, 这些差异表达基因包括了代谢调节离子转运、信号传导、转录调节、和逆境应答等方面的基因. 同时发现水稻在低磷胁迫后大量转座子基因在转录水平上发生了变化. 这些研究结果为进一步揭示植物磷代谢调控机理的研究提供了有用的信息.     

棉花纤维发育和体细胞胚发生过程中实时定量PCR内对照基因的筛选

实时定量PCR技术(qRT-PCR)能够快速地对多个样品进行基因表达分析, 因此已成为芯片和微点阵数据验证的常用手段. 为了得到更精确的数据, 通常需要一个和多个内对照基因来平衡化qRT- PCR数据. 目前一般选择持家基因(housekeeping gene)作为内对照, 但很多持家基因的表达水平随着环境的改变而改变. 在棉花纤维发育和体细胞胚发生机制研究过程中已经产生大量芯片和微点阵数据, 但目前在采用实时定量PCR验证这些数据时都只用了一个持家基因来平衡化数据. 为了验证其可靠性, 本研究根据常用的持家基因(18S rRNA, Histone3, UBQ7, Actin, Cyclophilin, Gbpolyubiquitin-1和Gbpolyubiquitin-2)设计了7对引物, 用相对的绝对定量法验证了在棉花不同组织和不同发育阶段(21个样品)表达水平的稳定性, 发现在纤维发育的后期(17 DPA (day post anthesis)以后), 这些基因的表达都下调, 而纤维发育后期特异表达基因AGP的表达从15 DPA开始到27 DPA一直都呈上升趋势. 因此对于纤维系列特别是纤维发育后期基因的qRT-PCR更好的选择是相对的绝对定量. 而对于非纤维系列, 这些持家基因的表达水平相对纤维系列变化幅度较小, 但为了得到更精确的表达数据, 应该同时用Histone3, UBQ7和Gbpolyubiquitin-1一起来平衡化qRT-PCR数据.     

人视网膜发育相关基因表达谱分析

视网膜是视觉的基础, 结构十分精细复杂, 视网膜的功能完全依赖于视网膜的结构. 鉴于目前人们对视网膜发生的调控基因和机理了解很少, 利用含16361个基因的芯片分别检测了12~16周、22~26周胎儿及20~40岁成人视网膜中基因的表达水平, 发现814个基因在1或2个时间点表达水平相差3倍以上, 其中表达强度值在1个以上的时间点超过100的差异表达基因共106个, 依次是发育、分化、信号传导、蛋白质合成翻译、代谢、DNA合成修复重组等相关基因. 基因表达模式和聚类分析揭示随视网膜发育成熟呈下调趋势的基因最多, 而呈上调趋势的基因较少. 在上述106个差异表达基因中, 有46个目前在美国国立卫生院(NIH)眼科研究所(NEI)的视网膜cDNA或EST数据库中尚找不到, 它们在视网膜中的作用和功能也不清楚. 为了进一步确定基因芯片结果的可靠性, 采用荧光定量 RT-PCR和常规RT-PCR检测分析了上述46个差异表达基因及另外6个已知的视网膜特异表达基因的表达量, 其中27个基因的表达谱与芯片检测结果完全一致. 另外, 还采用原位杂交技术检测了NNAT基因在视网膜内的表达量及表达产物的细胞和亚细胞分布. 此外, 对106个差异表达基因的染色体定位进行检索揭示, 其中1个基因位于已知的视网膜锥体或锥-杆体营养不良基因位点处, 并与该病的发病有关. 此结果为阐明视网膜发育的调控机理、为视网膜疾病候选基因的确定提供了实验证据.     

福辛普利钠预处理对缺血后适应大鼠心肌组织Toll样受体表达及炎症因子的影响

大鼠预先灌胃福辛普利钠, 观察其和缺血后适应(ischemic postconditioning, IPoC)对大鼠心肌缺血再灌注(ischemic reperfusion, I/R)损伤后心肌组织Toll样受体(toll-like receptor, TLR)表达及心肌组织炎症浸润的影响. 将60只SD (Spragu-Dawley)大鼠随机分为假手术组、I/R组、IPoC组以及福辛普利钠+IPoC组, 每组15只. 假手术组大鼠心脏前降支下置线不结扎; I/R组予以心脏前降支结扎30 min, 再灌注1 h; IPoC组给予心脏前降支结扎30 min, 后予以3次10 s的再灌注/缺血循环, 再持续灌注1 h; 福辛普利钠+IPoC组则预先给予福辛普利钠片0.9 mg/kg, 连续灌胃14 d, 于末次灌胃2 h后, 施以IPoC组的干预过程. 所有实验大鼠腹主动脉取血并分离出心脏组织. 比色法测定血清肌钙蛋白T (cardiac troponin T, cTNT)的含量, NBT染色测定大鼠左室心肌梗死面积, 酶联免疫吸附测定法测定心肌组织单核细胞趋化蛋白-1 (monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)和肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)水平. 免疫组织化学方法测定心肌组织TLR2及TLR4的表达, HE染色观察心肌组织炎性细胞的浸润. 结果表明, 与I/R组比较, IPoC组大鼠心肌梗死面积明显缩小(P<0.01), 大鼠血清cTNT水平显著降低(P<0.01), 心肌组织MCP-1, TNF-α含量和炎性细胞浸润数量明显下降(P<0.05, P<0.01), 心肌组织TLR2及TLR4的表达被显著抑制(P<0.01); 与IPoC组比较, 福辛普利钠预处理可进一步降低IPoC大鼠心肌梗死面积(P<0.05), 心肌组织TNF-?水平也显著降低(P<0.01), 对心肌TLR2及TLR4的表达有进一步抑制(P<0.05). 血管紧张素转化酶抑制剂福辛普利钠预处理可加强IPoC对I/R大鼠心肌的保护作用, 其机理可能与抑制TLR介导的炎症信号通路和趋化因子反应有关.     

人视神经瘤和胶质瘤细胞系的睫状神经营养因子表达和克隆

睫状神经营养因子(Ciliary neurotrophic factor,CNTF)是第一个被发现可促进离体和在体运动神经元存活、对神经系统正常发育和受损神经的再生修复有重要作用的神经因子,主要存在于星形胶质细胞和施旺细胞.人CNTF基因定位于11号染色体长臂的近例端,其基因结构不与神经营养素家族同源也不含信号肽.我们发现大鼠坐骨神经再生过程中CNTF的基因表达下调,提示它的表达量与损伤后胶质细胞的增殖未必匹配.国外已重组了人CNTF,国内尚未见报道.由于我们没有人系统神经的cDNA文库,故用大鼠CNTFcDNA探针来检测人视神经胶质细胞瘤和人脑胶质母细胞瘤细胞系中是否有人CNTF的表达,再用反转录PCR克隆出人CNTF cDNA,目的是获得重组的人CNTF蛋白.     

基于分子信标对肿瘤细胞ING1转录水平调控的定量检测

利用分子信标检测技术, 结合建立的ING1分子信标/cRNA杂交标准曲线, 定量检测了药物处理, 基因转染和p53 RNA干扰(RNAi)等对肿瘤细胞ING1 mRNA表达水平的影响. 结果发现: 在低表达ING1的肿瘤细胞系MCF-7中, 5-FU处理和ING1基因稳定转染均能诱导细胞中ING1 mRNA表达水平升高; 在ING1表达水平正常的CNE2肿瘤细胞中, 利用RNAi 沉默p53表达引起ING1 mRNA表达水平降低. 这些细胞中ING1 mRNA表达水平在7.7×10^-16~53.4×10^-16 mol/mg总RNA. 该方法不仅能从转录水平上为基因表达调控效果提供定量依据, 而且有望用于信号通路途径中多基因转录水平的相互调节研究.     

肌肉电针介导VEGF基因治疗大鼠闭塞性血管病

应用电针介导血管内皮生长因子 (VEGF)基因治疗实验性外周血管闭塞症大鼠 ,以RT PCR及免疫组化方法观察VEGF基因的表达 ,通过血管造影技术观察VEGF基因导入大鼠体内后的生物效应 .结果显示 ,电针介导VEGF基因可在大鼠肌肉组织高效表达VEGF ,并可促进局部组织新生血管形成和侧枝循环建立 ,使血流恢复 ,为闭塞性血管病的基因治疗提供一种新的基因转移方法 .     

22周孕龄人胎肝表达序列标签数据更新与初步分析

随着国际上转录组数据及本室22周孕龄人胎肝表达序列标签数据的不断增加, 先前该组织表达谱的研究有必要进行更新与完善. 本研究首先将22周孕龄人胎肝每一表达序列标签与自身数据库, UniGene, DoTS, MGC以及Twinscan预测的人类转录组数据库进行比对以归类. 然后, 经过电子拼接和基因鉴定, 对已知基因进行GO (gene ontology)分类, 对未知基因进行Pfam和ScanProsite功能预测. 最后, 对人胎肝、成人肝、骨髓、胸腺及淋巴结这些拥有造血作用或可表明人胎肝特性的5种组织进行了层次聚类分析. 结果表明: (ⅰ) 与5种最新人类转录组数据库比对, 极大地降低了那些属于一个基因但互不交叠的序列被划分到不同簇的可能性, 因此在进行EST归类时, 推荐与互联网上有关最新数据进行比对; (ⅱ) 一些先前未知EST已被鉴定为已知基因, 1379个EST被鉴定为本室独有的全新序列; (ⅲ) 通过GO分类, 对22周孕龄人胎肝有了一个大致了解, 同时获得了6个细胞迁移基因和6个造血相关基因; (ⅳ) 通过基因功能预测获得了277个模体(profile), 其中有5个类型可分布于10个以上基因之中; (ⅴ) 层次聚类表明, 5种组织关系与它们的功能相一致; (ⅵ) 建立了世界上最大的22周孕龄人胎肝表达序列标签数据库. 总之, 22周孕龄人胎肝表达序列标签数据的更新与初步分析将有助于对人胎肝造血机制及细胞迁移机制的了解, 可促进未来对该组织进行全面深入的研究.     

粳稻云引稻瘟病抗性近等基因系与免疫应答相关的LRR-RLKs差异基因分析

在广谱抗稻瘟病品种云引与普感稻瘟病品种丽江新团黑谷(Lijiangxintuanheigu, LTH)构建的近等基因系抗、感病子代基因组重测序的差异基因中,从与免疫应答(immune response)相关的分类单元里得到8个基因序列有差异的基因.它们都为编码富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶基因,并聚集于11号染色体的邻近位置,且与已知的白叶枯病抗性基因Xa21具有一定同源性.为进一步探究这些类受体蛋白激酶类基因在稻瘟病抗性中可能发挥的功能,我们分析了这些基因的结构、进化及抗感子代间的序列差异类型,同时还分别采用离体和喷雾接菌的方式对云引和LTH进行稻瘟病接种并取样.通过实时荧光定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR)发现,部分基因能受到稻瘟病菌的诱导,推测它们可能在水稻对抗稻瘟病病菌中发挥一定作用,为进一步挖掘稻瘟病相关抗性基因奠定基础.     

As2O3诱导人食管鳞状上皮癌EC8712细胞基因表达概况分析

用AtlasTM人cDNA表达分析方法分析了As2O3对食管鳞状上皮癌EC8712细胞的基因表达的影响效应. 结果多数癌基因经As2O3诱导后表现为降调节,多数肿瘤抑制基因则表现为升调节,细胞周期调控蛋白、细胞内信号通路中促进细胞分裂的受体和因子、多个凋亡相关基因及凋亡的效应因子的表达发生改变. 因此,As2O3对食管鳞状上皮癌EC8712细胞的效应是广泛的,引起多种类型基因表达改变.     

HSP70保护培养的心肌细胞耐受缺氧损伤

遭受短时间缺血、缺氧和热休克等预处理(Preconditioning,PC)的组织细胞对随后的再次缺血、缺氧和高热损伤的耐受能力增强,此时细胞内热休克蛋白(Heat shock proteins,HSPs)基因表达增加,而其它基因表达产物减少,但HSPs是否具有直接的细胞保护作用及其作用机制目前尚有争议.本工作利用人工生物膜磷脂脂质体作为HSP载体,将HSP70输送到培养的大鼠心肌细胞内,观察其对心肌细胞缺氧损伤的影响,探讨HSPs直接的细胞保护作用及其机制.