冠状病毒

冠状病毒在系统分类上属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus).新发现的SARS病毒属冠状病毒的一个新种.科学家对SARS病毒基因组进行了全面测序分析后发现,其基因组由29730个碱基组成,与已知的三类冠状病毒相差甚远,只有64%的序列相同.可以推测,SARS病毒不是已知病毒的近期变种,而是一种新的冠状病毒.     

SARS-CoV蛋白质组的生物信息学及其进化关系

一种新的冠状病毒 SARS-CoV是引起严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)的病原体. 对由SARS病毒全基因组序列推导出的所有蛋白质逐一进行分子量、等电点、分子消光系数等物理化学性质计算, 以及跨膜区和亚细胞定位预测, 辅以保守序列家族数据库搜索, 预测SARS-CoV功能未知蛋白质的功能. 同时, 通过SARS-CoV与其他冠状病毒蛋白质同源序列比较和进化距离计算, 分析SARS病毒的分类地位以及与其他冠状病毒的进化关系. 结果表明, 尽管SARS病毒是不同于其他3组冠状病毒的一种全新冠状病毒, 但在进化关系上更靠近牛冠状病毒BoCoV和鼠肝炎病毒MHV. 为实验测定SARS病毒蛋白质组以及抗SARS疫苗研制提供了参考和帮助.     

SARS相关病毒与鼠肝炎病毒S蛋白的同源暗示一个潜在受体结合区的存在

最近, 一种新的冠状病毒被确定为近期爆发的严重急性呼吸综合征(SARS)的病原体. 虽然人们对人冠状病毒229E已经有了较多的研究, 而且其受体结合位点也被确定在S蛋白第417~547个氨基酸残基之间. 但是, 这一区域与新分离的SARS相关病毒(香港株, CUHK-W1)没有任何同源性. 有意思的是, 已知的各种冠状病毒S蛋白S1亚基的序列比对和进化分析显示, 鼠肝炎病毒(MHV)与SARS相关病毒的同源性最高. 而且, MHV的S蛋白上负责受体结合的重要位点(第62~65和第214~216位氨基酸残基)与SARS相关病毒的相应区域(第51~54和第195~197位氨基酸残基)高度同源. 这些生物信息学的分析结果可能对研究SARS相关病毒的受体结合位点和病毒侵染靶细胞的机理有所帮助, 进而为设计抗病毒药物和疫苗提供新靶点.     

赛葵黄脉病毒: 一种含有卫星DNA的双生病毒新种

从云南红河地区表现黄脉症状的杂草——赛葵上分离到病毒分离物Y47. 对Y47进行DNA-A的全序列测定, 结果表明, Y47 DNA-A全长2731个核苷酸, 基因组具有典型的双生病毒科病毒特征, 即编码6个ORFs, 其中病毒链编码AV1(CP)和AV2共2个ORFs, 互补链编码AC1~4共4个ORFs. 对基因组进一步比较发现, Y47 DNA-A与秋葵黄脉花叶病毒分离物201(GenBank登录号: AJ002451)的同源性最高, 达77%, 而与其他双生病毒的同源性均在76%以下, 表明Y47是双生病毒的一个新种, 命名为赛葵黄脉病毒(MYVV). 利用DNAβ的特异性引物beta01和beta02, 从Y47中扩增到卫星DNA分子(Y47β). 序列分析表明, Y47β全长1348个核苷酸, 至少在其互补链上编码一个有功能的ORF(C1). Y47β的全序列与Multan棉花曲叶病毒和Rajasthan棉花曲叶病毒的DNAβ的核苷酸同源性最高, 为62%~67%, 而与其他已报道的DNAβ的同源性均低于46%. 系统关系树分析表明, 卫星DNAβ分子与其辅助病毒是共同进化的.     

呼肠病毒, 在SARS患者中分离与初步鉴定

严重急性呼吸综合征(SARS)疫情在北京造成了严重后果, 冠状病毒已被广泛认定为导致SARS的病原体. 但是临床和实验提示, SARS病因可能不是单一冠状病毒感染. 本文报道了我们从北京市第1例SARS患者和其母亲的咽拭子中分离出呼肠病毒. 在电子显微镜下, 可观察到典型的呼肠病毒. 血清学实验显示, 38例SARS患者中24例对呼肠病毒呈阳性反应. 针对呼肠病毒的基因保守序列(S2基因片段)设计引物, RT-PCR实验扩增出特异性DNA片段. 进一步DNA序列分析表明是一种独特的呼肠病毒(呼肠病毒科正呼肠病毒属). 初步动物实验显示, 该呼肠病毒可导致非典型样肺炎发生和小鼠死亡. 尽管如此, 呼肠病毒感染是否与SARS疫情有关, 还有待进一步研究才能阐明.     

SARS冠状病毒S基因的最近共同祖先序列重建及Spike蛋白的适应性进化检测

严重急性呼吸系统综合症(severe acute respiratory syndrome，SARS)病原体——SARS冠状病毒(SARS-CoV)的基因组结构和表达模式已被详细描述。Spike蛋白作为冠状病毒粒子表面的结构性糖蛋白，负责结合宿主细胞受体，诱导病毒包膜和细胞膜的融合，刺激机体产生中和抗体并与介导细胞     

与烟草曲叶病毒伴随的新型DNA分子鉴定

根据已报道的两种粉虱传双生病毒DNAβ分子的保守序列设计引物，利用PCR技术从烟草曲叶病毒Y5和Y8分离物扩增到一类环状DNAβ分子，其全长分别为1333和1338nt，序列分析表明，Y5DNAβ可能编码8个可读框（ORFs），病毒链和互补链各含有4个ORFs；Y8DNAβ可编码7个ORFs，病毒链含有4个ORFs，互补链含有3个ORFs，除茎环结构TAATATTAC外，DNAβ与烟草曲叶病毒Y5和Y8基因组DNA－A序列几乎无同源性，Y5和Y8的DNAβ全长核苷酸序列同源性较高，为85％，而与已报道的胜红蓟黄脉病毒（AYVV）DNAβ及棉花曲叶病毒（CLCuV）的两个DNAβ的同源性为51％－65％，免疫捕获PCR及粉虱传毒实验表明，DNAβ分子包裹在双生病毒粒子中，并伴随病毒由烟粉虱传播。     

鸡传染性支气管炎冠状病毒北京分离株全基因组序列的测定及其特征分析

鸟类传染性支气管炎病毒(AIBV)属于冠病毒科, 冠状病毒属, 是单股线状、正链RNA病毒, 基因组全长近28 kb, 具有3′多聚A尾和5′帽子结构的特征. 采用PCR产物克隆测序和引物步移(primer walking)直接测序结合的方法, 完成了IBV北京分离株的全基因组序列的测定. 该毒株基因组序列全长为27733 bp, 生物信息学分析表明, 它具有10个明显的可读框(ORF); 通过基因定位后其基因排序为: 5′-orf1a-orf1ab-s-3a-3b-e-m-6a-6b-n-3′. 对IBV北京分离株的全基因组序列, 与报道的IBV及造成人类严重急性呼吸综合征(SARS)的病毒(SARS-CoV)进行了比较分析. 结果表明, AIBV是一种变异较大的病毒, 其全基因组序列与国外公布的AIBV全基因组序列相似性仅有85.2%, 与国内报道的不完整AIBV序列比较, 相似性也只有91.2%; 而与SARS病毒基因组全序列比较, 相似性仅为50.8%, 说明它与SARS-CoV关系不大. 同时, 还使用clustalw 1.81 和 Treeview软件构建了冠状病毒的全序列、S蛋白、M蛋白和N蛋白的系统发生树, 结果表明, 鸡IBV北京分离株是第3组病毒的惟一成员, 它与SARS-CoV存在很大的遗传距离. 这项研究将对我国鸡传染性支气管炎病原的鉴定和疾病的控制起到重要的作用.     

Vero细胞培养传代后的2株SARS冠状病毒基因组序列变异分析

RNA病毒在复制时有易出错的倾向, 因此SARS病毒在传染或传代过程中易发生突变而产生不同的毒株, 这种机制也利于病毒逃脱宿主的免疫系统而生存下来. 许多研究也表明, 不同的SARS病毒分离株的全基因组序列存在不同程度的差异, 这些差异的研究无疑对SARS病毒疫苗的研制具有重要的指导意义. 同时, 对SARS病毒在传代过程中的遗传稳定性及核酸特性的分析, 是SARS疫苗研制不可或缺的环节. 采用PCR产物直接测序的方法, 对2株用Vero细胞培养经过多次传代的SARS病毒进行了全基因组序列的测定, 通过比较分析发现该病毒在传代过程中具有高遗传稳定性, 其中检定参比株(Sino1株)2和11代全基因组序列比较有4个碱基的变化, 而候选疫苗株(Sino3株)3与10代的基因组全序列仅有1个碱基的差异. SARS病毒在Vero细胞上传代的遗传稳定性表明, 以此制备的灭活病毒疫苗是稳定的.     

猪瘟病毒基因组非编码区的定性、定量与结构分析

猪瘟病毒是猪瘟的病原体，弄清其基因组的复制与表达是研究猪瘟致病机理、研制抗病毒药物的核心，基因组的非编码区（UTR）是复制和表达的主要调节区，为了确定复制与表达位点在非编码区的具体位置以及主要特征，对猪瘟病毒石门株以及其他毒株基因组的3′和5′非编码区进行了生物信息学的定性、定量与结构分析，分别得到17个毒株的3′UTR和56个毒株的5′UTR与调节复制、表达起始有关的位点以及共有的保守序列和结构成分，这些顺式调控元件可能是复制起始识别位点、宿主细胞转录因子的结合位点和核糖体起始蛋白质合成的作用位点，据此，对猪瘟病毒复制与表达的机理进行了探讨，为进一步实验提供了非常明确的方向，同时也为与猪瘟病毒同科的丙型肝炎病毒、其他瘟病毒以及其他正链RNA病毒基因组复制的研究奠定了基础。     

从烟草上分离的中国番茄黄化曲叶病毒及其卫星DNA的全基因组结构特征

从我国云南省红河地区表现曲叶症状的烟草上分离到病毒分离物Y8, Y36和Y38. 用14种针对双生病毒粒子的单克隆抗体进行三抗体夹心ELISA测定, 结果表明, 病毒分离物Y8, Y36和Y38的抗原表位型与中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)相似. 对Y8, Y36和Y38基因组DNA-A全序列进行了分析, 其全长分别为2727, 2730和2730个核苷酸, 均编码6个ORFs, 其中病毒链编码AV₁(CP)和AV₂两个ORFs, 互补链编码AC₁~AC₄四个ORFs. DNA-A全序列、基因间隔区核苷酸序列及各ORF编码的氨基酸序列比较分析表明, Y8, Y36和Y38均属于TYLCCNV. 从病株Y8, Y36和Y38中还分离到一类卫星DNA分子(DNAb), 全长分别为1338, 1339和1338个核苷酸. 3个DNAb分子的核苷酸全序列的同源性为98%~99%, 且互补链上均含有编码126个氨基酸的C1 ORF.     

基于全基因组比较的SARS冠状病毒种系进化分析

SARS(severe acute respiratory syndrome)冠状病毒已被世界卫生组织确认为SARS传染病的病原体, 它的全基因组测序工作分别由中国、加拿大、美国等国的研究小组完成. 然而它的起源仍是一个谜. 为了探寻SARS冠状病毒的来源, 基于FDOD(function of degree of disagreement)方法, 对12个SARS冠状病毒分离株和12种以往发现的冠状病毒进行了全基因组比较, 构造出种系进化无根树. 结果表明, 这两类病毒(分别由12个SARS冠状病毒分离株和12种以往发现的冠状病毒构成)虽然都来自冠状病毒属, 但它们位于两个不同的进化分支上. 冠状病毒属中的3个组被准确地重构. 根据得到的结果, 推测SARS冠状病毒更类似于第一组中的冠状病毒. 根据种系进化树的拓扑结构和各SARS冠状病毒分离株与造成香港Metropole饭店疫情的SARS冠状病毒株之间的联系, 推测各SARS冠状病毒分离株分别位于进化树上两个大的分支, 这为SARS的流行病学研究提供了辅助信息.     

棉疫病菌诱导非寄主过敏反应激发子基因的克隆

采用功能筛选策略从以PVX病毒载体建立的棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae) cDNA文库中克隆了能诱导烟草产生过敏反应的激发子基因(片段). 以农杆菌Mog101为宿主、利用PVX病毒表达载体构建了含有6800个单克隆的棉疫病菌cDNA文库, 采用牙签接种本氏烟(Nicotiana benthamiana), 从4100个克隆中筛选到12个能引起烟草过敏反应的阳性克隆. 对上述阳性克隆进行序列测定和分析, 结果显示, 其中7个与已知的基因具有较高的同源性, 其中PBC43编码一个特异的elicitin蛋白; PBC163编码一个Rab蛋白, 与大豆疫霉的RAB同源性较高; PBC241编码抗增殖蛋白(prohibitin); PBN62编码一个热激蛋白60 (HSP60). 还有5个克隆在公共数据库中没有同源基因, 提示可能是该病原菌特异的激发子基因. 上述结果表明, 利用病毒表达载体构建cDNA文库, 用功能筛选策略可从棉疫病菌全基因组范围内筛选诱导烟草产生过敏反应的激发子基因, 该方法可望为其他植物病原菌激发子基因的克隆提供技术平台.     

用于SARS冠状病毒检测的60 mer寡核苷酸基因芯片的设计及应用

设计并应用60 mer寡核苷酸基因芯片实现对SARS冠状病毒的检测. 根据寡核苷酸基因芯片的原则设计出30条60 mer的寡核苷酸片段, 覆盖SARS冠状病毒(以最先提交全序列的TOR2株作为参考, GenBank登录号: AY274119)全基因组, 点样制备成12×12的寡核苷酸基因芯片, 从临床诊断SARS患者痰液标本抽提病毒RNA, 采用限制性显示技术进行标记, 将标记好的样品与芯片杂交, 洗脱, 扫描. 初步探索寡核苷酸芯片诊断SARS冠状病毒的可行性. 杂交结果表明, 来自SARS患者样品与芯片上的多个SARS探针杂交, 出现了明显的荧光信号; 阴性和空白对照探针上没有杂交信号, 而对照样品仅与3个SARS探针有杂交. 由此可知, 采用60 mer寡核苷酸基因芯片可以从基因水平实现对SARS冠状病毒多段序列的平行检测, 对于提高检出率有一定意义, 此外, 尚可用于监测在发病过程的各个阶段中病毒基因的活动状况.     

福氏2a志贺氏菌301株基因组水平的缺失基因分析

在完成福氏2a志贺氏菌 301株全基因组序列测定工作的基础上, 以非致病性大肠杆菌K12 MG1655株的全基因组序列为参比对象, 进行比较基因组学分析. 结果显示, 与大肠杆菌基因组相比, 福氏2a志贺氏菌 301株基因组中共有136个长度大于1000 bp的片段缺失, 总长为717253 bp. 这些缺失片段中共包含670个可读框(ORF). 通过对ORFs编码产物的功能预测和分析, 发现这些缺失的ORFs主要编码与细菌代谢相关的酶类、结构蛋白、基因转录调控因子以及与细菌遗传物质水平转移相关的元件. 这不仅从全基因组水平揭示了两种具有不同生物学特性和表型的重要肠道细菌的分子差异, 而且为进一步探索其生理活动过程、致病机制以及肠道细菌间的进化等诸方面的问题提供了有价值的线索.     

鸡痘病毒282 E4株基因组7.3kb Bam HⅠ片段的序列测定与分析

对经亚克隆后的鸡痘病毒(fowlpoxvirus,FPV)282E4株7.3kb BamHⅠ片段 ,用ABI377DNA测序仪荧光标记法进行了序列测定 ,并应用DNAsis软件同GenBank中已知的FPV序列和痘苗病毒 (vacciniavirus,VV)Copenhagen株的全序列进行了同源性比较 ,发现与鸡痘病毒MunichHP 438株11.2kbBamHⅠ片段的序列同源 .此外 ,对所测序列的开放读码框架 (openreadingframes,ORFs)所编码的氨基酸序列同上述VV株中所有ORF的氨基酸序列进行了同源性比较 ,并对各ORF编码蛋白的信号肽、跨膜区的存在与否进行了分析.     

冠状病毒和人类SARS病毒的分子亲缘关系研究

组分矢量方法是一种从全基因组出发, 研究物种亲缘关系的新方法. 本文使用这一方法, 通过对外类群的适当选取, 研究包括SARS病毒的冠状病毒进化关系. SARS病毒作为一个单系, 由于彼此之间的序列相似程度非常高, 难以为其选取适当的外类群. 我们利用核苷酸的突变计数来构造距离矩阵, 并将其超度规化, 在此基础上揭示SARS病毒自身的演变关系. 本文采用了更多的序列和新的方法, 反映了更为详细的冠状病毒进化关系, 使得不同方法的比较成为可能, 为冠状病毒进化关系的研究提供了新的视角.     

水稻条纹叶枯病毒基因组含vRNA2 ORF片段的克隆、序列分析及其在原核中的表达

<正>水稻条纹叶枯病毒(rice stripe virus,RSV)是柔丝病毒组的典型代表,其基因组由4种ss-RNA及相应低含量的4种dsRNA组成,其中,RNA1为负链性质,编码RNA多聚酶;RNA2～4均为双义编码性质(ambisense-coding strategy)。为研究该病毒RNA非编码区等调控元件在病毒基因组双义表达过程中的功能,采用反转录-聚合酶链式反应方法(RT-PCR),扩增出覆盖RSV RNA2 5′末端非编码区、vRNA2OrFT区、基因间非编码区及vcRNA2 ORF部分区域的REPI片段(1 159bp)。将此扩增产物克隆于载体pGEM-7Zf(+)的Sma Ⅰ位点上并进行了核苷酸序列测定。     

水稻条纹叶枯病毒基因组含vRNA_2 ORF片段的克隆、序列分析及其在原核中的表达

水稻条纹叶枯病毒(rice stripe virus,RSV)是柔丝病毒组的典型代表,其基因组由4种ss-RNA及相应低含量的4种dsRNA组成,其中,RNA1为负链性质,编码RNA多聚酶;RNA2～4均为双义编码性质(ambisense-coding strategy)。为研究该病毒RNA非编码区等调控元件在病毒基因组双义表达过程中的功能,采用反转录-聚合酶链式反应方法(RT-PCR),扩增出覆盖RSV RNA2 5′末端非编码区、vRNA2OrFT区、基因间非编码区及vcRNA2 ORF部分区域的REPI片段(1 159bp)。将此扩增产物克隆于载体pGEM-7Zf( )的Sma Ⅰ位点上并进行了核苷酸序列测定。结果表明,中国分离物与日本分离物的REPI片段具极高的序列同源性。将REPI片段克隆到原核高效表达载体pJW2的P_RP_L启动子下游,经温度诱导,获得了高效     

片段的序列测定与分析

对经亚克隆后的鸡痘病毒 (fowlpoxvirus,FPV) 2 82E4株 7.3kbBamHⅠ片段 ,用ABI377DNA测序仪荧光标记法进行了序列测定 ,并应用DNAsis软件同GenBank中已知的FPV序列和痘苗病毒 (vacciniavirus,VV)Copenhagen株的全序列进行了同源性比较 ,发现与鸡痘病毒MunichHP 438株 1 1 .2kbBamHⅠ片段的序列同源 .此外 ,对所测序列的开放读码框架 (openreadingframes,ORFs)所编码的氨基酸序列同上述VV株中所有ORF的氨基酸序列进行了同源性比较 ,并对各ORF编码蛋白的信号肽、跨膜区的存在与否进行了分析