水稻咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因(CCoAOMT)表达特性分析

咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)是木质素生物合成途径中的关键酶. 从水稻(Oryza sativa L ssp japonica)中分离了CCoAOMT基因家族的3个成员OsCOA1, OsCOA20和OsCOA26. 序列分析表明, OsCOA1基因由4个外显子和3个内含子组成, OsCOA20和OsCOA26则具有3个外显子和2个内含子. 这3个基因与其他植物同类CCoAOMT氨基酸同源性较高, 达75.43%, 并具有CCoAOMT基因特有的保守序列元件. 系统进化树分析表明, OsCOA1与玉米中CCoAOMT具有较近的亲源关系, OsCOA20和OsCOA26则属于另一分支. Northern印迹和组织原位杂交结果显示, 3个基因的mRNA在水稻的各组织均有积累, 在幼叶的厚壁组织和维管束大量表达, 说明该基因家族的3个成员与水稻的木质化进程关系密切.     

STK11 基因在Peutz-Jeghers综合征家系中的突变分析

黑斑息肉综合征（Peutz-Jeghers syndrome，PJS）是一种常染色体显性遗传性疾病。最近，在19p13.3克隆出了PJS致病基因STK11(丝氨酸苏氨酸激酶)。为了进一步研究中国人PJS患者STK11基因的突变情况，应用变性高效液相色谱（DHPLC）和DNA测序方法，对3个多代PJS和3个散发性PJS家系中15例患者和20例正常成员的STK11基因的9个外显子进行了分析，在6个家系中共发现10个由碱基替代导致的点突变。有7个突变可使基因产物发生改变，包括1个无义突变、5个错义突变和1个移码点突变。分别发生在STK11基因的第37（CAG→TAG），123（CAG→CAT），161(ATT→AGT)，194（GAC→GAG）,245(CTC→TTC)和354位密码子（TTC→TTG）及第4内含子3′末端煎接位点部位（AG→AA）。在3个散发PJS家系中，有1个家系的患者，在第5外显子内存在错义突变，其余2个家系的患者，在内含子1（ 36）和内含子3（-51）均存在点突变。研究还发现，有3个多态位点，分别发生在内含子1（ 36），内含子3（-5）和内含子5（ 27）部位。以上结果表明，在PJS患者中存在较高频率STK11基因点突变，突变位点可分散在整个编码区。两代以上发病的家系突变频率较散发病例突变率高，提示STK11基因的改变与PJS的发病密切相关。     

酵母线粒体细胞色素b基因突变的定位和内含子的功能

酵母线粒体DNA(mt-DNA)的细胞色素b(cob)基因是由6个编码区(外显子)和5个非编码区(间隔顺序或内含子)组成的镶嵌结构。长约6.5kb,但成熟的mRNA只有2.1kb,包括全部6个外显子而无内含子。间隔顺序不仅是真核基因的普遍特点,最近发现,原核基因也有内含子。其功能容易被忽视,因此研究内含子的功能具有普遍意义。许多研究者指出,cob基因的内含子突变,不仅使酵母失去了表达细胞色素b的能力,细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ基因(OXi 3)也不能转录。这种既影响cob基因,又影响OXi 3     

水稻OsEBP-89基因部分转录本中第1内含子的滞留

OsEBP-89基因是水稻中一个转录因子编码基因。该基因含有两个内含子，采用RT－PCR和Southern杂交等方法的检测结果表明，在OsEBP-89基因的部分转录本中，115bp长的第1内含子未被剪接。从水稻cDNA文库也筛选到了仍然保护有第1内含子的OsEBP-89基因的cDNA克隆。OsEBP-89基因第1内含子不完全剪接的转录本与正常成熟转录本的比例在水稻不同组织中是不同的。这是真核基因中内含子滞留的一个新的例子。     

BRCAA1基因克隆、染色体定位与特征性分析

本介绍了一个克隆新的乳腺癌相关抗原基因BRCAAl．它定位于lq^42．1-q^43，它的基因组长度为93．857kb，包含18个外显子与17个内含子．它编码的蛋白由1214个氨基酸组成，相对分子质量为136．8kd，包括10个糖基化位点，含有一个Rb结合蛋白1的抗原表位IKPSLGSKK，潜在的抗原表位可能位于580～620，640-700氨基酸位点之间．它可能是Rb结合蛋白1家族的成员，可能具有调节细胞增殖的功能．     

山羊β-酪蛋白基因启动区指导人血清白蛋白在转基因小鼠乳汁中的高效表达

构建了包含山羊β-酪蛋白基因启动区5′端上游调控序列和外显子1, 2及内含子1在内的乳腺表达载体, 并与人血清白蛋白(hALB)小基因(含全长cDNA序列及其内含子1)构建成融合基因. 鼠尾静脉注射实验表明, 该融合基因能在小鼠乳腺中特异表达. 应用显微注射方法将该融合基因导入小鼠受精卵, 并将受精卵移植于假孕母鼠, 共获得33只F0代小鼠, 经PCR和Southern印迹杂交证实, 有8只小鼠(5♀, 3 ♂ )基因组中整合有hALB基因, 整合率为24.2%(8/33). Western blot分析表明, 在5只雌性整合小鼠中有3只表达了hALB蛋白, 放射免疫法测定其乳汁中hALB含量分别为3.54, 0.21和3.03 g/L.     

代谢型谷氨酸受体mGluR7的基因组结构及其家族蛋白胞外区的基因组结构比较

L－谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统中的神经递质，其代谢型丙氨酸受体mGluR7在正常中枢神经功能和多种神经退行性疾病的病理发生中起着重要作用。为了研究mGluR7基因相关疾病的生物和遗传基础，通过从BAC文库中筛选种子克隆和对酶切指纹图谱数据库查询等方法，构建了 覆盖mGluR7全长基因的基因组物理图谱，并采用鸟枪法策略对图中BAC克隆进行测序与拼接组装，最终得到准确度为万分之一的完整的基因组序列。序列分析表明：mGluR7基因是长达880kb的超大基因；其基因组GC含量为38％，重复序列含量为37．5％，由11个外显子和10个内含子组成，其中5个内含子长度超过100kb，内含子1长达285kb； 存在2个替换剪接转录本mGluR7α和mGluR7b。通过比较mGluR7基因家族3组8个亚型受体蛋白胞外区的基因组结构，发现它们对应的基因组结构分为3组，组内各成员的基因组结构较为保守，而组间各成员的基因组结构保守性较差，这种基因组水平的组内保守和组间差异是和蛋白质水平上的保守和差异一致的，提示这些受体的基本功能在进化的过程中有明显的分化。在含mGluR7的组内，尽管组内各成员的基因组结构趋于保守，但大部分含子长度变化幅度很大，揭示基因组结构变化的程度高于蛋白质水平的变化，这种变化预期是在基因表达的调控上体现其生物属性的。     

一个水稻P450 CYP72A基因簇受病原菌诱导和发育及组织特异性表达

细胞色素P450超基因家族广泛参与植物的各类生命活动,包括植物对病原菌的防卫反应.我们在植物病原菌诱导基因的DD-PCR分析时,分离到一个受病原菌侵染诱导的水稻cDNA片段.水稻基因组公布后,发现该片段位于1个包含7个P450 CYP72A基因(CYP72A17～23)的基因簇的保守部分.以此片段搜索水稻数据库发现,水稻CYP72A家族有14个成员,这14个蛋白质之间的差异主要在N端,C端则同源性很高.我们分别对该基因簇的7个成员进行了表达特性分析,发现其中CYP72A18,19,22和23的表达受稻瘟病菌侵染的调节,而且在抗、感植株中的表达存在明显差异.除CYP72A20外,其余6个CYP72A基因均具有发育和组织特异性表达的特征.CYP72A20在所有研究中均检测不到信号,可能为一个假基因.这些发现为水稻P450基因功能的研究提供了新的资料.     

水稻三角颖突变体tri1的遗传分析与基因克隆

籽粒形状与大小是影响水稻产量和品质的重要因素. 本研究在经⁶⁰Co-γ射线辐射粳稻品种台北309的后代中分离获得一个三角颖突变体tri1(triangular hull 1). 与野生型相比, tri1籽粒颖壳呈三角形, 粒厚增加, 蛋白质含量升高, 株高和千粒重降低. 遗传分析表明, 该突变性状能稳定遗传, 受一对隐性核基因控制. 采用图位克隆法将目的基因精细定位于水稻第1染色体长臂上分子标记CHR0122与CH0127之间, 物理距离约47 kb, 并与分子标记CHR0119共分离. 在该区域内共有6个候选基因, 测序分析表明tri1突变体中一个释义基因OsMADS32的第3外显子内缺失了一个碱基A, 导致移码突变和翻译提前终止; RT-PCR分析表明, OsMADS32主要在水稻幼穗中表达, 在根、茎、叶和发育的种子等组织中的表达量极低, 说明OsMADS32基因与花的发育与关. 据此, 推测OsMADS32基因可能为TRI1的候选基因.     

代谢型谷氨酸受体mGluR7的基因组结构及其家族蛋白胞外区的基因组结构比较

L-谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统中的神经递质, 其代谢型谷氨酸受体mGluR7在正常中枢神经功能和多种神经退行性疾病的病理发生中起着重要作用. 为了研究mGluR7基因相关疾病的生物和遗传基础, 通过从BAC文库中筛选种子克隆和对酶切指纹图谱数据库查询等方法, 构建了覆盖mGluR7全长基因的基因组物理图谱, 并采用鸟枪法策略对图中BAC克隆进行测序与拼接组装, 最终得到准确度为万分之一的完整的基因组序列. 序列分析表明: mGluR7基因是长达880 kb的超大基因; 其基因组GC含量为38%, 重复序列含量为37.5%; 由11个外显子和10个内含子组成, 其中5个内含子长度超过100 kb, 内含子1长达285 kb; 存在2个替换剪接转录本mGluR7a和mGluR7b. 通过比较mGluR基因家族3组8个亚型受体蛋白胞外区的基因组结构, 发现它们对应的基因组结构分为3组, 组内各成员的基因组结构较为保守, 而组间各成员的基因组结构保守性较差. 这种基因组水平的组内保守和组间差异是和蛋白质水平上的保守和差异一致的, 提示这些受体的基本功能在进化的过程中有明显的分化. 在含mGluR7的组内, 尽管组内各成员的基因组结构趋于保守, 但大部分内含子长度变化幅度很大, 揭示基因组结构变化的程度高于蛋白质水平的变化, 这种变化预期是在基因表达的调控上体现其生物属性的.     

水稻肉桂酰辅酶A还原酶基因的克隆与表达分析

用现有的OsCCR 基因片段筛选水稻核DNA文库, 获得了长为3045 bp的核DNA. 它包含4个内含子和5 个外显子, 推测的可读框长为337个氨基酸. OsCCR与其他植物中同类酶在氨基酸水平上有70%的相似性和30%的相同性, 含有保守的辅酶Ⅱ(NADP)结合位点及可能为该酶催化位点的特征序列. Northern杂交证实, 该基因产物广泛存在于水稻根、茎和叶等各组织中, 在茎中表达量较高. 组织原位杂交结果表明, OsCCR 基因在维管束及新生侧根中有强烈的表达信号, 与该基因编码的酶的木质素合成特性相吻合. OsCCR 基因的克隆、组织定位及生物化学方面的研究将有助于深入了解木质素形成的分子机理, 并为通过遗传工程的手段改善植物的机械性能以获得低木质素纸浆原料打下基础.     

茎瘤芥胞质雄性不育性与线粒体T基因选择性剪接有关

本研究从茎瘤芥胞质雄性不育（cytoplasmic male sterile, CMS）系线粒体cDNA中扩增获得了CMS相关T基因的两个不同转录本，分别命名为T1170和T1243．序列分析表明其中T1243是一个保留了内含子的转录本，该内含子具备Ⅱ型内含子基本特征．这两个转录本是T基因选择性剪接的产物．RT-PCR分析表明，在苗期，T基因转录水平的表达以T1170转录本为主；随着发育时期变化，该转录本表达逐渐减少，而另一个转录本T1243表达丰度增加；到盛花期，该基因的表达以后者为主．Northern杂交验证了这一结果．推断茎瘤芥胞质雄性不育性和T基因转录后选择性剪接有关．     

抑制COM与CCoAOMT调控植物木质素的生物合成

咖啡酸－3－O－甲基转移酶（COMT）与咖啡酰辅酶A－3－O－甲基转移酶（CCoAOMT）基因分别编码植物木质素生物合成中不同底物水平的甲基化酶，构建了它们的单价与双价反义表达载体，并用农杆菌介导转化烟草。PCR－Southern检测表明外源基因已整合到烟草基因组DNA中；Northern点杂交结果表明外源基因在烟草中以转录水平表达。对表达单个及两个甲基化反义基因的成熟转基因植株的木质素含量测定结果表明，反义抑制COMT与CCoAOMT的表达均使转基因植株的木质素含量下降，但单独抑制CCoAOMT表达引起的下降幅度明显大于COMT，并且两个基因同时被抑制时，降低幅度更大，说明它们具有协同效应，组织化学染色结果表明COMT被抑制引起紫丁香基（S）木质素显著减少。上述结果表明，抑制植物内源CCoAOMT表达是反向调控转基因植物木质素生物合成及改良造纸资源植物的有效途径。     

水稻基因组中R类抗病基因同源序列的分离

应用聚合酶链式反应 (PCR)方法 ,我们从水稻中分离到 6种不同的与植物抗病基因 (R)同源的序列 .通过亲缘关系分析 ,将 6个序列分为两个亲缘关系组 .第一组含有一种序列 ,即Osh359- 1.该序列与其他水稻R基因的同源序列相比更接近于其他植物的R基因 ,并具有简单的基因组结构 .第二组包含其余的 5种水稻序列 ,其代表性序列为Osh359- 3.这组序列属于多基因家族 ,并且其成员在水稻基因组中紧密连锁 .     

水稻油体钙蛋白家族的进化及对干旱胁迫的响应性分析

油体钙蛋白不仅参与了油体的形成, 而且可能与植物耐受干旱胁迫有关. 目前对水稻中的油体钙蛋白的功能了解很少. 本文通过对水稻基因组数据库的序列搜索, 确定了水稻油体钙蛋白基因家族的6 个成员. 通过对这些基因的序列、结构和染色体位置分析, 表明水稻油体钙蛋白基因家族的扩增可能与片段复制和串联重复有关. 通过对这些基因与其他物种中的油体钙蛋白基因的系统进化分析及功能比较分析, 揭示了拟南芥和水稻中功能可能对应的成员. 为了确定与干旱胁迫响应相关的油体钙蛋白基因, 通过荧光定量PCR 检测了水稻油体钙蛋白家族在根、叶、花中的表达, 以及在这些组织中响应干旱胁迫的表达情况, 发现有3个基因成员在不同组织中受干旱胁迫的诱导, 为进一步对它们展开功能分析奠定了基础.     

水稻紫色种皮基因Pb的精细定位与候选基因分析

紫米因其种皮内花色素苷的沉积而着色．控制种皮着色的Pb基因位于水稻第4染色体，紫色种皮对白色种皮呈显性．本研究利用培矮64S（白米）×豫南黑籼糯（紫米）和培矮64S×川黑糯（紫米）两个F2分离群体对P易基因进行了精细定位．首先用SSR标记将P易基因初步定位在距微卫星位点RM3820下游0．79cM的位置．然后，通过在候选区域内发展高密度的InDel标记和CAPS标记，将P6基因限定在两个InDel标记RID3与RID4之间25kb范围以内．在该区段内，TIGR水稻基因组（R．5）标有两个注释基因：一个为与玉米k基因同源的砌，为控制花色素苷代谢的Myc类转录因子；另一个为与拟南芥刀四同源的bhlh16，也与植物色素代谢有关．根据两者的性质和前人相关研究结果，推测Pb与Ra实为同一个基因．序列分析结果表明，与白米品种培矮64S，9311（籼）和日本晴（粳）相比，豫南黑籼糯和川黑糯中Ra基因第7外显子存在一个GT缺失．根据GT缺失发展了一个CAPS标记CAPSRa，并对两个F2分离群体和100余份水稻品种进行分析．结果发现，所有F2白米单株以及所有白米（n=63）和红米（n=23）品种的CAPSRa基因型与培矮64S相同，而所有紫米品种（n=20）与豫南黑籼糯和川黑糯相同．据此推测，水稻紫色种皮性状可能由Ra基因第7外显子内的GT缺失引起．     

基于内含子和外显子的系统发育分析的比较

在灵长目动物中分离出７个断裂基因的内含子和外显子序列，分别进行系统发育分析，比较结果显示：（１）基于内含子与基于外显子所得到的进化树的拓扑结构基本一致，但由于内含子和外显子序列的突变速率不同，导致进化树的分枝长度不同；（２）在ｈｏｍｉｎｏｉｄｓ中，外显子的替代速率下降，而内含子的替代速率相对稳定；（３）当选用ｃｅｂｕｓ作为参考物种时，基于不同外显子推测出的ｏｒａｎｇｕｔａｎ的分歧时间相差较大，而基     

水稻卷叶突变体基因shallot like1-Fuhui673鉴定、克隆与序列分析

叶片是水稻进行光合作用的重要器官,其形态直接影响光合作用的强弱.叶片适度卷曲可以使叶片保持直立,改善群体内部透光状况,提高光能利用率,进而提高水稻产量.本研究通过Co60-γ辐照诱变杂交水稻恢复系福恢673,获得一个卷叶突变体,命名为sll1-fh673(shallot-like1 from Fuhui673).经遗传学分析表明,该突变体sll1-fh673卷叶性状受1对隐性基因控制,结合混合群体(BSA)和隐性群体(RCA)分离分析法,将该基因ssl1-fh673精细定位于水稻第9染色体的inD el标记Ri9-20与Ri9-7之间52 kb的区域内.测序结果表明,sll1-fh673(LOC_Os09g23200)的核苷酸序列在第1个外显子第447 bp处由C替换为A,447 bp后缺失5个碱基,导致编码的氨基酸序列从第148位起发生改变并移码,造成蛋白功能异常.因此,推测sll1-fh673是SLL1的新等位基因,该新等位基因的挖掘丰富了SLL1基因的等位资源,有助于深入研究叶片卷曲的形成机理.     

抑制COMT与CCoAOMT调控植物木质素的生物合成

咖啡酸-3-O-甲基转移酶（COMT）与咖啡酰辅酶A-3-O-甲基转移酶（CCoAOMT）基因分别编码植物木质素生物合成中不同底物水平的甲基化酶,构建了它们的单价与双价反义表达载体,并用农杆茵介导转化烟草.PCR-Southern检测表明外源基因已整合到烟草基因组DNA中;Northern点杂交结果表明外源基因在烟草中以转录水平表达.对表达单个及两个甲基化酶反义基因的成熟转基因植株的木质素含量测定结果表明,反义抑制COMT与CCoAOMT的表达均使转基因植株的木质素含量下降,但单独抑制CCoAOMT表达引起的下降幅度明显大于COMT,并且两个基因同时被抑制时,降低幅度更大,说明它们具有协同效应.组织化学染色结果说明COMT被抑制引起紫丁香基（S）木质素显著减少.上述结果表明,抑制植物内源CCoAOMT表达是反向调控转基因植物木质素生物合成及改良造纸资源植物的有效途径.     

水稻花药发育相关基因OsPRP1的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻颖花中克隆了一个编码富含脯氨酸残基多肽的cDNA, 并将其相应的基因命名为OsPRP1. OsPRP1由2个外显子和1内含子组成, 编码的蛋白由224个氨基酸残基组成, 其中脯氨酸含量最高, 占14.29%. 该蛋白由一个21个氨基酸残基组成的信号肽, 一个N-端结构域和一个C-端结构域组成. C-端含有2个18个氨基酸长的、嵌合PEPK基元(motif)的富含脯氨酸的重复序列. Southern blot及序列分析结果表明, 水稻基因组中存在4个拷贝的OsPRP1, 它们定位在第10染色体的20 kb的DNA片段上. RT-PCR表明, OsPRP1在幼芽和颖花中表达量较高, 在根和叶中有少量表达. 用花和幼芽进行原位杂交分析证明在花中, OsPRP1在花粉母细胞、绒毡层细胞和花器官的维管束细胞中表达; 该基因的表达有明显的时间特异性, 在花粉母细胞中表达量最高, 在单核期的小孢子中几乎不表达; 在芽中, 该基因在胚芽鞘和叶原基的表皮细胞中表达. 从该基因编码蛋白的特点可以看出它极可能是一种细胞壁蛋白.