植物细胞50ku类角蛋白与β微管蛋白共存

用选择性抽是法从悬浮培养的烟草原生质体中得到类中间纤维蛋白,免疫印迹反应显示其主要成分是分子量分别为６４,５８,５５,５４,５０,４５ｋｕ的６种类角蛋白,其中５０ｋｕ蛋白与微管蛋白多抗亦有免疫交叉反应。     

苜蓿瘤菌中存在类角蛋白——研究中间纤维起源的新线索

根据生物化学性质及不同组织分布,以前将中间纤维(Intermediate filament)划分为5类:角蛋白(Keratin)、波形纤维蛋白(Vimentin)、结蛋白(Desmin)、胶质纤维酸性蛋白(Glial fila-ment)和神经纤维蛋白(Neurofilament).近年又发现一些新类型蛋白,它们分布在各种不同类型的动物细胞中.研究表明,在植物细胞中也至少存在角蛋白中间纤维体系.现在将核纤层蛋白(Lamin)也列入中间纤维蛋白家族.各类中间纤维都具有10nm纤维的形态学特征.角蛋白中间纤维的多肽性质非常复杂,含30多种多肽,分子量在40～70ku之间.根据角蛋白的等电点、分子量及抗原决定簇性质,将角蛋白分成两亚类:I型角蛋白即酸性角蛋白,分子量在40～57ku之间;Ⅱ型角蛋白为中性偏碱性,分子量在53～70ku.角蛋白中间纤维必定是这两类角蛋白即酸性和碱性角蛋白互补装配而成.     

蚕豆保卫细胞中类整合蛋白的鉴定

整合蛋白（integrins)是一类广泛存在于动物细胞表面的蛋白质。它介导细胞和胞外基质、细胞和细胞之间的黏连,也参与细胞内外的信息传递。以前的研究表明,微管和微丝参与调节气孔的运动。利用人整合蛋白（αvβ3/β5)的多克隆抗体证明类整合蛋白存在于蚕豆保卫细胞,并对其进行了定位。Western免疫印迹结果表明在纯化的蚕豆保卫细胞原生质体的膜碎片中存在类整合蛋白,其分子量分别为47．3,43．7和41．1ku。共聚焦激光扫描显微镜观察表明,类整合蛋白存在于蚕豆保卫细胞质膜上,且主要分布在背壁的细胞膜上,这与保卫细胞和表皮细胞之间的信号转导是一致的。因此,这项研究结果证明类整合蛋白存在于蚕豆保卫细胞的质膜上。     

一种原始真核细胞——寇氏隐甲藻细胞中存在类角蛋白中间纤维的证实

中间纤维(intermediate filaments,IFs)是广泛存在于高等动物细胞中的一类胞质骨架体系,到目前为止,对脊椎动物细胞中间纤维的结构、成分已经有了较为深入的了解。进入80年代,一些作者陆续报道在低等动物细胞中亦存在有中间纤维结构或其蛋白成分,最近植物细胞中间纤维的研究也取得了重要进展,我们实验室发现植物细胞中存在与动物细胞     

植物细胞中存在Lamina(核纤层)的实验依据

Lamina是高等动物细胞中普遍存在的结构.它是位于间期细胞核内层核膜之下的纤维蛋白网络,厚度30—100 nm;为核基质-Lamina-中间纤维体系的有机组分之一;与核孔复合体有密切联系;与许多重要的生命活动有关。最近十几年,Lamina的研究取得的很多突破性进展主要来自高等哺乳动物细胞。已有文献报道植物细胞存在类角蛋白中间纤维,但     

NF-L和NF-M在上皮细胞内表达并与角蛋白或波形纤维蛋白共组装

神经丝及细胞质角蛋白纤维都是异源多聚体,它们只有在与其他合适的中间丝蛋白亚基一起表达时才能装配成中间丝。为了研究不同类型的中间丝蛋白间的组装特性,构建了绿色荧光蛋白（GFP）与NF－L或NF－M融合蛋白的重组腺病毒表达载体,并将目的基因在vero细胞内表达,免疫荧光观察结果显示NF－L－GFP或GFP－NF－M不但能与细胞内源性波形纤维蛋白共组装,而且同样能掺入到角蛋白纤维网络中。     

JWA蛋白在细胞内与α-微管蛋白的共定位

探讨了JWA在细胞内的分布特征, 特别是在有丝分裂过程中的动态变化及与α-微管蛋白的关系. 用免疫共沉淀方法研究JWA与α-微管蛋白的相关性; 用基因转染技术研究JWA蛋白高表达后JWA蛋白和α-微管蛋白的相互关系; 用荧光显微镜技术研究低温处理、药物阻滞细胞周期、JWA反义寡核苷酸处理的PC12细胞JWA蛋白和α-微管蛋白的相互作用; 分别用流式细胞仪分析和激光共聚焦技术检测PC12细胞的各细胞周期蛋白在细胞内的分布. JWA作为一种新的微管相关蛋白, 在微管动力学变化过程和细胞周期不同阶段与α-微管蛋白分布平行, 可能对微管具有稳定作用.     

细胞壁连接的类受体激酶(WAK):植物细胞壁与细胞质联系的重要蛋白

细胞壁连接的类受体激酶(WAK)是一类特殊的植物类受体激酶, 与细胞壁中的果胶共价交联. 在结构上, WAK分为胞外域、跨膜域和胞内激酶结构域, 胞外域中存在保守的EGF重复序列. WAK以多基因家族形成存在, 其表达模式具有组织特异性, 主要在叶、茎中表达, 在功能上参与病原菌反应、细胞伸长调控、铝胁迫反应等. WAK1在细胞外与富含甘氨酸的蛋白质AtGRP3特异结合, 在胞内与蛋白磷酸酶KAPP结合并形成约500 kD的AtGRP3-WAK1-KAPP复合体. 植物中还存在与WAK结构相似的类WAK蛋白(WAKL)家族. 本文结合WAK结构特点和作用机制认为WAK/WAKL可能是植物细胞壁与细胞质进行联系和通讯的重要蛋白.     

温度对拟南芥STN7激酶表达及LHCⅡ蛋白磷酸化的影响

拟南芥STN7蛋白激酶参与了LHCⅡ蛋白的磷酸化和状态转换过程. 本研究根据STN7激酶的蛋白序列, 合成了一段含11个氨基酸的亲水肽段, 与牛血清蛋白BSA偶联后, 免疫家兔制备得到合成多肽的抗体, 免疫双扩散和Western blot检测表明该多肽抗体效价和特异性较高. 借助该多肽抗体、磷酸化抗体和低温(77 K)荧光, 研究了温度对拟南芥LHCⅡ蛋白的磷酸化、状态转换和STN7激酶表达的影响. 结果表明, 温度不仅调节LHCⅡ蛋白的磷酸化水平, 而且还调节STN7激酶的表达水平. 另外, LHCⅡ蛋白的磷酸化随温度的变化趋势与STN7激酶表达量的变化趋势相对一致, 并且与状态转换密切相关, 为LHCⅡ蛋白磷酸化及STN7激酶表达调控机理研究提供了有用的信息.     

乳腺癌细胞靶向特异性多肽研究

通过噬菌体肽库技术, 研究能特异性结合并具有携带目的基因进入靶细胞能力的多肽. 以人乳腺癌细胞MDA-MB-231为靶细胞, 与pC89噬菌体肽库共培养筛选出能特异性进入靶细胞的小肽噬菌体. Subtilisin被用于灭活未进入细胞的噬菌体, 进入细胞的特异性小肽噬菌体经细胞裂解、转化E. coli XLI-Blue得到扩增. 经5轮反复共培养, 富集得到能特异性进入乳腺癌细胞的小肽噬菌体. 以RGD-integrin binding噬菌体为对照, 分别检测乳腺癌细胞特异性小肽噬菌体与MDA-MB-231、其他乳腺癌细胞株以及实体瘤细胞株的亲和性. 测序并合成无噬菌体外壳蛋白的特异性多肽(CASPSGALRSC)以标记FITC; 同时为了解氨基酸序列排列对特异性的影响, 合成了调整氨基酸序列排列次序的多肽(CGSLSRAPSAC), 并检测其与人乳腺癌细胞的特异性. 实验获得与MDA-MB-231细胞特异性结合的小肽噬菌体; 合成的无噬菌体外壳蛋白的多肽序列保持与MDA- MB-231细胞的特异性, 并且亲和性高于嵌合蛋白(RGD-integrin). 本研究建立了一种利用噬菌体肽库研究能结合或进入不同细胞的未知多肽的技术; 得到了一条能与MDA- MB-231高特异性结合的氨基酸多肽序列; 这种高特异性呈现氨基酸多肽序列高度依赖性; 该氨基酸多肽具有作为乳腺癌基因治疗高效靶向性载体的潜在临床应用价值.     

用整体原位杂交法研究微管蛋白基因在斑马鱼胚胎中的表达

斑马鱼是一个很好的脊椎动物发育研究模型,斑马鱼胚胎发育过程中基因表达调控的研究对揭示脊椎动物形态发生的分子机理非常重要。微管蛋白固定受精卵细胞质中的形态发生决定子,组织形成基本的细胞骨架,控制细胞的各种运动。在脊椎动物中已发现有几种微管蛋白,每种微管蛋白都有其特定的表达位点和功能。用一种β２微管蛋白基因的全长ｃＤＮＡ为模板,合成地高标记的ＲＮＡ为探针,对斑马鱼各时期的胚胎进行整体原位杂交。β２微管     

一种新的微管相关蛋白JWA对细胞内氨基酸平衡有重要调节作用

探讨了JWA蛋白在细胞内的确切定位、与微管蛋白的相互关系及对细胞内氨基酸平衡的调节作用. 应用4~37℃(微管解聚-聚合)交替作用法提取纯化大鼠脑组织中微管及其相关蛋白; 用免疫共沉淀法研究JWA蛋白与微管蛋白的相互作用; 应用基因转染和免疫荧光等实验方法研究低温(4℃)、秋水仙素(1 × 10^-5, 5 × 10^-5 mol/L)等处理的HBE细胞/ NIH3T3细胞中JWA和微管的动态变化及相互关系. 应用反义寡核苷酸技术结合氨基酸分析技术探讨JWA蛋白对PC12细胞内氨基酸平衡的调节作用. 结果表明, JWA蛋白是一种新的微管相关蛋白, 与微管蛋白分布基本平行, 在绝大多数情况下伴随微管动力学改变(聚合或解聚)而同步发生变化, 并且可能参与了细胞有丝分裂的过程. JWA蛋白是细胞内氨基酸总量的一种重要负性调节蛋白, 并选择性地调节细胞内谷氨酸和牛磺酸含量.     

马铃薯的免疫法

近年来,在研究防治植物因微生物引起的病害中,有两个重要发现证实了植物免疫的可能性。当植物被传染时,植物本身能产生一种抗生素物质—植物不传染组织中所缺少的植物防御素。在产物中间,微生物的生命活动显示出生物活动物质一植物防御素的诱导物。Л.В.梅特里茨基和他的助手(苏联科学院巴哈生物化学研究所,白俄罗斯共和国农业部白俄罗     

动蛋白相关蛋白在烟草花粉管高尔基体上的存在与分布

有关研究表明, 中央马达动蛋白AtKinesin-13A在拟南芥不同细胞中与高尔基体结合. 用简并引物, 通过RT-PCR方法从烟草中克隆到一个2067 bp的基因片段, 其编码的多肽序列与拟南芥中AtKinesin-13A相应序列的相似性为77.33%, 其原核表达产物可与AtKinesin-13A抗体进行特异反应. 进一步研究发现, AtKinesin-13A抗体可以与烟草不同组织提取物中一个120 kD的多肽进行反应. 这些结果表明, 烟草中存在AtKinesin-13A的同源蛋白NtKinesin-13A, 其分子量约为120 kD. 经免疫荧光标记, 在共焦激光扫描显微镜下观察发现, NtKinesin-13A在烟草花粉管中呈颗粒状分布, 且与高尔基体标记蛋白58K共分布, 说明烟草花粉管中NtKinesin-13A也存在于高尔基体上. 经免疫金标, 在透射电子显微镜下观察, 发现烟草花粉管中的NtKinesin-13A定位在高尔基体附近的囊泡膜上. 以上结果表明, 烟草中NtKinesin-13A可能参与了花粉管中高尔基体运动的调控或与高尔基体囊泡的分泌有关.     

细胞骨架结构的研究

细胞骨架结构(cytoskeleton system,CSS)是动物细胞质中广泛分布的重要亚细胞结构.虽然过去未把它们看作重要的细胞器,然而随着近代细胞生物学研究的飞快进展,充分阐明了它们的结构、性质和复杂的功能.CSS 主要包括微丝(microfilament,MF)、中间丝(intermediate filament,IF)和微管(microtubules,MT)三种由直链蛋白多聚体所组成的纤维或微管状结构,以及细胞质中一些短纤维形成的网格结构(trabeculae).CSS 具有复杂的功能,对     

衣藻基体中存在类中间纤维构成的笼状结构

衣藻是原始的单细胞的真核生物,具有两条等长的鞭毛,在鞭毛的根部是由九组三联微管组成的细胞器,称做基体.基体与中心粒(centriole)是同源器官,是形成鞭毛和胞质中微管的中心.基体有自己的DNA分子((6—9)×10~8hp),存在于基体的腔内.我们采用选择性抽提结合整装制片电镜技术,在衣藻基体(basal pody)中观察到10nm纤维构成的结构,以哺乳动物角蛋白抗体进行免疫荧光观察,在衣藻基体处有阳性结果.     

水稻OsSH3P2短肽多克隆抗体的制备和鉴定

特异性抗体的成功制备是研究蛋白功能的重要环节,目前短肽抗体制备技术在动物中的应用日益成熟,然而该项技术在植物中的应用甚少.本研究通过分析水稻OsSH3P2蛋白的抗原表位、亲水性以及同源蛋白氨基酸序列,同时利用RoseTTAFold系统进行蛋白模型预测.选取了3条序列特异、亲水性高、具有抗原表位和不同肽链结构的氨基酸序列,通过人工合成短肽抗原、偶联KLH载体蛋白后,免疫新西兰大白兔制备得到相应多克隆抗体.经酶联免疫吸附测定检测获得了3份Anti-OsSH3P2-1#、Anti-OsSH3P2-2#、Anti-OsSH3P2-3#高效价短肽多克隆抗体血清.用免疫印迹(Western blotting)方法对OsSH3P2原核重组蛋白和植株内源的OsSH3P2蛋白进行检测,以进一步确定短肽抗体的特异性.结果显示,由不含α-螺旋和β-折叠结构的肽段作为抗原,免疫制得的Anti-OsSH3P2-1#短肽多克隆抗体能有效识别OsSH3P2蛋白,且不受同源蛋白干扰,说明该抗体具有较高的免疫特异性. OsSH3P2短肽多克隆抗体的成功制备,为进一步挖掘OsSH3P2生物学功能奠定基础,且为植物短肽抗体...     

微管解聚驱动蛋白Kinesin-13的研究进展与展望

微管是细胞骨架的重要组成成分,其在细胞内的动态调节关系着细胞正常生理功能的发挥和维持.目前发现多种参与细胞内微管组装与解聚调控的蛋白,其中发挥微管解聚功能的Kinesin-13驱动蛋白家族被广泛地研究,该蛋白具有控制有丝分裂,调控纤毛组装与解聚和神经轴突发育与修复等功能.本文主要对Kinesin-13微管解聚机制,以及在主要的模式生物中生物学功能与调控机制进行比较与分析.     

Cl~-维持PSII锰复合物功能结构的实验证据

锰原子附着在植物光系统Ⅱ(PSⅡ)反应中心D_1和D_2蛋白上,构成锰蛋白复合物,在外周天线蛋白(47,43kD)、3种水溶性蛋白(33,23,17ku)、无机离子Ca~(2+)和Cl~-的辅助调节下,吸收光能,通过S_0→S_4态的循环,将水分解,形成分子氧.用氯化钠溶液清洗去除23,17ku水溶性蛋白后,水分解酶中锰原子极易被PD(Phenylenediamine,苯二胺)和HQ(Hydroquinone,氢醌)之类还原剂攻击,由Mn≥3+还原形成Mn~(2+)并释放出水分解酶,此过程伴随着水分解活性的相应降低.     

中国小麦花叶病毒RNA2外壳蛋白通读区及19 ku富半胱氨酸基因的克隆、表达及其编码蛋白定位

应用RT-PCR扩增中国小麦花叶病毒(CWMV)外壳蛋白通读区(readthrough, RT) 5′端(RTn)和3′端(RTc)及19 ku的富含半胱氨酸蛋白基因, 分别克隆并在E. Coli中表达, 表达蛋白粗提纯后免疫小鼠, 制备相应的抗血清和单克隆抗体. 用各种抗体检测小麦病叶汁液中RTn, RTc和19 ku蛋白. 结果表明, RTn和RTc分布在病叶细胞中的CWMV病毒粒子表面, 而19 ku蛋白则均匀分布于细胞质中.