中国小麦花叶病毒RNA2外壳蛋白通读区及19 ku 富半胱氨酸基因的克隆、表达及其编码蛋白定位表达及其编码蛋白定位

应用RT－PCR扩增中国小麦花叶病毒（CWMV）外壳蛋白通读区（readthrough，RT）5′端（RTn）和3′端（RTc）及19ku的富含半胱氨酸蛋白基因，分别克隆并在E.coli中表达，表达蛋白粗提纯后免疫小鼠，制备相应的抗血清和单克隆抗体，用各种抗体检测小麦病叶汁液中RTn,RTc和19ku蛋白。结果表明，RTn和RTc分布在病叶细胞中的CWMV病毒粒子表面，而19ku蛋白则均匀分布于细胞质中。     

猪腮腺分泌蛋白基因序列和蛋白结构比较分析及组织表达谱鉴定

腮腺分泌蛋白(parotid secretory protein, PSP)是唾液中特异性高表达的一种蛋白, 其功能与抗菌有关. 根据人、牛和鼠的PSP基因cDNA序列设计简并引物, 通过3′和5′RACE获得猪PSP基因全长cDNA序列. 同源性分析表明, 在核苷酸和氨基酸水平上, 猪、人和牛PSP基因同源性较高. 在蛋白二级和三级结构上, 猪与人PSP的结构也非常相像, 与抗菌蛋白BPI结构类似. 蛋白功能分析发现, 猪PSP基因氨基末端含有一个特殊结构Leu-X(6)-Leu-X(6)-Leu-X(7)-Leu-X(6)-Leu-X(7)-Leu-X(6)-Leu-X(6)-Leu, 可能对其功能有一定的意义. 通过RT-PCR, 斑点杂交和Northern杂交, 证明猪PSP基因是组织特异性表达, 只在腮腺和下颌下腺表达.     

水疱性口炎病毒L蛋白N端存在新的定位信号

水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV) L蛋白是该病毒复制酶的主要成分, 分子量约为241 kD. 通过构建L蛋白缺失突变体与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因的方式, 将融合蛋白置于T7启动子或CMV启动子下游, 在多种动物细胞中瞬时表达了重组的融合蛋白. 荧光显微镜观察结果显示, 仅保留N端96个氨基酸残基或缺失N端120个以上残基时, 融合蛋白均匀分布于整个细胞质中, 而含有N端120个以上残基时, 融合蛋白呈点状或局部分布于核周围部位. 截取L蛋白96～120氨基酸片段, 连接到GFP蛋白氨基端, 同样融合蛋白亦特异性地分布到核周围局部区域. 进一步研究含定位信号的25个残基片段发现, 仅13个残基的肽段QGYSFLHEVDKEA(108 ~ 120)就具有定位功能, 缺失D或V均导致定位信号完全丧失. 含有这13个残基的GFP融合蛋白, 在多种细胞和不同表达模式下均显示了同样的分布规律, 表明L蛋白N端这种定位信号具有独立的定位功能, 并且在不同细胞中是保守的.     

植物细胞50 ku类角蛋白与β微管蛋白共存

用选择性抽提法从悬浮培养的烟草原生质体中得到类中间纤维蛋白,免疫印迹反应显示其主要成分是分子量分别为64,58,55,54,50,45 ku的6种类角蛋白,其中50 ku蛋白与微管蛋白多抗亦有免疫交叉反应. 双向电泳显示50 ku蛋白包含两种多肽成分. 对分离纯化得到的50 ku蛋白进行部分序列测定,结果表明两种多肽成分分别为新的未知序列蛋白和β微管蛋白. 结合以往的实验结果,证明在植物中间纤维成分中,50 ku 类角蛋白与β微管蛋白相结合,可能由此介导了植物中间纤维与微管共分布.     

小麦中一个PDR型ABC转运蛋白基因的克隆和特征分析

脱氧血腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)在小麦赤霉病发病过程中起重要作用, 是一种毒性因子. 禾谷镰刀菌的侵染能力依赖于其产生DON的能力, 抗病品种能显著降低病穗组织中DON的含量. 本研究利用Affymetrix小麦基因组芯片, 对抗赤霉病小麦品种望水白经DON诱导后的穗组织基因表达特点进行了分析, 结果发现, 一个编码PDR型转运蛋白的EST受DON诱导后上调表达45倍. 根据该EST设计引物筛选小麦基因组TAC文库, 得到一个包含该基因的TAC单克隆. 利用染色体walking对该单克隆测序, 用Softberry软件进行基因预测, 根据预测基因的5′和3′非翻译区设计引物, 从DON诱导的小麦望水白穗组织cDNA中克隆出该转运蛋白基因. 该基因组全长7377 bp, 包含19个外显子, CDS长度为4308 bp, 编码长1435 aa且分子量161 kD的蛋白. 蛋白序列比对表明, 该基因属于PDR蛋白家族, 命名为TaPDR1 (Triticum asetivum Pleiotropic Drug Resistance). 利用一套中国春缺体-四体系将TaPDR1基因定位在小麦5A染色体上. 半定量RT-PCR表明, TaPDR1在望水白穗中受DON和禾谷镰刀菌诱导表达, 表明其参与了植物抗病防御反应. 该基因在望水白感病突变体中低水平表达, 进一步证明TaPDR1与赤霉病抗性有关. TaPDR1的表达不受与生物胁迫相关的激素(JA和SA)和非生物胁迫因子(热、冷、伤害和NaCl)的诱导, 但受到Al³⁺和游离Ca²⁺的诱导表达, 推测[Ca²⁺]i介导了TaPDR1的表达信号.     

SGK和14-3-3蛋白与TPO/MPL信号传导的丝氨酸/苏氨酸磷酸化机制有关

血小板生成素(thrombopoietin, TPO)是调节血小板生成最主要的细胞因子, 它的生物学效应由其受体c-Mpl介导. 用酵母双杂合系统(two-hybrid system)筛选了与c-Mpl膜内部分相互作用的蛋白质. 在5×106个转化子中, 得到48个阳性克隆. 测序结果表明, 其中一个是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶SGK (serum and glucocorticoid-inducible kinase)的部分编码序列(编码第246位氨基酸至C末端, 包括3′端非编码区); 另一个为14-3-3 theta亚型蛋白的部分编码序列(编码第67位氨基酸至C末端, 包括3′端非编码区). 体外GST-Pulldown分析和免疫共沉淀进一步证实了c-Mpl与它们的相互作用. 通过系列缺失研究发现两个蛋白与c-Mpl相互作用的区域都在523~554 aa范围内. 用酵母双杂合系统进一步研究SGK和14-3-3蛋白之间的关系, 发现两者可能直接相互作用. SGK和14-3-3蛋白可能与TPO/MPL信号传导过程中的丝氨酸/苏氨酸磷酸化有关.     

一个新的人类硫氧化还原蛋白基因的克隆

根据不同发育阶段 ( 1 3,33周 )的人胎脑组织mRNA差异显示分析 (又称DDRT PCR)所得到的具有差异表达的EST的序列 ,设计引物筛选点阵排列的人胎脑cDNA文库 ,得到一个新的全长cDNA克隆 .这个克隆全长 1 2 0 8bp ,包含一个 889bp的开放阅读框 ,一个 1 32bp的 5′非翻译序列和一个 2 0 9bp的 3′非翻译序列以及典型的polyA加尾信号 .其推断的氨基酸序列与人硫氧化还原蛋白同源 ,而且含有硫氧化还原蛋白的保守的活性位点序列 .将它命名为人的类硫氧化还原蛋白基因 (humanthioredoxinlikegene ,hTRXL) .     

热休克蛋白90β参与热休克基因的表达调控

热休克蛋白(heat shock protein,HSP)是一类进化上保守的蛋白质,它们以分子伴侣的形式在细胞内发挥其正常生理功能,并参与细胞应激保护和应答过程。人淋巴细胞中最主要的HSP是表观分子量70ku和90ku的HSP70和HSP90两组,其中HSP90又分为α和β两个拷贝。热休克蛋白基因(heat shock protein gene,hsp)的反式调节因子即热休克因子(heat shock factor,HSF)通过多聚化、磷酸化等活化过程参与HSP基因表达。与主要在应激诱导中大量表达的HSP70不同,HSP90是一类特异性分子伴侣,在生理条件下能与多种细胞内受体和信号传递途径中有关成分结合并调节它们的活性,因而其细胞内精密调节的机制具有重要的生理意义;但是,作为分子伴侣的HSP90是否参与其自身或对其他热休克基因的反馈调节迄今未见报道,本文对此进行了探讨。     

PAS结构域介导Org35蛋白与NifA之间相互作用

在巴西固氮螺菌中, 氧和铵是调节固氮基因表达的主要环境因子, 即高浓度的氧和铵抑制固氮作用. NifA蛋白(nifA基因的产物)是所有固氮基因(nif基因)的转录激活蛋白. 目前, 在该菌中, 氧和铵对NifA蛋白的表达和活性的调节机制仍然不清楚. 本研究从巴西固氮螺菌中克隆到编码含有PAS结构域蛋白的org35全基因, 将根据org35的核苷酸序列推测的Org35蛋白氨基酸序列在NCBI网上进行同源性比较, 结果表明, Org35蛋白属于杂合双组分调节系统, 包括3个结构域, 即N-端PAS结构、中间组氨酸激酶结构域(HPK)和C-端响应调节蛋白结构域(RR). 并通过酵母双杂交系统证明了Org35蛋白与NifA蛋白之间的相互作用是由PAS结构域介导的.     

拟南芥液泡膜水孔蛋白的互作蛋白AtSM34 参与种子萌发的渗透胁迫响应

水孔蛋白(aquaporin, AQP)广泛参与植物的各种生理活动, 但还有许多调控机制未被发现. 为进一步对其调控因子进行研究, 运用酵母双杂交筛选拟南芥液泡膜水孔蛋白TIP1;1(tonoplast intrinsic protein, TIP)的互作子, 这是拟南芥中第一个被发现的液泡膜上具有高度水转运活性的蛋白. 以AtTIP1;1 为诱饵, 筛选得到一个新的TIPs 结合蛋白, 并在酵母和植物细胞中验证了这种结合. 该蛋白被命名为AtSM34, 编码一个含309 个氨基酸的多肽, 预测分子量为34 kD, 具有1 个单独的MYB/SANT 样结构域. AtSM34 启动子融合GUS 组织化学染色分析显示, 其表达主要位于花、茎和叶中, 尤其是维管束组织, 并且响应渗透胁迫. AtSM34 定位于内质网, 截断分析显示其N 端(1~83 位氨基酸)对于其定位至关重要. 过表达AtSM34 导致转基因植物对外源甘露醇、山梨醇及脱落酸更加敏感, 表现为萌发延迟. 进一步研究发现,AtSM34 也可与AtTIP1;2 和AtTIP2;1 结合, 这2 个TIP 蛋白对液泡渗透调节发挥着重要作用,并在种子萌发阶段大量表达. 这暗示着AtSM34 可能通过影响水孔蛋白基因的表达, 参与种子萌发早期阶段的渗透胁迫响应.     

水稻bZIP蛋白REB与水稻中sbe1和waxy基因5′上游区的相互作用

水稻淀粉分支酶(SBE1)和结合淀粉粒的淀粉合成酶(GBSS)分别负责水稻胚乳中支链淀粉与直链淀粉的合成, 编码这两个酶的sbe1和waxy基因主要都在胚乳中表达. 在水稻sbe1基因5′上游区中找到了一个能与水稻胚乳核蛋白结合的53 bp片段C53, 而且这种结合受到水稻waxy基因5′上游区的Ha-2片段竞争. 进一步的实验证明水稻bZIP蛋白REB可以结合sbe1基因中C53片段中的2个ACGT元件G-box和Hex, 并且REB也能结合waxy基因中Ha-2片段的3个ACGT元件: WG1, WG2和WG3, 其中WG1元件能强烈地竞争Hex元件与REB蛋白的结合. 这提示水稻sbe1基因与waxy基因在胚乳中的表达受到像REB这样的bZIP类转录因子的协同调控.     

微管结合蛋白2的功能区域分析

在神经系统中,神经元作为复杂的神经网络系统中的单元,发育成一个高度极性化的形态结构.这种极性状态在它从神经母细胞开始分化长出树突和轴突时便形成,在这一过程中,微管结合蛋白(microtubule-associated proteins,MAPs)特别是MAP2与Tau蛋白的表达对于细胞的极性化形态的发生、维持及其功能等方面发挥着重要的作用.在神经突起中,MAP2可以说是树突的标记,MAP2C及tau则大量地存在于轴突中.它们靠C-末端的微管结合部位与微管结合,而N-端则突出于微管表面.用MAP2或tau转染成纤维细胞可诱导微管束的形成,进一步的实验结果表明它们都能诱导Sf9细胞长出类似于神经元的突起,并且证明了MAP2及tau的N-端,而不是C-末端分别决定神经元树突与轴突中微管之间的距离,从而确定了在轴突和树突中微管系统的结构特征.然而MAP2及tau的N-端在相     

巴西固氮螺菌GlnB与NifA蛋白N端结构域的相互作用

巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)可与多种重要作物联合固氮, 具有作为生物肥料的潜能. 固氮基因(nif)的转录激活蛋白NifA和PⅡ信号转导蛋白家族成员GlnB是参与该菌固氮调控的两个关键蛋白, 且NifA的活性调控依赖于GlnB. 研究结果表明, 在无氮条件下GlnB与NifA蛋白N端结构域存在相互作用, 且N端18和53位酪氨酸突变为苯丙氨酸的NifA与GlnB的互作增强. 研究还发现, NifA蛋白N端66~88位和165~176位氨基酸区域对于与GlnB蛋白的相互作用是必需的.     

水稻WRKY89中的亮氨酸拉链结构增强蛋白与W盒元件的相互作用

WRKY蛋白是一类参与植物生物和非生物胁迫反应、代谢、发育等过程的转录调节因子. 水稻WRKY89与其他的WRKY成员同源性较低, 推测由263个氨基酸组成, 其N端带1个可能的亮氨酸拉链结构. 采用pET-29b载体原核表达了OsWRKY89和其3个N端缺失的衍生物, 并采用Ni柱的方法对表达的蛋白进行了纯化. 凝胶阻滞结果表明, OsWRKY89能与含顺式元件W盒的DNA序列特异结 合, 而缺失N端亮氨酸拉链的OsWRKY89与该元件的结合能力显著下降. 酵母双杂交结果表明, 亮氨酸拉链样结构参与OsWRKY89蛋白的同源相互作用. 进一步缺失OsWRKY89至部分WRKY结构域导致表达的蛋白完全丧失与上述元件的结合活性, 表明WRKY结构域是DNA结合中不可缺少的. 这些结果说明亮氨酸拉链结构在蛋白质与蛋白质互作和DNA与蛋白质中起重要作用.     

稻瘟病菌坏死和乙烯诱导肽1样蛋白的原核表达、纯化与活性分析

坏死和乙烯诱导肽1(necrosis and ethylene-inducing peptide 1, Nep1)样蛋白(Nep1-like proteins, NLPs)是一类广泛存在于细菌、真菌及卵菌中的分泌型蛋白.本研究通过生物信息学分析了稻瘟病菌中的4个坏死和乙烯诱导肽1样蛋白的家族基因成员的相关信息,克隆了它们的编码区序列,分别将它们构建到了pGEX-6P-1载体中.通过优化诱导条件对它们进行了原核表达、纯化,获得了相应的可溶性目的蛋白,进一步将纯化的目的蛋白注射到烟草叶片中,发现N端融合GST标签的MoNLP1、MoNLP4蛋白仍具有生物学活性,可以明显诱发烟草叶片组织产生细胞坏死.该研究为进一步深入研究该基因家族在稻瘟病菌中的功能与作用以及开发更多潜在的植物蛋白激发子奠定基础.     

山羊β-酪蛋白基因启动区指导人血清白蛋白在转基因小鼠乳汁中的高效表达

构建了包含山羊β-酪蛋白基因启动区5′端上游调控序列和外显子1, 2及内含子1在内的乳腺表达载体, 并与人血清白蛋白(hALB)小基因(含全长cDNA序列及其内含子1)构建成融合基因. 鼠尾静脉注射实验表明, 该融合基因能在小鼠乳腺中特异表达. 应用显微注射方法将该融合基因导入小鼠受精卵, 并将受精卵移植于假孕母鼠, 共获得33只F0代小鼠, 经PCR和Southern印迹杂交证实, 有8只小鼠(5♀, 3 ♂ )基因组中整合有hALB基因, 整合率为24.2%(8/33). Western blot分析表明, 在5只雌性整合小鼠中有3只表达了hALB蛋白, 放射免疫法测定其乳汁中hALB含量分别为3.54, 0.21和3.03 g/L.     

水稻花药发育相关基因OsPRP1的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻颖花中克隆了一个编码富含脯氨酸残基多肽的cDNA, 并将其相应的基因命名为OsPRP1. OsPRP1由2个外显子和1内含子组成, 编码的蛋白由224个氨基酸残基组成, 其中脯氨酸含量最高, 占14.29%. 该蛋白由一个21个氨基酸残基组成的信号肽, 一个N-端结构域和一个C-端结构域组成. C-端含有2个18个氨基酸长的、嵌合PEPK基元(motif)的富含脯氨酸的重复序列. Southern blot及序列分析结果表明, 水稻基因组中存在4个拷贝的OsPRP1, 它们定位在第10染色体的20 kb的DNA片段上. RT-PCR表明, OsPRP1在幼芽和颖花中表达量较高, 在根和叶中有少量表达. 用花和幼芽进行原位杂交分析证明在花中, OsPRP1在花粉母细胞、绒毡层细胞和花器官的维管束细胞中表达; 该基因的表达有明显的时间特异性, 在花粉母细胞中表达量最高, 在单核期的小孢子中几乎不表达; 在芽中, 该基因在胚芽鞘和叶原基的表皮细胞中表达. 从该基因编码蛋白的特点可以看出它极可能是一种细胞壁蛋白.     

IL-2与HBV前S抗原融合蛋白的真核细胞分泌表达

为使完整的ＨＢＶ前Ｓ抗原能在真核细胞中分泌表达,构建了新型真核表达克隆,以人白细胞介素－２的前导序列为分泌信号肽,在ＩＬ－２Ｃ端与ｐｒｅＳ１ＡｇＮ端之间以高亲水性氨基酸片段相连。由此构建的质粒转染ＣＯＳ－７细胞能分泌表达ＩＬ－２ｐｒｅＳ融合蛋白,其表达效率与表达天然ＩＬ０－２分子一致。     

兔C反应蛋白与含模型受体的磷脂单层膜的相互作用

正常情况下动物血清中只含微量的C反应蛋白(C-reactive protein,CRP),机体损伤、感染等许多因素都能刺激肝脏合成CRP,使血清中的CRP含量成千倍地增加,当病情趋于好转时CRP的含量迅速下降到正常水平.兔C反应蛋白(Rabbit C-reactive protein,CxRP)的分子量约为100ku,由5个相同的亚基组成.5个亚基在平面上排列成一个圆环,每个亚基中有一个结合磷酸胆碱(PC)基团的活性位点,PC结合位点位于C反应蛋白分子的同一面.CRP能够与细胞膜脂作用,与微生物细胞壁中的多糖作用,所形成的复合物能激活补体系统、调节巨噬细胞、淋巴细胞和血小板的功能.     

活性氧和黄腐酸使软骨细胞分泌蛋白多糖异常

关节软骨是一种没有血管、没有神经的组织,软骨细胞代谢物的转运要通过基质、并依赖于基质的结构和组成.蛋白多糖(Proteoglycan,PG)的含量是控制软骨性能的一个重要参数,即使有微小的变化也会导致组织行为的改变.活性氧能不同程度地损伤氨基多糖(Glycasaminoglycan;GAG)和PG,而黄腐酸(Fulvic acid,FA)不能直接降解GAG和PG.为进一步探讨大骨节病区FA和活性氧在大骨节病病理过程中的作用,我们研究了FA和活性氧存在时,体外培养的鸡胚肢软骨细胞分泌PG的组成变化和异常PG对羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HAP)晶体生长的影响,并与5-溴 2′-脱氧尿甘(5-Bromo-2′-deoxyuridine,5-Brdurd)对软骨细胞的作用进行了比较,以探寻活性氧和软骨细胞去分化之间的相关性.