HMG1/2和HMG14/17与人ε-珠蛋白基因启动子DNA的相互作用

HMG（hihg mobility group）蛋白质是真核细胞核内一类含量丰富的非组蛋白，它们在染色质的结构与功能及基因表达调控中起着重要作用，应用凝胶电泳阻滞法和体外核小体重组技术，分析了HMG1/2和HMG14/17与人ε-珠蛋白基因启动子（ε-promoter,-177～ 1bp）DNA的结合模式，实验结果表明，HMG1/2能与ε-珠蛋白基因启动子DNA相结合，而HMG14/17不能与它结合，将ε-珠蛋白基因启动子DNA在体外组装成核小体后，HMG1/2则不能与组装成核小体的ε-珠蛋白基因启动子DNA结合，而HMG14/17却能与之结合，结果提示，当ε-珠蛋白基因启动子DNA处于不同的状态时，它所结合的HMG蛋白是不同的，推测它们可能就是通过这种选择性的结合模式而积极参与了人体ε-珠蛋白基因的表达调控。     

人ε-珠蛋白基因5′旁侧调控元件与核基质蛋白相互作用

运用凝胶电泳阻抑法揭示了在活跃表达人ε-珠蛋白基因的K562细胞内存在一个红细胞专一的核基质蛋白(简称ε-NMPk),它能专一地与正调控元件ε-PREⅡ DNA(-446～-419 bp)相结合, Southwestern blotting分析表明,ε-NMPk是由2个分子量约为40 ku的亚基所组成.还发现在K562,HEL和Raji细胞中都至少存在着1个核基质蛋白,它们能与ε-珠蛋白基因5′旁侧DNA序列内的沉默子DNA(silencer, -392～-177 bp) 相结合, 它们的结合区带(band K 与bandH/R)位置并不完全相同, 推测在HEL和Raji细胞内可能共同存在着一个与沉默子DNA专一结合的核基质蛋白. 实验结果表明, 核基质蛋白可能积极参与了人ε-珠蛋白基因时空表达的调控.     

发育时期专一性相关的调控因子与人体ε-珠蛋白基因5′旁侧调控元件DNA的结合

人体ε-珠蛋白基因是人体β-类珠蛋白基因簇中胚胎型结构基因,在胚胎发育过程中,它最先在卵黄囊血岛中表达,也最先关闭,呈现出严格红系组织特异性和发育时期专一性特点.最近有人报道,人ε-珠蛋白基因5’旁侧DNA序列对人ε-珠蛋白基因时空表达和调控起着很重要的作用.已鉴定出位于该基因5’旁侧DNA序列内,从-535bp到-453bp为一个正调控元件(PRE),从-392bp到-177bp为一个沉默子(Silenecer)(图1).但目前尚不清楚它们作用的分子机制.     

转录辅因子CBP/p300提高转录因子C/EBP介导的人白细胞介素5(IL-5)基因启动子活性

IL-5主要由Th2类细胞产生, 在过敏性哮喘等过敏性疾病的发生过程中起着关键的作用. 转录辅因子CBP/p300本身具有组蛋白乙酰转移酶活性, 参与许多基因的转录调控过程. 腺病毒E1A癌蛋白能与CBP/p300蛋白结合并抑制其活性. 我们分析了E1A蛋白在IL-5基因启动子/荧光素酶报告基因表达调控中的作用, 结果表明E1A蛋白能抑制PMA/离子霉素激活和转录因子C/EBPβ介导的IL-5基因启动子/荧光素酶报告基因的活性. 而突变体E1AΔ2-36蛋白因不能与CBP/p300蛋白结合而不能抑制IL-5基因启动子/荧光素酶报告基因的表达. 此结果揭示, 组蛋白乙酰转移酶CBP/p300参与IL-5基因启动子活性的调控. 另外, 转录辅因子CBP/p300和转录因子C/EBPβ可以协同地激活IL-5基因启动子/荧光素酶报告基因的表达. 为进一步研究IL-5基因表达调控的机制奠定了基础.     

miRNA基因和编码基因启动子区核小体定位分析

研究了把基因启动子区的核小体定位对于分析基因的转录调控具有重要意义.利用核小体定位的预测技术——弯曲度谱,分析了编码基因和miRNA基因启动子周围核小体定位的特征.基因的转录起始位点处,有一个核小体缺失区域,且在下游约200bp处,有较强的核小体定位信号.独立转录的内含子miRNA基因与基因间区miRNA基因,在启动子区具有相似的核小体定位特征,在上游0～-400bp间,有一个较宽的核小体缺失区域,在该区域分布有较多的转录因子结合位点;而依赖编码基因转录的内含子miRNA基因,其启动子与蛋白编码基因启动子具有相似的核小体定位特征,在转录起始位点上游-200～-400bp和-400～-600bp处,各有一个较强的核小体定位.这些结果表明,独立转录的miRNA基因(包括基因间区miRNA和独立转录内含子miRNA)和蛋白编码基因,在启动子区可能具有不同的核小体定位特征.核小体定位不仅参与编码基因的转录调节,也影响miRNA基因的转录.     

红细胞分化相关基因EDRF2抑制K562细胞中α-珠蛋白基因的表达

EDRF2是一个红细胞分化相关因子, 它在分化后的K562细胞中被诱导表达. Northern blot结果显示, EDRF2全长mRNA约500 bp. 利用RACE技术, 成功扩增了EDRF2mRNA完整的5′-和3′-末端. EDRF2正义和反义cDNA在K562细胞中稳定表达. Northern blot分析表明, EDRF2能抑制α-珠蛋白基因的表达, 而对γ -珠蛋白基因的表达没有明显的调节作用. 凝胶阻滞电泳的结果显示, EDRF2对GATA-1, NF-E2和AP1(c-Jun/c-Fos)等转录因子的DNA结合活性没有明显的调控作用. GATA-1的负调控因子PU.1表达被EDRF2上调, 提示EDRF2很可能是红细胞分化的负调控转录因子, 与PU.1协同作用, 下调α-珠蛋白基因在K562细胞中的表达.     

HMG蛋白质(1+2)的功能研究

HMG蛋白质是一类酸溶性的非组蛋白质,虽然这类蛋白质在染色质内的含量非常丰富,但有关它们的生物学功能目前依然不清楚.本文对HMG蛋白质(1+2)与β-CAT质粒DNA相互作用的模式进行了初步分析.实验结果表明这类蛋白质能促使β-CAT质粒DNA解螺旋,此外,在质粒DNA的局域部位,还能观察到DNA环结构的形成.     

转录前起始复合物的组装和启动子识别机制

基因转录作为中心法则的关键环节,将遗传信息由DNA传递至RNA,从而指导蛋白质的合成,是生物体最重要的生命活动之一。转录起始过程发生在几万种不同基因的高度多样化的启动子区,启动子区转录前起始复合物(PIC)的装配是转录起始的关键步骤,受到极其复杂的调控,是基因表达调控的核心。数十年来,大量基于TBP-TATA框体系开展的PIC结构和功能研究逐步揭示了基于TBP的PIC在TATA框启动子上的组装机制。近年来,研究显示,人类超过85%基因启动子不含有TATA框,并且几乎所有的基因转录过程都需要TFIID参与,且功能并不能够被TBP所替代。近期,基于TFIID的不同组装阶段的PIC结构和包含+1核小体的复合物结构的研究突破,首次系统地展示了PIC识别不同类型启动子及其在染色质上组装的分子过程,为后续研究基因表达调控提供了理论基础。     

人ε-珠蛋白基因5''''旁侧调控元件与核基质蛋白相互作用

运用凝胶电泳阻抑法揭示了在活跃表达人ε－珠蛋白基因的Ｋ５６２细胞内存在一个红细胞专一的核基质蛋白（简称ε－ＮＭＰｋ），它能专一地与正调控元件ε－ＰＨＥⅡ　ＤＮＡ（－４４６～－４１９ｂｐ）相结合，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析表明，ε－ＮＭＰｋ是由 ２个分子量约为４０ｋｕ的亚基所组成．还发现在 Ｋ５６２，ＨＥＬ和 Ｒａｊｉ细胞中都至少存在着１个核基质蛋白，它们能与ε－珠蛋白基因 ５’旁侧 ＤＮＡ序列内的沉默子 ＤＮＡ（ｓｉｌｅｎｃｅｒ，－３９２～－１７７ｂｐ）相结合，它们的结合区带（ｂａｎｄ Ｋ与ｂａｎｄＨ／Ｒ）位置并不完全相同，推测在ＨＥＬ和Ｒａｊｉ细胞内可能共同存在着一个与沉默子ＤＮＡ专一结合的核基质蛋白．实验结果表明，核基质蛋白可能积极参与了人ε－珠蛋白基因时空表达的调控．     

与人β-珠蛋白基因5＇旁侧序列内负调控元件(NCR2)相结合的调控因子

人体β类-珠蛋白基因簇是研究真核基因表达时空秩序性的一个理想模型,在胚胎发育过程中,它的几个结构基因(ε,~Cγ,~Aγ,δ和β-珠蛋白基因)分别在不同的时期和部位开启和关闭。基因的激活与关闭在细胞分化和胚胎发育过程中都具有十分重要的意义,但有关它们的分子机制目前仍不很清楚。成年型的β-珠蛋白基因在胚胎期不表达,出生后主要在人的骨髓中表达,这一事实说明在胚胎期与胎儿期存在某种调控机制抑制了β-珠蛋白基因的开启。     

一个新的元件(NIRS)参与白介素2受体 a 基因的调控

为研究白细胞介素2受体a亚基(IL-2Ra)基因中与负调控元件NRE (-391/-381 bp)呈反向重复的序列NIRS (-153/-143 bp)中, 在该基因表达中的作用, 通过检测Jurkat细胞及HeLa细胞中荧光素酶报告基因活性发现, NIRS与NRE不仅共同阻遏IL-2Ra基因的组成性表达, 还共同参与介导PHA对该基因启动子的诱导活性. EMSA检测显示, 激活前后的Jurkat细胞及HeLa细胞中均含有双链NIRS和双链NRE的结合蛋白; HeLa细胞中还含有与这两个序列结合的单链结合蛋白; 但是, 激活前后的Jurkat细胞抽提物分别加入HeLa细胞抽提物与单链DNA的结合体系中均能产生超迁移现象, 其中活化细胞抽提物呈现较强的迁移结合带. 紫外交联实验检测发现, 在激活前后的Jurkat细胞和HeLa细胞中均存在双链DNA结合蛋白p83. 结果显示, 不同细胞中, 反式作用因子能通过NRE和/或NIRS元件以及单、双链DNA的选择性对IL-2Ra 基因启动子活性起关键调控作用.     

人ε-珠蛋白基因5''旁侧调控元件与核基质蛋白相互作用

运用凝胶电泳阻抑法揭示了在活跃表达人ε－珠蛋白基因的Ｋ５６２细胞内存在一个红细胞专一的核基质蛋白（简称ε－ＮＭＰｋ）,它能专一与正调控元件ε－ＰＲＥ－ⅡＤＮＡ（－４４￣４１９ｂｐ）相结合,Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析表明,－ε－ＮＭＰｋ是由２个分子量约为４０ｋｕ的亚基所组成,还发现在Ｋ５６２,ＨＥＬ和Ｒａｊｉ细胞中都至少存在着１个核基质蛋白,它们能ε－珠蛋白基因５′旁侧ＤＮＡ序列     

小鼠β-簇珠蛋白基因LCR调控元件中DNase-I超敏感点Ⅲ(HS3)的研究

人与小鼠β-簇珠蛋白基因在结构与表达模式上存在极大的相似性.基因簇5’上游20kb内是一个Locus control region(LCR)顺式元件,由4个DNase-Ⅰ超敏感区(HSs)组成.相关的研究工作表明LCR对β-簇珠蛋白基因的红系组织专一性表达有重要作用,它的插入或缺失突变将导致基因表达的紊乱,甚至造成严重的贫血症状.近年来,人们对研究LCR调控元件在β-簇珠蛋白基因发育时期特异性表达中的调控机制给予了极大的关注.希望了解LCR元件中不同的HS是否参与β-簇珠蛋白基因的时期特异开关调节.转基因小鼠研究结果表明人LCR元件中HS3可能与发育早期的胚胎型珠蛋白基因的表达调控相关,但近来有关报道表明小鼠的HS3不为β-簇珠蛋白基因的开关所必需,并且仅部分参与了成年型的β-簇珠蛋白基因的调控.因此,HS3是否参与β-簇珠蛋白基因发育时期特异性的调控尚不完全清楚.     

红细胞分化相关基因EDRF6抑制K562细胞中α—珠蛋白基因的表达

EDRF2是一个红细胞分化相关因子，它在分化后的K562细胞中被诱导表达。Northern blot结果显示。EDRF2全长mRNA约500bp。利用RACE技术，成功扩增了EDRF2 mRNA完整的5‘－和3‘－末端。EDRF2正义和反义cDNA在K562细胞中稳定表达。Northern blot分析表明，EDRF2能抑制α－珠蛋白基因的表达，而对γ－珠蛋白基因的表达没有明显的调节作用。凝胶阻滞电泳的结果显示，EDRF2对GATA－1，NF－E2和APl(c-Jun/c-Fos)等转录因子的DNA结合活性没有明显的调控作用。GATA－1的负调控因子PU。1表达被EDRF2上调，提示EDRF2很可能是红细胞分化的负调控转录因子，与PU．1协同作用，下调α－珠蛋白基因在K562细胞中的表达。     

自组装DNA/纳米颗粒分子逻辑计算模型

将AuNP 自组装聚合色变与DNA 计算相结合, 构建了纳米分子逻辑计算模型. 使用了DNA 自组装、DNA/AuNP 结合和AuNP 聚合色变等关键技术方法. 利用DNA 自组装结构变化,通过DNA/AuNP 聚合色变反应, 实现了简单逻辑运算功能. 在此基础上, 构建了求解简单集合运算的DNA/AuNP 计算模型, 对多重输入的简单集合运算进行了逻辑运算. 最后, 进一步拓展该分子逻辑运算模型的应用, 结合分子检测技术, 对H1N1 病毒基因进行检测.     

小鼠β-簇珠蛋白基因LCR调控元件中DNase-I超敏感点Ⅲ(HS3)的研究

<正>人与小鼠β-簇珠蛋白基因在结构与表达模式上存在极大的相似性.基因簇5’上游20kb内是一个Locus control region(LCR)顺式元件,由4个DNase-Ⅰ超敏感区(HSs)组成.相关的研究工作表明LCR对β-簇珠蛋白基因的红系组织专一性表达有重要作用,它的插入或缺失突变将导致基因表达的紊乱,甚至造成严重的贫血症状.近年来,人们对研究LCR调控元件在β-簇珠蛋白基因发育时期特异性表达中的调控机制给予了极大的关注.希望了解LCR元件中不同的HS是否参与β-簇珠蛋白基因的时期特异开关调节.转基因小鼠研究结果表明人LCR元件中HS3可能与发育早期的胚胎型珠蛋白基因的表达调控相关,但近来有关报道表明小鼠的HS3不为β-簇珠蛋白基因的开关所必需,并且仅部分参与了成年型的β-簇珠蛋白基因的调控.因此,HS3是否参与β-簇珠蛋白基因发育时期特异性的调控尚不完全清楚.     

家蚕(苏·菊×明·虎)幼虫血清蛋白基因(BmLSP)启动子特性分析

从家蚕品种苏·菊×明·虎基因组DNA中克隆了家蚕幼虫血清蛋白基因(larval serum protein, Bombyx mori, BmLSP)的调控序列, 涵盖了第1内含子、第1外显子、启动子区和上游区. 通过PCR技术与限制性内切酶酶切方法, 以荧光素酶(luc)为报告基因, 构建了一系列缺失不同调控元件的报告质粒, 在家蚕BmN细胞瞬时表达系统中进行了BmLSP启动子的特性分析. 结果表明, 含第1内含子和家蚕丝素轻链基因同源区序列的BmLSP启动子活性分别比缺失相应序列的启动子活性提高5.8和4.4倍, 暗示该两段调控序列中含有增强启动子活性的调控元件. 上游区失活的部分水手转座子元件对BmLSP启动子活性有一定的抑制作用. 此外, 外源昆虫保幼激素类似物(JHA)呈现剂量依赖效应, 低浓度处理增强启动子活性, 高浓度处理起抑制作用; 而蜕皮激素(MH)对其活性没有显著影响.     

家蚕(苏·菊×明·虎)幼虫血清蛋白基因(BmLSP)启动子特性分析

从家蚕品种苏·菊×明·虎基因组DNA中克隆了家蚕幼虫血清蛋白基因(1arval serum protein,Bombyx mori,BmLSP)的调控序列,涵盖了第1内含子、第1外显子、启动子区和上游区.通过PCR技术与限制性内切酶酶切方法,以荧光素酶(luc)为报告基因,构建了一系列缺失不同调控元件的报告质粒,在家蚕BmN细胞瞬时表达系统中进行了BmLSP启动子的特性分析.结果表明,含第1内含子和家蚕丝素轻链基因同源区序列的BmLSP启动子活性分别比缺失相应序列的启动子活性提高5.8和4.4倍,暗示该两段调控序列中含有增强启动子活性的调控元件.上游区失活的部分水手转座子元件对BmLSP启动子活性有一定的抑制作用.此外,外源昆虫保幼激素类似物(JHA)呈现剂量依赖效应,低浓度处理增强启动子活性,高浓度处理起抑制作用;而蜕皮激素(MH)对其活性没有显著影响.     

DNA甲基化检测研究新进展

哺乳动物DNA的甲基化几乎皆发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上, 在基因调控区启动子上富含CpG序列, 而这些CpG序列的甲基化水平与基因的调控和肿瘤的发生和发展有着极其重要的关系. 近年来, 随着聚合酶链式反应技术(PCR)的快速发展, 抑癌基因的高甲基化与癌症的关系得到不断深入的研究. 与抑癌基因启动子区CpG岛的异常甲基化相关的抑癌基因失活, 是癌症发生的一个重要机制. 一些基因的过甲基化有可能成为肿瘤乃至癌细胞形成的标志物. 在癌症早期了解相关抑癌基因启动子区CpG岛的甲基化状态, 对于及时发现和治疗癌症具有重要意义.     

纯合子人βE-珠蛋白基因转基因鼠系的建立

血红蛋白E(Hb E)是我国常见的异常血红蛋白病,它是由β-珠蛋白基因第26位编码子的G→A点突变引起.因Hb E与β-地中海贫血症状相似,又称之为地中海贫血样综合征;它也常与β-地中海贫血复合存在,危害严重.利用转基因动物技术研究真核基因表达调控已取得重要进展.已发现β-珠蛋白基因簇和α-珠蛋白基因簇上游区的DNase Ⅰ敏感区能明显提高珠蛋白基因的表达水平.其中β-基因簇的HS-2和α-基因簇的HS-40具有典型的增强子作用.