果蝇3个新的小分子非编码RNA的鉴定

通过比较基因组和分子生物学方法分析了果蝇属中5种果蝇全基因组内含子区域的保守序列, 获得了3个新的非编码RNA基因. 其中一个为具有典型的box C/D家族保守元件及结构特征的核仁小分子RNA基因, 其功能序列可介导28S rRNA的C2673位点的核糖甲基化修饰. 另外两个为miRNA基因, 其转录序列可形成典型的miRNA前体茎环结构; 在果蝇发育的4个时期均可表达产生长度为23个核苷酸的成熟RNA分子. 结果还表明, 在长度为100~500 bp区间的黑腹果蝇基因内含子中存在396个多物种保守序列(MCIS), 这些序列除编码小分子RNA外, 还可能与影响基因转录或转录后加工的顺式元件有关.     

植物转录因子的结构与调控作用

植物各种诱导型基因的表达主要受特定转录因子在转录水平上的调控。典型的转录因子含有ＤＮＡ结合区、转录调控区、寡聚化位点及核定位信号区等功能区域。这些功能域决定转录因子的功能、特性、核定位及调控作用等,转录因子通过这些功能域与启动子顺式作用元件结合或与其他蛋白的相互作用来激活或抑制基因的表达。植物转录因子的结构与功能成为近年来植物分子生物学等研究领域的重要内容。     

水稻OsEBP-89基因部分转录本中第1内含子的滞留

OsEBP-89基因是水稻中一个转录因子编码基因。该基因含有两个内含子，采用RT－PCR和Southern杂交等方法的检测结果表明，在OsEBP-89基因的部分转录本中，115bp长的第1内含子未被剪接。从水稻cDNA文库也筛选到了仍然保护有第1内含子的OsEBP-89基因的cDNA克隆。OsEBP-89基因第1内含子不完全剪接的转录本与正常成熟转录本的比例在水稻不同组织中是不同的。这是真核基因中内含子滞留的一个新的例子。     

转录前起始复合物的组装和启动子识别机制

基因转录作为中心法则的关键环节，将遗传信息由DNA传递至RNA，从而指导蛋白质的合成，是生物体最重要的生命活动之一。转录起始过程发生在几万种不同基因的高度多样化的启动子区，启动子区转录前起始复合物(PIC)的装配是转录起始的关键步骤，受到极其复杂的调控，是基因表达调控的核心。数十年来，大量基于TBP-TATA框体系开展的PIC结构和功能研究逐步揭示了基于TBP的PIC在TATA框启动子上的组装机制。近年来，研究显示，人类超过85%基因启动子不含有TATA框，并且几乎所有的基因转录过程都需要TFIID参与，且功能并不能够被TBP所替代。近期，基于TFIID的不同组装阶段的PIC结构和包含+1核小体的复合物结构的研究突破，首次系统地展示了PIC识别不同类型启动子及其在染色质上组装的分子过程，为后续研究基因表达调控提供了理论基础。     

利用EST及生物信息学方法挖掘马铃薯中miRNA及其靶基因

microRNA (miRNA)是一类调控真核基因转录后表达的非编码小分子RNA. 大量研究表明, miRNA在调节生物功能方面起着重要的作用. 目前发现miRNA的主要方法有直接克隆法和基于生物信息学的基因搜索和同源搜索. 由于真核生物组织中有些miRNA的丰度较低, 而且其表达具有组织和时序特异性, 采用直接克隆法发现新的miRNA有时较为困难. 采用生物信息学方法寻找未知miRNA是当前发现和鉴定miRNA的重要策略之一. 本研究联合了几种生物信息学方法预测了马铃薯(Solanum tuberosum)中miRNA及其靶基因. 通过把拟南芥、水稻等植物已知的miRNAs与马铃薯EST数据库进行比对搜索, 筛选出候选的miRNA. 之后, 设置一系列严格的筛选标准, 分析候选miRNA序列特征, 包括碱基错配、二级结构、(A+U)含量、能量水平等. 最后, 从上述候选库中筛选出了22个miRNA. 进一步利用新鉴定的miRNA序列, 预测到43个靶基因. 分析结果表明, 上述大多数靶基因编码的产物为转录因子及重要代谢酶类, 它们调控着植物的生长发育, 信号转导及各种胁迫反应.     

拟南芥防卫基因 PDF1.2启动子中GCC盒应答茉莉素反应必要的顺式作用元件

通过对PDF1.2启动子进行缺失突变和点突变,结合在烟草叶片中的农杆菌瞬时表达,分析了该启动子中应答茉莉素反应的必要顺式作用元件,验证了该基因上游1861 bp的区域具有应答茉莉素反应的功能.通过缺失突变证实了该启动子-300和-234 bp间的区域是该启动子应答茉莉素反应的重要区域.为了进一步阐明此重要区域中的应答茉莉素反应的必需区域,分别对此区域中的GCC盒、类G盒和一个回文序列进行了点突变.在烟草叶片中的瞬时表达分析表明,GCC盒的突变使该启动子丧失了对MeJA的应答,而类G盒和回文序列的突变没有明显的改变该启动子区域对茉莉素的反应,表明GCC盒是PDF1.2基因启动子中应答茉莉素反应的必需顺式作用元件.在此基础上,将含有4次重复GCC盒序列的片段与CaMV 35S的最小启动子序列构建成嵌合启动子.在烟草叶片中,该嵌合启动子可应答茉莉素的诱导反应,表明GCC盒是PDF1.2基因启动子中应答茉莉素反应必要的顺式作用元件.     

水稻肉桂酰辅酶A还原酶基因的克隆与表达分析

用现有的OsCCR 基因片段筛选水稻核DNA文库, 获得了长为3045 bp的核DNA. 它包含4个内含子和5 个外显子, 推测的可读框长为337个氨基酸. OsCCR与其他植物中同类酶在氨基酸水平上有70%的相似性和30%的相同性, 含有保守的辅酶Ⅱ(NADP)结合位点及可能为该酶催化位点的特征序列. Northern杂交证实, 该基因产物广泛存在于水稻根、茎和叶等各组织中, 在茎中表达量较高. 组织原位杂交结果表明, OsCCR 基因在维管束及新生侧根中有强烈的表达信号, 与该基因编码的酶的木质素合成特性相吻合. OsCCR 基因的克隆、组织定位及生物化学方面的研究将有助于深入了解木质素形成的分子机理, 并为通过遗传工程的手段改善植物的机械性能以获得低木质素纸浆原料打下基础.     

粟酒裂殖酵母一个新的box C/D snoRNA的鉴定、功能分析及进化意义

通过筛选粟酒裂殖酵母核内小分子RNA的cDNA文库，获得了一个新的小分子RNA序列。该RNA具有典型的box C/D snoRNA的保守元件和结构特征，并具有一段与25S rRNA互补的、长度为10个核苷酸的反义序列，推测其可指导25S rRNA G940 位点2’-O-核糖甲基化修饰。经dNTP浓度依赖性引物延伸实验验证，G940确实为2’-O-核糖甲基化修饰位点。功能元件比较分析揭示该snoRNA的上游反义序列与酿酒酵母snR60 的下游反义序列同源，故命名为snR60-Ⅱ。snR60-Ⅱ基因位于一个非编码RNA基因的内含子中，其产物由宿主基因转录后的RNA前体加工而来。这是酵母snoRNA由非编码RNA基因内含子编码的首次报道。通过计算机分析，本研究还从真菌和果蝇中分别发现了一批酵母snR60功能同源分子。在不同生物中，snR60存在独立基因编码、内含子编码和多顺反子转录等多种基因组织形式，表明snR60在进化过程中具有高度的移动性。     

HMG1/2和HMG14/17与人ε-珠蛋白基因启动子DNA的相互作用

HMG (high mobility group)蛋白质是真核细胞核内一类含量丰富的非组蛋白, 它们在染色质的结构与功能及基因表达调控中起着重要作用. 应用凝胶电泳阻滞法和体外核小体重组技术, 分析了HMG1/2和HMG14/17与人ε-珠蛋白基因启动子(ε-promoter,-177 ～ + 1 bp) DNA的结合模式. 实验结果表明, HMG1/2能与ε-珠蛋白基因启动子DNA相结合, 而HMG14/17不能与它结合. 将ε-珠蛋白基因启动子DNA在体外组装成核小体后, HMG1/2则不能与组装成核小体的ε-珠蛋白基因启动子 DNA结合, 而HMG14/17却能与之结合. 结果提示, 当 ε-珠蛋白基因启动子DNA处于不同的状态时, 它所结合的HMG蛋白是不同的, 推测它们可能就是通过这种选择性的结合模式而积极参与了人体 ε-珠蛋白基因的表达调控.     

拟南芥防卫基因PDF1.2启动子中GCC盒是应答茉莉素反应必要的顺式作用元件

通过对PDF1.2启动子进行缺失突变和点突变, 结合在烟草叶片中的农杆菌瞬时表达, 分析了该启动子中应答茉莉素反应的必要顺式作用元件, 验证了该基因上游1861 bp的区域具有应答茉莉素反应的功能. 通过缺失突变证实了该启动子-300和-234 bp间的区域是该启动子应答茉莉素反应的重要区域. 为了进一步阐明此重要区域中的应答茉莉素反应的必需区域, 分别对此区域中的GCC盒、类G盒和一个回文序列进行了点突变. 在烟草叶片中的瞬时表达分析表明, GCC盒的突变使该启动子丧失了对MeJA的应答, 而类G盒和回文序列的突变没有明显的改变该启动子区域对茉莉素的反应, 表明GCC盒是PDF1.2 基因启动子中应答茉莉素反应的必需顺式作用元件. 在此基础上, 将含有4次重复GCC盒序列的片段与CaMV 35S的最小启动子序列构建成嵌合启动子. 在烟草叶片中, 该嵌合启动子可应答茉莉素的诱导反应,表明GCC盒是PDF1.2 基因启动子中应答茉莉素反应必要的顺式作用元件.     

家蚕(苏·菊×明·虎)幼虫血清蛋白基因(BmLSP)启动子特性分析

从家蚕品种苏·菊×明·虎基因组DNA中克隆了家蚕幼虫血清蛋白基因(1arval serum protein,Bombyx mori,BmLSP)的调控序列,涵盖了第1内含子、第1外显子、启动子区和上游区.通过PCR技术与限制性内切酶酶切方法,以荧光素酶(luc)为报告基因,构建了一系列缺失不同调控元件的报告质粒,在家蚕BmN细胞瞬时表达系统中进行了BmLSP启动子的特性分析.结果表明,含第1内含子和家蚕丝素轻链基因同源区序列的BmLSP启动子活性分别比缺失相应序列的启动子活性提高5.8和4.4倍,暗示该两段调控序列中含有增强启动子活性的调控元件.上游区失活的部分水手转座子元件对BmLSP启动子活性有一定的抑制作用.此外,外源昆虫保幼激素类似物(JHA)呈现剂量依赖效应,低浓度处理增强启动子活性,高浓度处理起抑制作用;而蜕皮激素(MH)对其活性没有显著影响.     

HMG1/2和HMG14/17与人ε-珠蛋白基因启动子DNA的相互作用

HMG（hihg mobility group）蛋白质是真核细胞核内一类含量丰富的非组蛋白，它们在染色质的结构与功能及基因表达调控中起着重要作用，应用凝胶电泳阻滞法和体外核小体重组技术，分析了HMG1/2和HMG14/17与人ε-珠蛋白基因启动子（ε-promoter,-177～ 1bp）DNA的结合模式，实验结果表明，HMG1/2能与ε-珠蛋白基因启动子DNA相结合，而HMG14/17不能与它结合，将ε-珠蛋白基因启动子DNA在体外组装成核小体后，HMG1/2则不能与组装成核小体的ε-珠蛋白基因启动子DNA结合，而HMG14/17却能与之结合，结果提示，当ε-珠蛋白基因启动子DNA处于不同的状态时，它所结合的HMG蛋白是不同的，推测它们可能就是通过这种选择性的结合模式而积极参与了人体ε-珠蛋白基因的表达调控。     

组蛋白和核小体在基因转录中的作用

有证据表明,染色质和核小体构型的改变在转录的起始中起着重要的调节作用。根据这方面的最新研究进展,结合部分实验结果,初步探讨了以相关问题：（１）转录起始与核小体改构（ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）。评述了两类起不同作用的核小体改构复合体（ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）,一类是具有ＤＮＡ激活的ＡＴＰ酶活性的复合体,它们通过重构核小体的组蛋白核或改变ＤＮＡ     

反义核酸对β-地中海贫血基因(IVS-2-654 C→T)剪接缺陷抑制作用的研究

β-珠蛋白基因第2个内含子(IVS-2)中第654位核苷酸(nt654)C→T剪接缺陷型突变是中国人最常见的β-地中海贫血(简称β-地贫)突变类型之一.我们先前的研究表明,该突变在IVS-2第654位(nt654)上出现的单碱基取代产生了一个新的 GT二核苷酸,它联同旁侧序列构成了一个5＇异常剪接位点,同时还激活了IVS-2第579位(nt579)处3＇隐匿剪接位点,从而将 IVS-2nt580至 nt652之间一段73bp内含子序列作为额外的外显子插入外显子2和外显子3之间,产生了异常的β-珠蛋白mRNA,导致β~ -地贫.为了探讨反义核酸治疗β-地贫IVS-2-654 C→T突变的可能性,我们应用体外转录和体外剪接系统,以体外转录产生的特异反义RNA封闭IVS-2-654 C→T突变基因中3＇隐匿剪接位点和5＇异常剪接位点,使之失去活性,从而减少异常加工的mRNA并且部分恢复了正常剪接途径.     

棉纤维相关cDNA的克隆及其在4个纤维突变体中的结构变异

用ＲＴ－ＰＣＲ方法从陆地棉遗传标准系“ＴＭ－１”的纤维细胞ＲＮＡ中克隆了一种纤维细胞优势表达的ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ,记为ＴＭ－Ｅ６基因）,该基因不含内含子,可读框长为７７１ｂｐ,可编码２４６个氨基酸的多肽。从４个纤维突变体中分别克隆同源性基因,并与野生型“ＴＭ－１”的ＴＭ－Ｅ６基因进行了同源性分析,发现纤维突变体不但在基因结构而且在密码组成上有明显变异。在距转录起始位点的第２７９碱基对处有ＧＧＣＴＣ     

microRNA与靶基因相互调控机制的研究进展

microRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约22个核苷酸的单链非编码RNA分子,其通过剪切信使RNA或非编码RNA、沉默或激活转录、primary mi RNA(pri-miRNA)加工及mRNA翻译,调控几乎所有细胞增殖分化、个体生长发育及内环境稳态.大量研究已对miRNA的生物发生和调控机制进行了清晰阐述.然而,关于miRNA的转换机制,尤其是miRNA在特定条件下的快速变化,仍尚未解决.近年来研究发现,靶基因能以序列依赖性方式调控miRNA的生成和降解,表明miRNA和靶基因之间的调控不是单向的,而是相互调控.本文详细概述靶基因调控miRNA的最新进展,归纳二者相互作用的条件和机制,提出miRNA转换的研究方向,以期为深入研究机体内miRNA与靶基因的相互作用及开发miRNA靶向治疗药物提供理论基础.     

一个编码玉米转译起始因子新基因的克隆

采用DD PCR方法比较玉米杂种一代及其亲本苗期基因表达产物mRNA的差异 ,分离并鉴定出一个玉米杂种一代超亲表达的cDNA .以该cDNA为探针从cDNA文库中筛选到一个全长的cDNA克隆 (ZH0 1) .ZH0 1长 1780bp ,5′端非编码区 112bp ,3′端非编码区 395bp ,开放阅读框共编码 4 14个氨基酸 .序列同源比较表明 ,ZH0 1为一个亲的玉米转译起始因子eIF4A基因家族成员 .     

家蚕(苏·菊×明·虎)幼虫血清蛋白基因(BmLSP)启动子特性分析

从家蚕品种苏·菊×明·虎基因组DNA中克隆了家蚕幼虫血清蛋白基因(larval serum protein, Bombyx mori, BmLSP)的调控序列, 涵盖了第1内含子、第1外显子、启动子区和上游区. 通过PCR技术与限制性内切酶酶切方法, 以荧光素酶(luc)为报告基因, 构建了一系列缺失不同调控元件的报告质粒, 在家蚕BmN细胞瞬时表达系统中进行了BmLSP启动子的特性分析. 结果表明, 含第1内含子和家蚕丝素轻链基因同源区序列的BmLSP启动子活性分别比缺失相应序列的启动子活性提高5.8和4.4倍, 暗示该两段调控序列中含有增强启动子活性的调控元件. 上游区失活的部分水手转座子元件对BmLSP启动子活性有一定的抑制作用. 此外, 外源昆虫保幼激素类似物(JHA)呈现剂量依赖效应, 低浓度处理增强启动子活性, 高浓度处理起抑制作用; 而蜕皮激素(MH)对其活性没有显著影响.     

高粱光调控基因psbA5′-末端非编码区的结构特征分析

高等植物光系统Ⅱ反应中心蛋白Q_B的编码基因psbA,是一种重要的光调控基因,其控制光效表达的DNA单元是位于5′-上游的启动子区域。该基因的启动区结构虽然同大肠杆菌的十分类似,都具有一个“-10”元件和一个“-35”元件,但最近在有些植物中也观察到,在这两个元件之间还有一个类似真核“TATA”盒的保守序列。     

TNV-A~C亚基因组表达及基因编码产物对局部枯斑症状的影响

利用烟草坏死病毒A中国大豆分离物(Tobacco necrosis virus A Chinese isolate,TNV-AC)的全长侵染性cDNA克隆构建系列突变体进行体外转录.在枯斑寄主苋色藜(Chenopodium amaranticolor)上的侵染性检测结果表明,TNV-AC亚基因组RNA1的转录起始位点位于基因组RNA的G2184,亚基因组RNA2的转录起始位点位于基因组RNA的G2460.进一步分析表明,亚基因组RNA1中p8和p6基因的翻译灭活突变可导致病毒在苋色藜上的侵染症状消失,但不影响病毒在烟草原生质体中的复制,说明p8和p6基因产物可能影响病毒在细胞之间的移动,是病毒造成枯斑所必需的基因.通过原核表达产物分析,证明了亚基因组RNA2中外壳蛋白(coat protein,CP)基因的可读框起始于基因组RNA的2612~2614位AUG.CP可读框核苷酸替换或缺失突变分析表明,完整的CP蛋白虽不是病毒建立侵染所必需的,但其翻译起始密码子区域的核苷酸序列保守性及可读框核酸序列的完整性对病毒侵染苋色藜后产生枯斑的数量、显症时间和病毒RNA的积累量具有明显影响.综合以上结果,对TNV-AC的cp基因在侵染枯斑寄主苋色藜过程中的其他功能进行了讨论.