JWA参与维甲酸、佛波酯和三氧化二砷诱导急性早幼粒细胞性白血病细胞分化和凋亡的可能机制

JWA基因是受维甲酸（RA）、13顺－维甲酸（13－cRA）和佛波酯（TPA）等调控的细胞骨架相关基因，以前的研究发现，JWA基因与细胞分化和凋亡有关，为了探讨JWA基因在急性早幼粒细胞性白血病（APL0细胞分化和凋亡过程中的作用及机制，分别用ATRA，4HPR，TPA和As2O3处理NB4细胞，Westernblot和RT0RCR检测JWA基因在蛋白和mRAN水平的表达，同时检测细胞周期和CD11b，CD33细胞表面抗原，分析细胞分化和凋亡，结果ATRA和As2O3分别诱导细胞分化和凋亡，而4HPR和TPA对NB4细胞分化和凋亡有双重诱导作用，在诱导细胞分化和凋亡过程中，JWA基因的表达水平均上调，但PML／RARα融合基因变化不明显，用JWA反应核酸处理NB4细胞后，TPA诱导其分化和凋亡的作用受到明显抑制，TPA对NB4的作用可能是通过由JWA参与的直接和间接两种途径实现的，在对APL（M3）原代细胞的研究中除观察到NB4细胞相似的JWA的变化外，还发现一特异的与APL细胞分化和凋亡有关的异常分子量的JWA蛋白；异常分子量的JWA蛋白是否是APL（M3）区别于NB4细胞的一种分子植物志以及JWA是否通过caspases信号调节通路参与NB4细胞分化和凋亡等均有待进一步研究证实。     

信号转导与细胞癌变

细胞内存在两类调节细胞生长的基因-生长促进基因（即原癌基因或细胞癌基因）和生长抑制基因（抗癌基因和诱导终端分化基因），这些基因编码生长因子（或其受体）、蛋白激酶、某些酶类、鸟苷酸结合蛋白（G蛋白）、转录调节因子以及其他在信号转导中起重要作用的蛋白组分，这些基因的突变或表达异常导致其编码蛋白（癌蛋白、抗癌蛋白）数量或功能异常，引起细胞生长调控紊乱，无限生长、增殖，最终导致细胞癌变，因此，研究认号转导机制对于阐明细胞癌变的化学本质具有重要意义。     

一个新的元件(NIRS)参与白介素2受体α 基因的调控

为研究白细胞介素2受体α亚基（IL－2Rα）基因中与负调控元件NRE（－391／－381bp）呈反向重复的序列NIRS（－153／－143bp）在该基因表达中的作用，通过检测Jurkat细胞及HeLa细胞中荧光素酶报告基因活性，发现NIRS与NRE不仅共同阻遏IL－2Rα基因的组成性表达，还共同参与介导RHA对该基因启动子的诱导活性。EMSA检测显示，激活前后的Jurkat细胞及HeLa细胞中均含有双链NIRS和双链NRE的结合蛋白；HeLa细胞中还含有与这两个序列结合的单链结合蛋白；但是，激活前后的Jurkat细胞抽提物分别加入HeLa细胞抽提物与单链DNA的结合体系中均能产生超迁移现象，其中活化细胞抽提物呈现较强的迁移结合带，紫外交联实验检测发现，在激活前后的Jurkat细胞和HeLa细胞中均存在双链DNA结合蛋白p83。结果显示，不同细胞中，反式作用因子能通过NRE和／或NIRS元件以及单、双链DNA的选择性对IL－2Rα基因启动子活性起关键调控作用。     

衣藻肌动蛋白-绿色荧光蛋白的融合基因在烟草悬浮细胞中的表达及融合蛋白的体外聚合

将衣灌（Chlamydomonas reinhardtii)肌动蛋白（actin）基因(cDNA)与绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP)基因融合后，分别构建到原核和植物表达载体中，并在BL21plus细菌和烟草悬浮细胞（BY-2）中进行表达。通过荧光显微镜观测到重组后的融合蛋白在菌体和烟草悬浮细胞中得到正确表达。肌动蛋白-绿色荧光蛋白 的融合蛋白主要分布在烟草悬浮细胞细胞膜周围，参与膜骨架的组成，另外还大量分布于细胞核周围和细胞板的位置，同时也在细胞内形成丝状结构，参与F-actin的组成。将肌动蛋白-绿色荧光蛋白融合基因的原核表达产物经过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析和疏水柱层析后，得以纯化，并在纯化产物中加入肌动蛋白聚合缓冲液，纯化的肌动蛋白能聚合成为丝状结构即F-actin，这表明低等藻类的肌动蛋白具有同高等植物和动物相似的性质和功能。     

蜂毒新多肽部位BVⅠ-2H的分离纯化及其生物学活性

利用蜂毒治疗类风湿性关节炎（RA）已有悠久的历史，并取得了良好的治疗效果，为研究其抗炎机制及确定有效的抗炎成分，利用凝胶过滤层析、肝素和柱层析、高效液相色谱等方法分离蜂毒多肽，并观察蜂毒多肽对小鼠淋巴细胞细胞周期、细胞因子合成及Iκβα蛋白磷酸化的影响。高效液相色谱检测分离得到的蜂毒多肽BV I－2H为单一对称峰，电喷雾质谱检测结果表明BV I－2H是蜂毒多肽混合物，其主要成分的分子量为644．8u。BV I－2H可抑制 ConA诱导的上鼠脾淋巴细胞增殖和IL－1合成，可使ConA诱导的脾淋巴细胞呈现明显的G2／M期阻滞。此外，BV I－2H可抑制PMA诱导THP－1细胞合成TNFα，抑制TNFαmRNA的表达及Iκβα蛋白磷酸化。实验结果提示，蜂毒多肽BV I－2H是蜂毒发挥抗炎作用的重要组成部分。     

转基因烟草分析COP1亚细胞定位及各结构域的功能

植物体内存在着非常精巧的光信号调节系统以适应外界光环境的变化，COP1蛋白是这个调节系统中介导光信号转导的一个关键因子。利用从豌豆克隆的COP1的cDNA，根据豌豆COP1的蛋白结构设计了4种不同的结构域基因片段，构建了这4个片段及COP1全基因与GFP融合基因的植物表达载体，通过根癌农杆菌分别转化烟草。利用由原核表达的GFP－COP1融合蛋白制备的抗体和GFP基因片段制成的放射性探针，通过Southern和免疫印迹实验证实各种外源融合基因在转基因烟草中均获得了组成型的变化，发现：（1）烟草内源COP1的分子量为76ku，在各器官组成型存在，光照条件对其含量影响不大；（2）COP1的细胞核定位域在其核－质分配的调节中起着关键作用。含有核定位域的目的蛋白在叶表皮细胞中的亚细胞定位受光调节，而在根细胞则组成型定位于细胞中；（3）Couiled-coil域对COP1的功能十分重要，而锌指结构域起辅助作用；（4）WD－40重复结构域起着关键作用，但单独的WD－40重复结构域不影响光形态发生；（5）过量表达COP1不仅导致烟草地上部分光形态发生受抑制，而且还导致短的簇生根发生。相反，过量表达不含WD－40重复结构域的COP1则促进地上部分光形态发生，并导致根部伸长，但无侧根。COP1－COP1相互作用不仅可以在细胞核中发生，而且可在细胞质中发生。这一实验系统为今后深入研究COP1的结构与功能打下了一个良好的基础。     

NF-L和NF-M在上皮细胞内表达并与角蛋白或波形纤维蛋白共组装

神经丝及细胞质角蛋白纤维都是异源多聚体，它们只有在与其他合适的中间丝蛋白亚基一起表达时才能装配成中间丝。为了研究不同类型的中间丝蛋白间的组装特性，构建了绿色荧光蛋白（GFP）与NF－L或NF－M融合蛋白的重组腺病毒表达载体，并将目的基因在vero细胞内表达，免疫荧光观察结果显示NF－L－GFP或GFP－NF－M不但能与细胞内源性波形纤维蛋白共组装，而且同样能掺入到角蛋白纤维网络中。     

同源于hMIP-1α的vMIPα对人趋化因子受体的作用

HIV感染靶细胞须以人CD4^ 白细胞膜上的趋化因子受体为共受体，与此共受体结合的趋化因子类似物可阻HIV进入靶细胞。实验目的是了解与人趋化因子单核细胞炎性蛋白-1α（MIP-1α）同源的人疱疹病毒8K6基因编码产物vMIPα是否具有结合人趋化因子受体的功能。首先用蛋白质同源分析及蛋白空间结构模拟等对比vMIPα与人趋化因子的结构异同，用PCR扩增出K6片段，克隆于哺乳类细胞表达载体，转染于NIH3T3细胞，得到条件培养液。然后将K6基因在大肠杆菌中表达，得表达产vMIPα。结果显示转染K6的NIH3T3细胞含有vMIPα单一分子量的mRNA，此转染细胞的条件培养液及大肠杆菌表达纯化的vMIPα可与人趋化因子^125I-hMIP-1α竞争结合外周血单核细胞的CCR5受体，而且此条件培养液及vMIPα不引起外周血单核细胞对ICAM-1的黏附反应。研究证实K6编码产物vMIPα与CCR5培养液及vMIPα不引起外周血单核细胞对ICAM-1的黏附反应。研究证实K6编码产物vMIPα与CCR5结合但不引起细胞黏附反应，即封闭HIV的CCR5共受体，提示有用于防治HIV/艾滋病的可能性。     

表达人类Bcl-2蛋白的L929细胞模型的建立与应用

将人类ｂｃｌ－２ ｃＤＮＡ以正向克隆于真核表达载体ｐＬＸＳＮ并转染于Ｌ９２９细胞，建立了稳定表达人类Ｂｃｌ－２蛋白的哺乳类细胞模型，利用模型细胞进行研究表明，Ｂｃｌ－２的表达对细胞的正常增殖与存活表型无明显影响，但能增加细胞对肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）和ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ（ＳＴＳ）两种致凋亡因素的抵抗能力。此研究丰富了ｂｃｌ－２基因调控细胞凋亡的资料，为深入探讨ｂｃｌ－２的作用机制及其与其     

拟南芥根特异表达转录因子AtMYB305的鉴定及功能研究

AtMYB305是拟南芥MYB基因家族的成员之一，对其蛋白结构和DNA结合活性进行了分析鉴定，并对其表达特征和细胞内功能作了初步分析。AtMYB305含R2和R3的两个重复序列及MYB蛋白特有的其他氨基酸组成，凝胶阻滞实验证明，GST－AtMYB305融合蛋白能与含有MYB识别位点（TAACTG）的DNA片段发生特异结合。在裂殖酵母中过量表达AtMYB305蛋白产生单核长细胞，其染色体异常凝缩，半定量RT－PCR分析表明AtMYB305基因在拟南芥的根器官中特异表达。     

猪鼻支原体蛋白P37诱导人外周血单核细胞释放肿瘤坏死因子

胃癌组织中存在较高的猪鼻支原体感染率, 提示猪鼻支原体感染同胃癌的发生可能存在某种相关性. 由于肿瘤坏死因子(TNF-α)在微生物感染导致肿瘤发生中起重要作用, 而P37蛋白是猪鼻支原体的主要免疫原, 因此, 探讨P37能否诱导TNF-α的表达与释放, 对阐明猪鼻支原体在胃癌发生中的可能分子机制有重要意义. 运用PCR技术克隆了p37基因, 在对其编码序列中7个色氨酸密码子TGA进行TGG定点突变后, 利用PGEX-4T-1表达载体在大肠杆菌中成功表达了P37蛋白, 并经Western blot得到证实. 在此基础上, 利用RT-PCR及TNF-α敏感细胞株L929的细胞毒性实验, 发现P37确能诱导外周血单核细胞表达和释放TNF-α, 抗P37单克隆抗体PD4对该诱导活性有明显的中和作用. 结果提示, 猪鼻支原体通过P37诱导TNF-α产生在猪鼻支原体感染所致相关疾病中可能起重要作用, 值得进一步研究.     

海灰翅夜蛾核型多角体病毒P49蛋白的表达及其抑制细胞凋亡的机制

一个新克隆的海灰翅夜蛾核型多角体病毒（SINPV）的p49基因可抑制病毒感染引起的昆虫细胞Sf9的凋亡。用杆状病毒表达系统表达的P49蛋白的氨基酸序列与推导的氨基酸序列致，证明p49基因编码序列经克隆后能够正确表达。体内标记显示，p49基因在感染早期及晚期均可表达，以多角体基因启动子驱动p49基因的表达只是在晚期，但表达量明显高于wtSINPV合成的P49蛋白。研究结果证实，SINPV的p49基因像其他杆状病毒的凋亡抑制基因（p35)一样也是一个早期基因，但在晚期也可表达，与多角体基因启动子比较，p49基因的启动子是一个较弱的启动子。P49蛋白在体外可被人Caspase及家蚕Caspase所切割，切割后均产生约10和40ku的2个片段。P49蛋白又可明显抑制人Caspase-及家蚕Caspase对其特异底物的切割，证明P49的凋亡抑制与下游Caspase有关。     

JAK3介导白细胞介素-2对c-myc基因表达的诱导

白细胞介素-2(IL-2)与其靶细胞表面的IL-2受体(IL-2R)相互作用并诱导c-myc基因表达,这一过程与IL-2刺激T淋巴细胞增殖有关,但其具体机制与过程还不明了。IL-2受体由α,β,γ3亚基组成。其中α亚基可提高受体与IL-2的亲和力,而β,γ亚基与信号转导有关。有些实验认为,与IL-2R γ胞内域结合的非受体型酪氨酸激酶JAK3可能介导了IL-2对c-myc基因表达的诱导,但缺乏直接证据。为了直接验证JAK3参与了这一过程,我们构建了一个嵌合受体基因IL-2R α/γ/△NJAK3,其胞外域来自白细胞介素-2受体α亚基(IL-2Rα),跨膜部分来自IL-2R γ,胞内域来自JAK3催化功能域(△NJAK3)。将此嵌合受体转入已经稳定表达IL-2R β的小鼠成纤维细胞L929(L929 β)中,筛选到稳定表达IL-2R β和IL-2R α/γ/△NJAK3的细胞株L929 β α/γ/△NJAK3。IL-2作用于此转基因细胞株可以诱导c-myc基因表达。由于在这个系统中,没有IL-2R γ胞内域,从而排除了结合于IL-2R γ胞内域的其他分子的干扰,因此这个实验结果为JAK3在IL-2诱导c-myc基因表达中起重要作用提供了直接证据。     

反义CENP-B对HeLa (Tet-off)细胞增殖状况的影响

为了检测反义转染引起的细胞着丝粒蛋白CENP－B表达的变化情况，用原核表达的融合蛋白GST－CENP－B免疫Balb/c小鼠，制得抗CENP－B的鼠抗血清（MaCenpB）。转染了含有反义CENP－B表达载体pBI-EGFP-as-CenpB的HeLa-Tet-off细胞（HaCb），用Northern blot和Western blot研究了转染后细胞内源CENP－B基因表达的抑制情况，生长曲线表明，反义CENP－B抑制HeLa(Tet-off）细胞增殖，使倍增时间延长了32.8h流式细胞光度术分析表明，较之HeLa（Tet-off）细胞，HaCb的G1期比例增加（△G＝9％），S期比例减少（△S＝11％）。同时，有丝分裂指数（MI）大大降低；间接免疫荧光分析表明，HaCb的着丝粒组装受到抑制。这说明，CENP－B的正常表达对于细胞的增殖是必要的。     

异三聚体G蛋白在细胞外钙调素调控rbcS基因表达中的作用

以转基因烟草悬浮培养细胞为材料，对异三聚体Ｇ蛋白在胞外钙调素（ＣａＭ）促进ｒｂｃＳ基因表达跨膜信号转导中的作用进行了研究．细菌毒素实验表明，Ｇ蛋白激活剂ＣＴＸ可以促进转基因烟草ｒｂｃＳ基因表达，而其抑制剂ＰＴＸ则抑制ｒｂｃＳ基因表达；同时证实ＣＴＸ可以恢复被ＣａＭ抗血清抑制的ｒｂｃＳ基因表达，而ＰＴＸ可以抑制外源ＣａＭ促进的ｒｂｃＳ基因表达，通过提纯包埋有ＧＴＰａｓｅ活性测定荧光底物的正向型质膜囊     

泛素-蛋白水解酶复合体通路对小鼠围植入期子宫血管内皮生长因子及其受体表达的影响

以小鼠宫角注射为动物模型，用0．1μgmL lactacystin抑制子宫中泛素－蛋白水解酶复合体通路，检测小鼠围植入期（妊娠第5－7天）子宫胚胎植入数量变化以及血管内皮生长因子（VEGF）及其受体（Flt-1和Flk01)的表达变化，结果表明，抑制泛素－蛋白水解酶复合体通路后，小鼠胚胎植入数量显著下降，半定量RT－PCR及Western blot结果显示，注射lactacystin除引起子宫中VEGF及其受体mRAN和蛋白表达显著降低外，也使VEGF转录调节因子HIF－1的α亚基（HIF－1α）mRNA及蛋白表达降低，以上结果表明泛素－蛋白水解酶复合体通路可能通过调节HIF－1α而影响VEGF的表达，同时该通路也参与VEGF受体的表达调控，这可能是影响小鼠胚胎植入的原因之一。     

水稻Bowman-Birk蛋白酶抑制剂基因OsWIP1-2的诱导表达及其抑制活性

克隆了水稻的WIP1基因, 该基因属于Bowman-Birk蛋白酶抑制剂(BBI)家族. RNA杂交实验结果显示该基因的表达受伤害和茉莉酮酸的诱导, 表明它在植物防御反应中起着重要的作用. 将此基因克隆到表达载体pET28a, 并在大肠杆菌中表达融合蛋白. 分别用胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶为底物检测纯化的融合蛋白的抑制活性, 发现融合蛋白具有胰凝乳蛋白酶的抑制活性, 但没有对胰蛋白酶的抑制活性; 同时发现融合蛋白C端的融合残基对蛋白酶抑制活性有重大影响, 具有C端(His)₆纯化标签的融合蛋白不具有胰凝乳蛋白酶的抑制活性, 而有天然C端序列的融合蛋白具有胰凝乳蛋白酶的抑制活性, 这暗示了过长的C末端序列可能会影响WIP1蛋白的正确折叠. 蛋白酶抑制活性分析表明水稻Bowman-Birk抑制剂家族的成员可能在结构和功能上均发生了分化.     

中国小麦花叶病毒RNA2外壳蛋白通读区及19 ku 富半胱氨酸基因的克隆、表达及其编码蛋白定位表达及其编码蛋白定位

应用RT－PCR扩增中国小麦花叶病毒（CWMV）外壳蛋白通读区（readthrough，RT）5′端（RTn）和3′端（RTc）及19ku的富含半胱氨酸蛋白基因，分别克隆并在E.coli中表达，表达蛋白粗提纯后免疫小鼠，制备相应的抗血清和单克隆抗体，用各种抗体检测小麦病叶汁液中RTn,RTc和19ku蛋白。结果表明，RTn和RTc分布在病叶细胞中的CWMV病毒粒子表面，而19ku蛋白则均匀分布于细胞质中。     

蜂毒新多肽部位BV I-2H的分离纯化及其生物学活性

利用蜂毒治疗类风湿性关节炎(RA)已有悠久的历史,并取得了良好的治疗效果.为研究其抗炎机制及确定有效的抗炎成分,利用凝胶过滤层析、肝素亲和柱层析、高效液相色谱等方法分离蜂毒多肽,并观察蜂毒多肽对小鼠脾淋巴细胞细胞周期、细胞因子合成及IκBα蛋白磷酸化的影响.高效液相色谱检测分离得到的蜂毒多肽BV I-2H为单一对称峰,电喷雾质谱检测结果表明BV I-2H是蜂毒多肽混合物,其主要成分的分子量为644.8 u.BV I-2H可抑制ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖和IL-1合成,可使ConA诱导的脾淋巴细胞呈现明显的G2/M期阻滞.此外,BV I-2H可抑制PMA诱导THP-l细胞合成TNFα,抑制TNFαmRNA的表达及IκBα蛋白磷酸化.实验结果提示,蜂毒多肽BV I-2H是蜂毒发挥抗炎作用的重要组成成分.     

红细胞分化相关基因EDRF6抑制K562细胞中α—珠蛋白基因的表达

EDRF2是一个红细胞分化相关因子，它在分化后的K562细胞中被诱导表达。Northern blot结果显示。EDRF2全长mRNA约500bp。利用RACE技术，成功扩增了EDRF2 mRNA完整的5‘－和3‘－末端。EDRF2正义和反义cDNA在K562细胞中稳定表达。Northern blot分析表明，EDRF2能抑制α－珠蛋白基因的表达，而对γ－珠蛋白基因的表达没有明显的调节作用。凝胶阻滞电泳的结果显示，EDRF2对GATA－1，NF－E2和APl(c-Jun/c-Fos)等转录因子的DNA结合活性没有明显的调控作用。GATA－1的负调控因子PU。1表达被EDRF2上调，提示EDRF2很可能是红细胞分化的负调控转录因子，与PU．1协同作用，下调α－珠蛋白基因在K562细胞中的表达。