结核分枝杆菌临床分离株链霉素耐药性的检测及耐药基因突变位点分析

为检测结核分枝杆菌链霉素(streptomycin,SM)耐药性,分析耐药基因突变,探讨DNA测序分析技术在结核分枝杆菌链霉素耐药性检测中的应用价值。采用方法:1、用传统的比例法药敏试验对49株结核分枝杆菌临床分离株进行链霉素耐药性检测。2、用DNA测序分析技术对49株结核分枝杆菌临床分离株进行链霉素耐药相关基因Rpsl和rrs的突变位点分析,筛查耐药相关突变位点。3、探讨DNA测序分析技术对结核分枝杆菌临床分离株进行链霉素耐药性检测的效率。结果:1、传统比例法药敏试验结果显示,49株实验菌株中16株为链霉素耐药株,33株为链霉素敏感株。2、Rpsl基因DNA测序。结果显示:Rpsl基因只存在一个突变位点,为第43位密码子AAG的突变,突变形式为AAG→AGG,氨基酸由赖氨酸(Lys)变为精氨酸(Arg)。rrs基因DNA测序结果发现:rrs基因共存在5个突变位点,分别为第513位碱基A突变为G、第523位碱基A缺失、第598位碱基A突变为G、第599位碱基A缺失、第612位碱基A缺失,其中第513位碱基突变只存在于链霉素耐药株中,其余4个突变位点在耐药株和敏感株中均存在。即初步认为Rpsl基因第43位密码子的突变及rrs基因第513位碱基的突变与结核分枝杆菌链霉素耐药性有关。3、分析Rpsl基因和rrs基因突变与结核分枝杆菌链霉素耐药性之间的关系,结果显示:16株链霉素耐药株中13株存在Rpsl基因第43位密码子的突变,1株存在rrs基因第513位碱基的突变。以传统的比例法药敏结果为参照,以DNA测序分析Rpsl基因或rrs基因发现Ppsl基因发生第43位密码子或rrs基因第513位碱基突变为判断菌株耐药的标准,DNA测序分析技术对结核分枝杆菌链霉素耐药性检测的敏感性为87.5%,特异性为96.97%。由此可知,初步认为Rpsl基因第43位密码子的突变及rrs基因第513位碱基的突变与结核分枝杆菌链霉素耐药性有关。用DNA测序分析结核分枝杆菌Rpsl基因和rrs基因链霉素耐药相关突变,判断结核杆菌链霉素耐药性具有较好的灵敏度和特异性,耗时短,在链霉素耐药结核病的快速诊断方面具有一定的应用价值。     

芯片法和培养法对结核分枝杆菌耐药检测的对比研究

选取临床疑似结核病患者聚合酶链反应(PCR)检测阳性标本,分别用芯片法和培养法检测其耐药性以探讨这2种方法对结核分枝杆菌耐药检出率的差异.实验中共选取了228例标本,以异烟肼和利福平为研究对象,利用芯片法和培养法分别统计了样本对这两种药物的耐药性.研究结果表明芯片法和培养法对异烟肼耐药检出率存在统计学差异(P0.05),对利福平耐药检出率没有统计学差异(P0.05).与培养法相比,芯片法有效缩短了对利福平耐药检出率的检测时间,具有快速简便等优点,但对异烟肼耐药检出率存在一定差异.     

结核分枝杆菌耐药检测进展

目前全球结核病发病率明显回升,其中耐多药(MDR)结核是本病上升的主要原因之一。对结核分枝杆菌的耐药性检测方法从细菌学方法、噬菌体扩增法、基因检测、变形高压液相色谱、发光技术等方面的进展进行了概述。     

单因子和正交设计法建立分枝杆菌多重PCR体系

为了建立一种快速区分鉴定结核与非结核分枝杆菌的多重PCR方法,以分支杆菌属特异基因32kD,结核分枝杆菌种特异基因MTP40和结核分枝杆菌复合群特异基因IS6110为目标基因,设计合成3对特异性引物,以结核分枝杆菌标准株DNA为模板,通过对PCR反应体系中DNA模板浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和TaqDNA聚合酶浓度5个因素的正交设计,以及PCR反应条件中各反应参数的优化,建立了鉴别分支杆菌的多重PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性进行了验证。结果显示:该方法对结核分枝杆菌标准株H37Ra能扩增出506、396和984bp,对卡介苗(BCG)能扩增出506和984bp片段,对禽分支杆菌、胞内分支杆菌、偶发分支杆菌、耻垢分支杆菌、龟分支杆菌能够扩增出506bp片段,对大肠杆菌等的扩增结果均为阴性。建立的多重PCR敏感度最低可检出6.6×10-6 ng。结论:该方法具有特异性高、敏感性好等特点,可用于奶牛结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的鉴别诊断。     

结核分枝杆菌耐链霉素与rpsL和rrS基因的相关性研究

为探讨新疆地区结核分枝杆菌对链霉素(streptomycin,STR)产生耐药性的分子机制,建立直接快速检测结核杆菌STR药物敏感性的方法.应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)银染分析技术,检测62株结核杆菌临床分离株链霉素耐药性及rpsL和rrS基因变异情况,以结核分枝杆菌标准株(H37Rv)为对照.结果发现62株结核杆菌临床分离株中,32株STR敏感株的rpsL和rrS基因未见SSCP泳动异常,30株STR耐药株中,23株(76.7%)中rpsL(21株)和rrS(5株)基因出现SSCP泳动异常,并且3株出现了rpsL和rrS双基因的SSCP泳动异常.因此,rpsL和rrS基因突变可能是结核分枝杆菌对链霉素产生耐药性的重要分子机制,PCR-SSCP银染技术可作为快速检测结核杆菌STR药物敏感性的方法.     

液相芯片快速检测结核耐药基因方法建立

基于Luminex100^TM技术平台,结合多重PCR技术,以5’生物素标记引物为信号指示,在H₉37)RV结核标准株做对照下,对104株结核分枝杆菌分离株的LFP耐药rpoB基因和INH耐药的katG,inhA基因进行检测,并与药敏试验绝对浓度法和测序结果比较.结果表明:液相芯片检出结果与药敏法比较,104株分离株中LFP、INH、多重耐药的检出结果分别为:液态芯片检测73株、50株、48株;药敏检测结果为74株、58株、53株;对比检出率98.6%,86.2%,90.6%.液相基因芯片技术对耐药,耐多药结核的检测,具有特异性高,敏感性强的特点,是检测结核分枝杆菌耐药基因的有效方法,可用于临床检测.     

西藏拉萨地区198株结核分枝杆菌耐药性分析

目的：了解拉萨地区结核分枝杆菌对抗结核药物的耐药情况,为临床合理用药提供参考依据。方法：采用WHO推荐的比例法对分离自西藏拉萨地区肺结核患者的198株结核分枝杆菌进行4种抗结核药物（RFP、INH、SM、LVX）的药物敏感性试验。结果：198株结核分枝杆菌中耐药菌株有125株,总耐药率为63.1%（125/198）,总耐多药率为29.8%（59/198）,初治耐药率为55.1%（64/116）,复治耐药率为75.4%（40/53）,初治耐多药率为20.7%（24/116）,复治耐多药率为56.7%（30/53）。对RFP、INH、SM、LVX的耐药率分别为36.3%（72/198）、41.9%（83/198）、41.4%（82/198）和7.0%（14/198）。结论：西藏拉萨地区临床结核分枝杆菌耐药情况较为严重,应加强临床结核分枝杆菌耐药性监测,指导临床用药以防控耐药菌的产生。     

运用反向斑点杂交技术检测四川地区结核分枝杆菌katG基因315位点的突变

为了检测四川地区结核分枝杆菌KatG基因315位点的突变特点,并建立耐异烟肼结核分枝杆菌快速检测方法。运用反向杂交技术检测四川地区65株耐异烟肼和10株异烟肼敏感结核分枝杆菌KatG基因315位点的突变,并用DNA直接测序法验证杂交结果。结果显示在65株耐异烟肼结核分枝杆菌中,发现41株在KatG基因315位点发生突变,突变率最大的是AGC→ACC,占90％,其次是AGC→AAC和AGC→ATC突变。DNA序列测定结果进一步验证了反向杂交的结果。运用反向杂交技术检测四川地区结核分枝杆菌KatG基因315位点的突变的检出率和特异性分别是63％和100％。反向斑点杂交技术能快速有效地检测四川地区结核分枝杆菌KatG基因315位点的突变。     

徐州地区结核分枝杆菌耐多药、广泛耐药情况调查

目的:分析徐州地区结核分枝杆菌(MTB)临床分离株对一、二线抗结核药物耐药情况,了解本地耐多药结核(MDR-TB)、广泛耐药结核病(XDR-TB)所占比例。方法:对627例涂阳肺结核患者的痰标本采用改良罗氏培养法进行结核分枝杆菌培养,同时对培养出的MTB分别进行异烟肼(H)、利福平(R)、链霉素(S)、乙胺丁醇(E)、丁胺卡那霉素(Amk)、左氧氟沙星(Lfx)药物敏感性试验。结果:比例法检测627株MTB分离株中,单耐63例,多耐28例,耐多药125例,广泛耐药18例。结论:徐州地区耐药情况严重,尤其耐多药、广泛耐药结核病比例较高,为本地区结核病控制增加难度。     

结核分枝杆菌的抗逆性与致病性研究进展

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)复合群感染导致的人畜共患传染病,在新型冠状病毒感染暴发前是全球死亡人数最多的单一传染病。结核病致死率高,主要原因是其致病菌结核分枝杆菌具有极强的毒力且可以抵御多种外界环境胁迫因子。本文主要介绍结核分枝杆菌对理化胁迫的耐受性,以及结核分枝杆菌的耐药性、致病性与免疫性,为深入研究结核病的发病机制和研发新型的抗结核药物提供理论指导。     

北京市63例耐多药肺结核患者特征及治疗情况分析

为了发现现行诊疗方案中可能影响MDR-TB患者治疗依从性及成功率的因素,对2016年3月-2019年11月北京市结核病控制研究所收治的90例DR-TB患者耐药结果、病人特征、治疗选择及临床转归进行统计分析。结果显示：90例DR-TB患者中,63例为MDR-TB,3例为XDR-TB;复治患者多于初治患者（5.3:1）;除INH,RFP外,以对SM耐药率最高（85.71%）,组合耐药以耐INH+RFP+SM病人占比最多（36.51%）;65.08%的MDR-TB患者接受了进一步的抗结核治疗;接受抗结核治疗的患者,50%痊愈;不同性别,年龄,登记类型及抗结核用药史的患者接受进一步抗结核治疗率及治疗完成率之间未发现显著差异;MDR-TB患者抗结核治疗治愈平均时间为739.76天;MDR-TB患者中复治患者比例较高;除耐INH、RFP外,多合并其他药物耐药;患者进一步治疗的比例不高,治疗完成率不高,治疗周期较长。针对MDR-TB患者的治疗,有必要强调治疗前进行药物敏感性检测,根据药敏结果及患者类型制定个性化治疗方案;按照新药分组选药,提高患着治疗依从性及成功率。     

体外抗真菌药敏试验多量与微量稀释法对比研究

目的 对比研究酵母菌的体外抗真菌药敏试验多量与微量稀释法。方法 采用美国国家临床试验标准化委员会（NCCLS）推荐的药敏试验方案的多量稀释法和微量稀释法,分别测定45株念珠菌（包括来自国外AIDS患者的28株氟康唑耐药株,15株国内临床分离株和2株ATCC模式株）对氟康唑的最小抑菌浓度（MIC）值。结果 采用NCCLS推荐的多量稀释法与微量稀释法测定45株念珠菌对氟康唑的MIC值一致为91％。结论 体外抗真菌药敏试验的多量稀释法与微量稀释法有较好的一致性,微量稀释法可以做为一种较好的体外抗真菌药敏试验方法在临床实验室推广使用。     

流动注射化学发光同时测定利福平和异烟肼

提出了一种基于人工神经网络的流动注射化学发光同时测定利福平(RFP)和异烟肼(INH)的新方法:在碱性条件下RFP和INH均可定量还原N-溴代丁二酰亚胺(NBS)产生化学发光,而二者的反应动力学光谱不同.通过测量不同反应时间的化学发光强度,用人工神经网络(ANN)建立校正模型并进行预测可同时测定RFP和INH.相比较已报道的同时测定RFP和INH的方法,本方法具有灵敏度高,简单快速等优点,并已成功地用于药物合剂中RFP和INH的同时测定.     

尘肺结核患者Mycobacterium tuberculosis耐药基因突变研究

研究尘肺结核患者结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)耐药基因突变与耐药性的关系。在97例尘肺结核患者痰中检出MTB菌株28株,采用PCR-SSCP法检测katG、rpoB和rpsL基因突变,并与采用常规药敏试验(AST)法检测的耐药结果进行对比分析。采用PCR-SSCP法检测katG、rpoB和rpsL基因,突变率分别为42.86%(12/28)、42.86%(12/28)和32.14%(9/28),采用AST法检测INH、RFP和SM,耐药率分别为64.23%(18/28)、60.71%(17/28)和53.57%(15/28),两者之间差异均无显著性(P>0.05)。其中多耐药株20例(71.43%),包括耐三种药物12例(42.86%),耐两种药8例(28.57%),单耐药株6例(21.43%),敏感株2例,耐药率92.86%。PCR-SSCP法检出3个基因联合突变8株,与AST法符合率为66.67%(8/12);2个基因突变5株,符合率为62.50%(5/8);单基因突变2株,符合率为33.33%(2/6)。结果表明:PCR-SSCP技术适用于MTB katG、rpoB和rpsL耐药基因突变的筛选,对指导尘肺结核患者临床用药上具有重要意义。     

MDF甲醛释放量评价新方法的研究

研究了MDF甲醛释放量两种评价方法（干燥器法和穿孔法）的关系，通过对不同测试条件下用干燥器法对MDF甲醛释放量进行检测，其结果用穿孔法的检测结果进行对比和检验。用穿孔法的ms／100g为单位表达检测数据，能结合两种梭测方法的结果，建立了一种统一的模型。通过对影响甲醛释放量评价准确性的几个因素（表面积，质量，厚度等）进行研究，表明新的结合模塑比原有的两种方法更具有可行性和科学性。     

MDF甲醛释放量评价新方法的研究

研究了MDF甲醛释放量两种评价方法(干燥器法和穿孔法)的关系,通过对不同测试条件下用干燥器法对MDF甲醛释放量进行检测,其结果用穿孔法的检测结果进行对比和检验。用穿孔法的mg/100g为单位表达检测数据,能结合两种检测方法的结果,建立了一种统一的模型。通过对影响甲醛释放量评价准确性的几个因素(表面积,质量,厚度等)进行研究,表明新的结合模型比原有的两种方法更具有可行性和科学性。     

利用束纤维强伸性能测定双组分纤维束混和比

本文推导出利用双组分束强曲线测定其组分纤维混和比的两种方法:峰高法及斜率法。分析了混和比与测试值的关系,运用逐步回归的方法得到其回归曲线。通过这两种方法测得纤维混和比的误差不大于百分之二。实验证实这两种方法是可靠的。所使用的束纤维强力仪是自制的。在测试中由计算机完成全部计算工作,可直接给出混和比值。     

The catalase-peroxidase gene and isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis.

Tuberculosis is responsible for one in four of all avoidable adult deaths in developing countries. Increased frequency and accelerated fatality of the disease among individuals infected with human immunodeficiency virus has raised worldwide concern that control programmes may be inadequate, and the emergence of multidrug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis has resulted in several recent fatal outbreaks in the United States. Isonicotinic acid hydrazide (isoniazid, INH) forms the core of antituberculosis regimens; however, clinical isolates that are resistant to INH show reduced catalase activity and a relative lack of virulence in guinea-pigs. Here we use mycobacterial genetics to study the molecular basis of INH resistance. A single M. tuberculosis gene, katG, encoding both catalase and peroxidase, restored sensitivity to INH in a resistant mutant of Mycobacterium smegmatis, and conferred INH susceptibility in some strains of Escherichia coli. Deletion of katG from the chromosome was associated with INH resistance in two patient isolates of M. tuberculosis.     

异烟肼对斑马鱼胚胎发育量-毒关系的研究

研究了一线抗结核药物异烟肼对斑马鱼发育的量-毒关系。用不同浓度的异烟肼分别处理发育至2 hpf(hour post fertilization)的斑马鱼胚胎,观察胚胎和幼鱼的死亡率、孵化率、畸形率、体长及形态学变化。急性毒性实验结果表明异烟肼对斑马鱼有明显的发育毒性,能导致斑马鱼发育迟缓和畸变。与对照组相比,低剂量（小于6 mmol/L）异烟肼对斑马鱼无发育毒性,高剂量（≥32 mmol/L）异烟肼显著抑制胚胎的孵化率,并有明显的胚胎致死效应和致畸效应。斑马鱼死亡率和畸形率均随给药剂量的增加和给药时间的延长而升高。本实验条件下,异烟肼的最大无毒性效应浓度为2 mmol/L。