简便、快速制备寡聚核苷酸的新方法

制备寡聚核苷酸通常用化学合成和酶促合成方法,以及将多聚核苷酸进行部分碱水解或用专一性核糖核酸酶部分酶解多聚核苷酸等方法。这些方法有它们各自的优缺点。化学合成方法虽然可以合成任意碱基顺序的寡聚核苷酸,但由于它需要对核苷、核苷酸进行化学保护,因此周期长。将多聚核苷酸进行部分碱水解或部分酶解虽然方便、快速,但产率很低。这是因为这种方法所得到的产物实际上是一     

一种新的特异性DNA放大技术—PCR

多聚酶催化的链反应(PCR)是一种在体外将特异性DNA进行引物介导的酶促放大方法。该方法的建立是分子生物学研究中的一大突破。它有许多优点,并有广阔的应用前景。《一种新的特异性DNA放大技术——PCR》对此种方法的原理、操作和应用作了介绍,可供有兴趣的读者参考。     

油菜Polima和陕2A细胞质雄性不育系相关基因的序列比较

orf224是在油菜Polima胞质中发现的一个与细胞雄性不育相关的线粒体基因,陕2A不育系则是我国第一个大面积推广的杂交油菜品种“秦油2号”的亲三,Polima和陕2A的基因组DNA为模板,通过合成5′和3′端一对待异引物,利用多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR）从两个不育系的基因组DNA中都扩增出了与orf224同源的DNA片段,将其克隆到pGEM-TEasy载体上进行序列测定,测序结果表明：两序列均由675个核苷酸组成,编码224个氨基酸组成的多肽,两序列的核苷酸及推导出的氨基酸同源性分别为99．9％和99．6％,在＋398处两者有一个碱基的差异（AAC→AGC）和一个氨基酸的差异（Asn→Ser）,从而证实了Polima和陕2A为线粒体上同一座位的不同等位基因的差异。     

一种简单易行的重组方法——三引物PCR法

报道了一种不需要限制性内切酶和连接酶的重组DNA方法－三引物PCR法（TP－PCR），TP－PCR反应体系中有2种模板和3种引物，从而在同一个反应体系中产生一个重组DNA分子，这种方法的主要优点是快速，高效且不依赖连接片段的限制酶位点，用这种方法已成功构建了融合蛋白基因－sck基因。     

紫菜苔花粉原生质体的电激转化及Zm13-260-GUS-NOS融合基因的时序表达

利用花粉作为外源基因的媒介进行植物遗传转化是一个活跃的研究方向,而将外源基因导入花粉是这一转化体系的重要环节.但因花粉壁厚,导入外源DNA比较困难,而脱壁后的花粉原生质体则理应相对优越.近年花粉原生质体的分离与培养已取得了一定进展,以花粉原生质体作为转化受体已成为可能.为此,我们以花粉特异启动子Zm13-260控制的GUS基因作为报告基因,用电激法分别转化紫菜苔花粉原生质体和花粉粒,通过瞬间表达检测,比较了二者的转化效果,并探讨了GUS基因在不同发育时期花粉原生质体中的时序表达特性.     

多聚酶链式反应应用于带入Ⅸ因子cDNA的转基因小鼠的初筛

在转基因小鼠的制备中,对于所导入外源DNA的检测一般采用DNA-DNA分子杂交法.由于它具有敏感性和可靠性高等优点,故它在转基因小鼠的研究中是不可少的.然而,这种方法在实际应用中也有一些缺点,如操作复杂、工作量大、实验周期长、DNA样品量大以及放射性同位素来源的时间限制等,这些都给转基因小鼠的制备带来了一定的困难.我们在人凝血IX因子(Clotting factor IX)转基因小鼠的制备中,将多聚酶链式反应(Polymerase chainreaction,PCR)技术应用于转基因小鼠的初筛,并与Southern杂交结果进行了比较.结果表明这种方法是可行的,其最大的优点是提高了效率,缩短了实验周期.     

DNA甲基化对转基因表达的影响

DNA甲基化在调节真核生物基因表达过程中起着十分重要的作用。在植物转基因研究中,外源DNA甲基化往往易导致外源目的基因失活。利用农杆菌介导将β-葡糖醛酸酶基因（uidA)导入烟草,发现外源uidA基因在部分转基因植株中发生了基因失活现象。Northern杂交实验证实,基因失活的植株内检测不到外源uidA基因的转录产物,同时伴随着基因上游启动子区域的DNA甲基化现象。上述实验结果提示,转基因失活很可能是由于启动子区域甲基化引起的。     

β-珠蛋白基因——至少有两个插入DNA

关于β—珠蛋白mRNA的结构,已经了解得相当详细,如已知其5′端有甲基化的封闭结构,3′端有多聚A,还知道翻译部分的核苷酸序列与氨基酸序列相互对应等。与此相反,关于β-珠蛋白基因的结构及存在方式却了解得极少。但自从蒂尔门(Tilghman)等人对鼠β-珠蛋白基因进行无性繁殖以来,这方面的研究取得了迅速的进展。他们首先揭示出β-珠蛋白基因的核苷酸序列与成熟mRNA的核苷酸序列不完全对应,证明基因内至少有两个插入DNA。     

用PEG法向小麦原生质体导入外源基因获得转基因植株

目前用基因工程方法改良小麦是世界上普遍关注的课题,但其有效外源基因转化系统的建立却十分困难.Vasil 等曾用基因枪法转化小麦悬浮细胞获得转化的愈伤组织;最近他们又用相同的方法转化小麦胚性愈伤组织得到了抗除草剂的小麦转基因植株.我们在小麦原生质体再生植株获得成功的基础上,通过反复实验,用 PEG 处理法将外源基因导入小麦原生质体,通过培养和对转化细胞的筛选,获得了完整的转基因小麦再生植株.     

小鼠精子捕获外源DNA的研究

随着遗传工程研究的发展,现今已有多种方法实现外源基因向受体细胞的转移。较常用的方法有显微注射法和反转录病毒载体等方法。但晚近Lavitrano等报道用精子作为外源DNA的载体可以生产转基因动物。这一报道引起了国内外学者的广泛关注。一些作者试图重复这一实验,但至今还没有成功的报道。虽然如此,至今并不能排除精子作为外源DNA的载体的可能性。对这一问题的研究,至少具有以下三方面的意义。第     

番茄蛋白酶抑制剂Ⅱ基因的分离及其内含子功能

应用PCR技术,从番茄中分离了具有一个内含子的蛋白酶抑制剂Ⅱ基因的核基因。该内含子序列（TPI）的长度为109bp,两端存在着典型的GT／AG双核苷酸结构,其AT碱基对的含量非常高,约占核苷酸对总数的80．7％。DNA重组实验表明,TPI序列能够有效地促进报告基因gusA的表达水平,而且这种促进作用与该序列的插入位置及方向均无关系,呈现出明显的增强子特性。另外,GUS酶组织化学染色、荧光检测以及凝胶阻滞等实验等均证明TPI序列可能还具有启动子的活性,番茄蛋白酶抑制剂Ⅱ基因的核基因序列在GenBank中的登记号为AY007240.     

利用RAPD对大豆属植物系统学研究的初报

DNA分子操作技术的发展,使生物学家能够在DNA水平上进行基因组差异的分析.RFLP是最近十多年发展起来的用于基因组研究的方法.它已被广泛应用于生物进化、起源、群体遗传等领域.但是对于那些高度自交,遗传背景狭窄的物种测难以有效地利用RFLP进行基因组分析.1990年Williams和Welsh同时开创了利用人工合成的短核苷酸引物经PCR反应进行基因组DNA多态性分析的新方法,即 RAPD技术(Random amplifiedPolymorphic DNAs).由于这一技术能快速、有效地进行基因组DNA多态性检测.因此虽然其诞生时间很短,但已广泛应用于基因组研究的各个方面.     

低频、低压交变电场高效诱导基因转移

电场诱导基因转移以操作简单、转化率高、无细胞种属限制等优点被广泛应用到微生物、植物及动物细胞的基因转移中,其基本原理是:利用高压电脉冲造成膜的瞬间击穿,在膜上形成数纳米的孔洞,外源基因得以扩散进入胞内,从而实现外源基因的跨膜转移。这种穿孔在一定条件下是可逆的,但往往会造成50％左右的细胞的死亡。1990,Tsong首次报道了利用低频、低压交变电场将外源质粒DNA高效导入E. coli中,并发现交变电场作用后,且coli细胞100％存活,此后这方面的报道较少,更没有用到高等哺乳动物细胞的基因转移中。我们对真核细胞衣藻和Hela细胞分别以带有报告基因GUS的质粒pBI121、带有报告基因β-Galatosidase的质粒pSV-β-Gal作为模式外源基因进行了交变电场诱导基因转移的研究,结果分别得到了GUS基因、β-Gal基因的高效表达。     

植物幼小原胚的电激转化

用电激法将外源报告基因导入植物原胚获得瞬间表达．用酶解和显微解剖法分离出烟草含８～３２个细胞的幼小原胚与含２５０～４００个细胞的球形胚,导入ＧＵＳ和ＧＦＰ基因后,置于ＫＭ８ｐ培养基 １～２ｄ．当电场强度为 ５００～１５００ Ｖ／ｃｍ时,可检测到 ＧＵＳ蓝色反应和 ＧＦＰ绿色荧光,其中幼小原胚在电场强度为 ７５０ Ｖ／ｃｍ时,外源基因瞬间表达频率最高,为 ２．２％,球形胚在电场强度为１２５０ Ｖ／Ｃｍ时表达频率最高为 ５．９％．若以转化细胞占胚细胞总数的比例为有效转化频率,则幼小原胚的有效转化频率约为球形胚的７倍．     

nifH基因能够在高等植物叶绿体原核环境中表达

以高等模式植物烟草为材料,对固氮酶铁蛋白基因nifH在叶绿体中的表达进行了研究。构建了nifH基因叶绿体转化载体,并利用基因轰击法对烟草叶片进行了转化。基因枪轰击后,共获得6株壮观霉素抗性再生植株。PCR检测及Southern杂交鉴定结果表明,aadA和nifH等外源基因已整合进入受体植物叶绿体基因组中;Western免疫学淀法的测定结果则证明,nifH基因能够在叶绿体原核环境中表达。     

福兮?祸兮?转基因植物

近来,常常听到欧洲某国的人们拒绝接受转基因产品,并为此向政府提出抗议,要求禁止这类产品生产的消息。转基因到底是什么?它为什么会让人如此情绪激昂呢?下面就和大家谈一谈植物转基因技术。 植物体内的“异己分子” 转基因技术就是将外源基因(不是受体细胞本身具有的基因)设法导入受体细胞,使受体细胞获得外源基因所表征的特性。那么如何将外源基因转入植物细胞中呢?早先人们发现在土壤中的一种植物病原菌——土壤农杆菌能侵入植物的受伤部位,使植物产生瘤,而瘤的组织基因组中插入了农杆菌的基因。进一步研究发现,这种菌中有Ti质粒,它是一个闭合环状的双链DNA分子,该质粒上的一段DNA,称为T—DNA,它能转移并整合进植物基     

高赖氨酸含量基因在转基因小麦的表达及其赖氨酸含量分析

构建了含高赖氨酸含量基因(wblrp)和赖氨酸合成关键酶(dapA)基因的植物表达载体pBPC102,用基因枪导入京花1号、京411、优899和烟农15等受体品种的幼穗和幼胚,获得了100多株转基因小麦植株(T0)及其后代株系(T1～T2).PCR和PCR-Southern杂交结果表明,外源基因已稳定整合到转化植株To和T1的基因组中.进一步用RNA分子杂交的方法对高赖氨酸基因的表达及水平调控进行了深入研究,结果表明外源基因已在T2不同株系中获得了表达.植株叶片游离赖氨酸(Lys)含量和种子结合态Lys含量的测定和分析结果表明,有9个转基因植株后代株系叶片的游离Lys含量提高了2～3倍,4个株系的Lys含量提高了10%以上,小麦的营养品质得到了显著的改善.     

农杆菌转化水稻系统的研究

自1988年以来,水稻基因转化技术已取得显著进展,建立了转化水稻原生质体(电击法和PEG法)和完整细胞(基因枪法)的有效方法,得到外源基因稳定整合的转化植株及后代,但双子叶植物中最普遍使用的农杆菌介导法,却不能很好地应用于水稻,虽有几篇报道,但未得到转化植株,也未有转化目的基因的报道.我们尝试用农杆菌介导,将人工合成的抗菌肽基因转化水稻不定芽,得到表达外源基因的工程植株,建立了一种转化水稻的有效方法.     

强MAR的分离及其体内外功能鉴定

将MAR（matrix attachment region)构建到外源基因表达盒两侧可以促进外源基因的表达克服基因沉默。用PCR方法从烟草和拟南芥中分离到4个新的MAR序列（TM2，TM3，AM1和AM2），以水稻悬浮细胞为材料，提取大量细胞核制备核基质，以已发表的MAR（TM1）和对照，对4个新MARs序列进行体外结合实验，结果表明TM2和TM3与核基质的结合能力强于已知MAR序列。将4个新MARs和对照分别顺向构建和表达载体pBI121 gus基因表达盒两侧，用农杆菌介导法转化烟草，获得转基因植株。对转基因植株体内GUS酶活性检测表明，TM1，TM2，TM3和AM1均能命名外源基因表达增强，其中TM2增强5倍，TM1增强1．5倍，TM2增强效果强于对照TM1。表明分离到一个新的强MAR，可以用于高效表达载体的构建。对5个MARs的序列特征、体外结合能力及外源基因表达影响三者之间的关系进行了分析，并对获得的强MAR在植物基因工程中的应用进行了讨论。     

知识卡片

PCR是聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)的缩写,是上世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的穆利斯(Mullis)等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制,只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件,能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断;可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情,用PCR几小时便可完成。PC…