枯草芽胞杆菌谷氨酰胺转氨酶在谷氨酸棒杆菌中的分泌表达及诱导条件的优化

本文通过重叠PCR技术构建获得枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)来源的谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,TG)(BTG)重组基因Sprodbtg,该基因依次包含SD序列、谷氨酸棒杆菌信号肽ΔS0949序列、pro D-BTG基因,并将该目的基因克隆入大肠杆菌–谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体p XMJ19中构建重组质粒p XMJ19-Sprodbtg.随后,重组质粒电转入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032中进行诱导表达,并对重组菌株的诱导条件进行优化.结果表明:重组菌株C.glutamicum ATCC13032/p XMJ19-Sprodbtg表达重组酶原蛋白pro D-BTG经活化后,BTG的活力达到(41.23±2.01)U/L;在重组菌培养12 h后诱导、IPTG终浓度0.8 mmol/L、诱导40 h的最优诱导条件下,BTG的活力达到最高,为(55.62±2.34)U/L,较优化前提高了约34.90%,.     

重组枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶蛋白在改良M9培养基中的诱导表达

以重组枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶(L-谷氨酸:氨连接酶,Glutamine Synthetase, GS EC 6.3.1.2)蛋白表达宿主菌株BL21(DE3) (pET3C/谷氨酰胺合成酶)作为研究对象,借助SDS PAGE分析方法,对于用乳糖诱导由T7lac启动子控制的重组目的产物蛋白的各种基本参数进行了初步的研究.研究了最佳本底培养基、最佳碳源及其最佳添加比例、碳源与诱导物的最适组合,并探索了适用于改良型培养基的诱导参数.实验结果表明,对于重组目的产物蛋白,改良型M9培养基完全可以替代LB培养基;以甘油为碳源,可以避免葡萄糖对T7lac启动子的屏蔽作用.以乳糖为诱导物,目的蛋白的表达量、可溶性及酶活与以IPTG为诱导物基本接近.研究结果为酶法合成谷氨酰胺的工业化生产提供了一定的参考.     

枯草芽孢杆菌麦芽糖诱导型启动子Pglv-M1的改造

通过定点突变对麦芽糖诱导型启动子Pglv-M1进行改造,提高启动子启动能力。分析Pglv-M1的Sextama-35区与Pri-bmow-10区,通过对这些区域模拟随机突变,软件打分后获得最高分的新片段。将新启动子与载体p HCMC04-sva连接,并在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 1A857中诱导表达,每12 h取粗酶液进行酶活测定。研究结果表明:除突变启动子Pglv-35以外,其余突变体启动效果均有所下降,有突变体构成的表达载体Pglv-35-pHCMC04-sva诱导表达后,得到的单位粗酶活力最高点出现在36 h处,较突变前提高1.31倍。PglvM1作为诱导型启动子Pglv的改造产物,其各个区域的相互影响较为紧密。通过对启动子关键区域单独或同时突变,仅获得一组启动能力有所提高的启动子Pglv-35,这为今后针对启动子的思考、研究方向提供参考。     

枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子的研究进展

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是工业应用中一种重要的模式菌株,具有非致病性、遗传背景清晰、分泌蛋白能力强、容易分离培养等特性,是异源蛋白表达和分泌的理想宿主。高效可控的启动子是实现外源蛋白高效表达的关键因素之一。根据诱导机制,启动子可分为组成型启动子、诱导型启动子、自诱导启动子和时期特异性启动子。本文介绍了枯草芽孢杆菌表达系统、芽孢杆菌σ因子类型及枯草芽孢杆菌启动子的结构,比较了常用启动子的优缺点,总结了新启动子克隆和改造及生物信息学预测启动子的方法,并对枯草芽孢杆菌启动子未来的研究方向进行展望,为进一步研究启动子的结构和功能及工业生产外源蛋白奠定基础。     

中温α-淀粉酶基因的克隆及在枯草芽孢杆菌中的高效表达

利用高效表达栽体pWB980,实现了Bacillus subtilis BF7658中温α-淀粉酶基因amy在B.subtilis DB403中的高效表达,活力达到770 U/mL.经多步纯化,重组酶AMY的比活达到35.8 U/mg,纯化倍数为1.7,获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品,经SDS-PAGE检测,重组酶AM...     

不同启动子调控的两种半纤维素酶分泌表达的比较

为提高耐热木聚糖酶DSB和耐热甘露聚糖酶ManB在毕赤酵母GS115中分泌表达的酶活力,选择了3个调控蛋白表达能力较强的启动子P_(FLD1),P_(GAP)和P_(TEF1),以P_(AOX1)为参照,分别在毕赤酵母GS115中进行分泌表达.摇瓶发酵结果表明:P_(FLD1),P_(TEF1),P_(GAP)和P_(AOX1)能有效介导DSB和ManB的分泌,但其胞外酶活相差较大.对于DSB,使用P_(AOX1)时酶活力明显高于P_(FLD1),P_(TEF1)和P_(GAP),最高酶活达846 U/mL;对于ManB,使用P_(FLD1)时酶活力高于P_(AOX1),最高酶活达222 U/mL.故在GS115中分泌表达DSB时选用P_(AOX1),而分泌表达ManB时选用P_(FLD1).     

利用透明颤菌血红蛋白基因在谷氨酸棒杆菌中的表达提高谷氨酸和谷氨酰胺的产量

为了降低谷氨酰胺(glutamine,Gln)生产过程中所需要的高溶氧水平对设备的要求,在谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC 14067中表达增强摄氧的透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscilla hemoglobin gene,vgb),以此提高细胞的摄氧能力及能量的供给水平.对得到的重组菌和野生菌进行了发酵实验.在溶氧只有5%的条件下,重组菌比野生菌细胞干重提高了1.2倍,单位细胞谷氨酸的生产能力提高了6.5倍,单位细胞谷氨酰胺的生产能力提高了1.4倍.对比结果显示,含有vgb基因的重组菌比野生菌在细胞生长、谷氨酸和谷氨酰胺合成等方面的能力都有显著提高.     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中的表达

将来源于枯草芽孢杆菌WB600的启动子PyxiE与碱性蛋白酶基因进行融合,将融合片段插入到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pSUGV4中,构建了表达质粒pSUPyAp. 将该质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到转化子pSUPyAp/WB600,它在启动子PyxiE驱动下,能够在牛奶平板上产生透明的水解圈,其发酵上清液中的碱性蛋白酶活性最高为518.5 U/mL,其酶活分别是在启动子Bp53和P43驱动下的3.01倍和1.22倍.     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中的表达

将来源于枯草芽孢杆菌WB600的启动子PyxiE与碱性蛋白酶基因进行融合,将融合片段插入到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pSUGV4中,构建了表达质粒pSUPyAp. 将该质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到转化子pSUPyAp/WB600,它在启动子PyxiE驱动下,能够在牛奶平板上产生透明的水解圈,其发酵上清液中的碱性蛋白酶活性最高为518.5 U/mL,其酶活分别是在启动子Bp53和P43驱动下的3.01倍和1.22倍.     

头孢菌素C酰化酶S12在不同原核系统中的表达

目的：构建头孢菌素C酰化酶（Cephalosporin C Acylase）基因的两种原核表达载体,确定高效原核表达体系。方法：人工合成头孢菌素C酰化酶S12基因,分别克隆到含有Lac启动子的载体pBC KS和T7-lac启动子的载体pET-28a上,命名为pBC-S12和pET-28-S12,重组质粒分别转化感受态大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）,表达纯化目的蛋白S12,测定酶活。结果：成功地构建了头孢菌素C酰化酶S12的原核表达菌株,组成型表达和诱导型表达体系的表达量低,目的蛋白具有酶活,诱导型表达产生的酶比组成型表达产生的酶具有更强活性,可作为大肠杆菌表达头孢菌素C酰化酶的高效表达体系。     

会计人员如何适应新形势

从转变会计观念、加强会计监督职能、让会计人员参与企业经营决策活动、强化管理会计的职能、强化会计信息服务职能等方面,阐述了现代市场经济条件下会计人员发挥其参与经营管理的积极作用。     

学问之路,要学要问

进入上海交通大学科学史与科学哲学系读博以来,自己渐渐掌握了如何研究科学史、怎样撰写学术论文的方法.期间我也曾为如何进行学术研究彷徨、迷茫过,而在我的导师的细心点拨之下,我一步步走出彷徨,进入学术研究的正途.     

利用焊接变形原理控制储罐焊接变形的措施

钢制储罐现场安装时,无论是正装法施工还是倒装法施工,焊接变形的控制是关键点。本文利用焊接变形的原理,并从焊接大工艺范畴,即切割下料、成型、焊接等工序较系统地论述控制储罐焊接变形的工艺措施。     

实现多网共享网址

合理地分配IP地址,通过配置子网掩码实现多网共享一个网址.     

送科技下乡为农户服务——太原市实施农村科技特派员试点工作纪实

为贯彻“中央一号”文件和国家科技部“全国县市科技工作会议”精神，2004年11月初．太原市阳曲县、清徐县和娄烦县的120个村在全省率先实行了科技特派员制度试点工作。4个多月来。科技特派员深入田间地头，和农户结对子，给农民出点子、探路子、教法子，帮助广大农民走上科技致富的道路，使他们的钱袋子鼓了起来。根据太原市市委郭振中副书记的指示．近期太原市科学技术局王燕阳局长带领有关人员深入三县近20个试点村进行了调查研究，并召集部分科技特派员进行了座谈。从总体情况看，实施科技特派员制度取得了较好的效果。     

通往信仰之路与通往理性之路——论怀疑论在西方认识史上的地位和作用

我国许多学者视怀疑论为西方阶级社会的一种落后意识形态的理论表现。本文试图通过阐述古希腊末期怀疑论对基督教兴起的作用和十七世纪笛卡尔的怀疑主义原则对近代哲学的影响 ,客观地评价怀疑论在西方认识史上的地位和作用