发育时期专一性相关的调控因子与人体ε-珠蛋白基因5′旁侧调控元件DNA的结合

人体ε-珠蛋白基因是人体β-类珠蛋白基因簇中胚胎型结构基因,在胚胎发育过程中,它最先在卵黄囊血岛中表达,也最先关闭,呈现出严格红系组织特异性和发育时期专一性特点.最近有人报道,人ε-珠蛋白基因5’旁侧DNA序列对人ε-珠蛋白基因时空表达和调控起着很重要的作用.已鉴定出位于该基因5’旁侧DNA序列内,从-535bp到-453bp为一个正调控元件(PRE),从-392bp到-177bp为一个沉默子(Silenecer)(图1).但目前尚不清楚它们作用的分子机制.     

小鼠β-簇珠蛋白基因LCR调控元件中DNase-I超敏感点Ⅲ(HS3)的研究

人与小鼠β-簇珠蛋白基因在结构与表达模式上存在极大的相似性.基因簇5’上游20kb内是一个Locus control region(LCR)顺式元件,由4个DNase-Ⅰ超敏感区(HSs)组成.相关的研究工作表明LCR对β-簇珠蛋白基因的红系组织专一性表达有重要作用,它的插入或缺失突变将导致基因表达的紊乱,甚至造成严重的贫血症状.近年来,人们对研究LCR调控元件在β-簇珠蛋白基因发育时期特异性表达中的调控机制给予了极大的关注.希望了解LCR元件中不同的HS是否参与β-簇珠蛋白基因的时期特异开关调节.转基因小鼠研究结果表明人LCR元件中HS3可能与发育早期的胚胎型珠蛋白基因的表达调控相关,但近来有关报道表明小鼠的HS3不为β-簇珠蛋白基因的开关所必需,并且仅部分参与了成年型的β-簇珠蛋白基因的调控.因此,HS3是否参与β-簇珠蛋白基因发育时期特异性的调控尚不完全清楚.     

纯合子人βE-珠蛋白基因转基因鼠系的建立

血红蛋白E(Hb E)是我国常见的异常血红蛋白病,它是由β-珠蛋白基因第26位编码子的G→A点突变引起.因Hb E与β-地中海贫血症状相似,又称之为地中海贫血样综合征;它也常与β-地中海贫血复合存在,危害严重.利用转基因动物技术研究真核基因表达调控已取得重要进展.已发现β-珠蛋白基因簇和α-珠蛋白基因簇上游区的DNase Ⅰ敏感区能明显提高珠蛋白基因的表达水平.其中β-基因簇的HS-2和α-基因簇的HS-40具有典型的增强子作用.     

人ε-珠蛋白基因5′旁侧调控元件与核基质蛋白相互作用

运用凝胶电泳阻抑法揭示了在活跃表达人ε-珠蛋白基因的K562细胞内存在一个红细胞专一的核基质蛋白(简称ε-NMPk),它能专一地与正调控元件ε-PREⅡ DNA(-446～-419 bp)相结合, Southwestern blotting分析表明,ε-NMPk是由2个分子量约为40 ku的亚基所组成.还发现在K562,HEL和Raji细胞中都至少存在着1个核基质蛋白,它们能与ε-珠蛋白基因5′旁侧DNA序列内的沉默子DNA(silencer, -392～-177 bp) 相结合, 它们的结合区带(band K 与bandH/R)位置并不完全相同, 推测在HEL和Raji细胞内可能共同存在着一个与沉默子DNA专一结合的核基质蛋白. 实验结果表明, 核基质蛋白可能积极参与了人ε-珠蛋白基因时空表达的调控.     

小鼠β-簇珠蛋白基因LCR调控元件中DNase-I超敏感点Ⅲ(HS3)的研究

<正>人与小鼠β-簇珠蛋白基因在结构与表达模式上存在极大的相似性.基因簇5’上游20kb内是一个Locus control region(LCR)顺式元件,由4个DNase-Ⅰ超敏感区(HSs)组成.相关的研究工作表明LCR对β-簇珠蛋白基因的红系组织专一性表达有重要作用,它的插入或缺失突变将导致基因表达的紊乱,甚至造成严重的贫血症状.近年来,人们对研究LCR调控元件在β-簇珠蛋白基因发育时期特异性表达中的调控机制给予了极大的关注.希望了解LCR元件中不同的HS是否参与β-簇珠蛋白基因的时期特异开关调节.转基因小鼠研究结果表明人LCR元件中HS3可能与发育早期的胚胎型珠蛋白基因的表达调控相关,但近来有关报道表明小鼠的HS3不为β-簇珠蛋白基因的开关所必需,并且仅部分参与了成年型的β-簇珠蛋白基因的调控.因此,HS3是否参与β-簇珠蛋白基因发育时期特异性的调控尚不完全清楚.     

人ε-珠蛋白基因5''''旁侧调控元件与核基质蛋白相互作用

运用凝胶电泳阻抑法揭示了在活跃表达人ε－珠蛋白基因的Ｋ５６２细胞内存在一个红细胞专一的核基质蛋白（简称ε－ＮＭＰｋ），它能专一地与正调控元件ε－ＰＨＥⅡ　ＤＮＡ（－４４６～－４１９ｂｐ）相结合，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析表明，ε－ＮＭＰｋ是由 ２个分子量约为４０ｋｕ的亚基所组成．还发现在 Ｋ５６２，ＨＥＬ和 Ｒａｊｉ细胞中都至少存在着１个核基质蛋白，它们能与ε－珠蛋白基因 ５’旁侧 ＤＮＡ序列内的沉默子 ＤＮＡ（ｓｉｌｅｎｃｅｒ，－３９２～－１７７ｂｐ）相结合，它们的结合区带（ｂａｎｄ Ｋ与ｂａｎｄＨ／Ｒ）位置并不完全相同，推测在ＨＥＬ和Ｒａｊｉ细胞内可能共同存在着一个与沉默子ＤＮＡ专一结合的核基质蛋白．实验结果表明，核基质蛋白可能积极参与了人ε－珠蛋白基因时空表达的调控．     

中国人β类珠蛋白基因多态性研究——γ珠蛋白基因中的多态性Hind Ⅲ酶切位点

人类珠蛋白基因多态性作为一种遗传标志,在人类学、遗传学和某些遗传性疾病的预防研究中具有重要的意义。国外自1978年开始发表一些种族群体分析的有关资料,国内在这方面迄今尚无研究报道。我们在研究我国β-地中海贫血(一种遗传病)产前诊断的过程中,首先对中国人β类珠蛋白基因的多态性限制性内切酶酶切位点的分布作了系统的研究。本文首次报告中国人群中γ珠蛋白基因多态性的资料。     

HMG1/2和HMG14/17与人ε-珠蛋白基因启动子DNA的相互作用

HMG (high mobility group)蛋白质是真核细胞核内一类含量丰富的非组蛋白, 它们在染色质的结构与功能及基因表达调控中起着重要作用. 应用凝胶电泳阻滞法和体外核小体重组技术, 分析了HMG1/2和HMG14/17与人ε-珠蛋白基因启动子(ε-promoter,-177 ～ + 1 bp) DNA的结合模式. 实验结果表明, HMG1/2能与ε-珠蛋白基因启动子DNA相结合, 而HMG14/17不能与它结合. 将ε-珠蛋白基因启动子DNA在体外组装成核小体后, HMG1/2则不能与组装成核小体的ε-珠蛋白基因启动子 DNA结合, 而HMG14/17却能与之结合. 结果提示, 当 ε-珠蛋白基因启动子DNA处于不同的状态时, 它所结合的HMG蛋白是不同的, 推测它们可能就是通过这种选择性的结合模式而积极参与了人体 ε-珠蛋白基因的表达调控.     

红细胞分化相关基因EDRF2抑制K562细胞中α-珠蛋白基因的表达

EDRF2是一个红细胞分化相关因子, 它在分化后的K562细胞中被诱导表达. Northern blot结果显示, EDRF2全长mRNA约500 bp. 利用RACE技术, 成功扩增了EDRF2mRNA完整的5′-和3′-末端. EDRF2正义和反义cDNA在K562细胞中稳定表达. Northern blot分析表明, EDRF2能抑制α-珠蛋白基因的表达, 而对γ -珠蛋白基因的表达没有明显的调节作用. 凝胶阻滞电泳的结果显示, EDRF2对GATA-1, NF-E2和AP1(c-Jun/c-Fos)等转录因子的DNA结合活性没有明显的调控作用. GATA-1的负调控因子PU.1表达被EDRF2上调, 提示EDRF2很可能是红细胞分化的负调控转录因子, 与PU.1协同作用, 下调α-珠蛋白基因在K562细胞中的表达.     

红细胞分化相关基因EDRF6抑制K562细胞中α—珠蛋白基因的表达

EDRF2是一个红细胞分化相关因子，它在分化后的K562细胞中被诱导表达。Northern blot结果显示。EDRF2全长mRNA约500bp。利用RACE技术，成功扩增了EDRF2 mRNA完整的5‘－和3‘－末端。EDRF2正义和反义cDNA在K562细胞中稳定表达。Northern blot分析表明，EDRF2能抑制α－珠蛋白基因的表达，而对γ－珠蛋白基因的表达没有明显的调节作用。凝胶阻滞电泳的结果显示，EDRF2对GATA－1，NF－E2和APl(c-Jun/c-Fos)等转录因子的DNA结合活性没有明显的调控作用。GATA－1的负调控因子PU。1表达被EDRF2上调，提示EDRF2很可能是红细胞分化的负调控转录因子，与PU．1协同作用，下调α－珠蛋白基因在K562细胞中的表达。     

HMG1/2和HMG14/17与人ε-珠蛋白基因启动子DNA的相互作用

HMG（hihg mobility group）蛋白质是真核细胞核内一类含量丰富的非组蛋白，它们在染色质的结构与功能及基因表达调控中起着重要作用，应用凝胶电泳阻滞法和体外核小体重组技术，分析了HMG1/2和HMG14/17与人ε-珠蛋白基因启动子（ε-promoter,-177～ 1bp）DNA的结合模式，实验结果表明，HMG1/2能与ε-珠蛋白基因启动子DNA相结合，而HMG14/17不能与它结合，将ε-珠蛋白基因启动子DNA在体外组装成核小体后，HMG1/2则不能与组装成核小体的ε-珠蛋白基因启动子DNA结合，而HMG14/17却能与之结合，结果提示，当ε-珠蛋白基因启动子DNA处于不同的状态时，它所结合的HMG蛋白是不同的，推测它们可能就是通过这种选择性的结合模式而积极参与了人体ε-珠蛋白基因的表达调控。     

K-RRneo细胞生长与分化特性的检测

细胞分化实质上是基因的选择性表达和特异性蛋白质的合成.珠蛋白基因开启、血红蛋白表达是红系细胞分化的典型标志.当红系细胞癌变时这一分化特征丧失,机理未明.薛社普等经过大量的研究发现,骨髓瘤细胞与网织红细胞同种或异种间进行杂交后,在出现去恶性分化特征(癌基因表达抑制/关闭)的同时,往往伴有珠蛋白基因产物(血红蛋白)的表达.我们报道了兔网织红细胞与人红白血病细胞K_(562)融合后形成的K-RRneo细胞生长活动较     

人β-簇珠蛋白基因上游远侧端调控元件与GATA转录因子结合模式

用羟基脲诱导ＨＥＬ细胞，将诱导前后细胞核内蛋白质因子与人β－类珠蛋白基因ＬＣＲ调控元件内ＤＮａｓｅⅠ超敏感点Ⅲ和Ⅳ核心ＤＮＡ序列（ＨＳ３－１４７１６－－１４９９１ＢＰ和ＨＳ４－１８３０６－１８５８６ＢＰ）的结合模式进行了分析，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析结果表明，随着羟基脲诱导ＨＥＬ细胞时间的延长，细胞核内ＧＡＴＡ－２的含暧渐减少；与之相反，ＧＡＴＡ－１的含量却随着诱导的时间而增加。结合竞争性ＥＭＳ     

β-珠蛋白基因——至少有两个插入DNA

关于β—珠蛋白mRNA的结构,已经了解得相当详细,如已知其5′端有甲基化的封闭结构,3′端有多聚A,还知道翻译部分的核苷酸序列与氨基酸序列相互对应等。与此相反,关于β-珠蛋白基因的结构及存在方式却了解得极少。但自从蒂尔门(Tilghman)等人对鼠β-珠蛋白基因进行无性繁殖以来,这方面的研究取得了迅速的进展。他们首先揭示出β-珠蛋白基因的核苷酸序列与成熟mRNA的核苷酸序列不完全对应,证明基因内至少有两个插入DNA。     

胚胎发育合子型基因激活（ZGA）的调控机制

新受精卵超越早期分裂阶段正常的发育需要胚胎基因转录的重新起动与续后调控，ZGA（合子型基因激活）是胚胎发育过程中母型调控的合子型调控过渡中的关键事件，卵为新形成合子发育程序的起动提供了特殊的环境条件，并对其调节控制起了必要的作用，各类动物早期卵裂过程的胚胎基因转录起动精确时间是可变的，涉及染色质结构成分、调控元件（顺/反式）、RNA降解、DNA复制、修饰/加工作用、卵子发生因子、合子钟及天然信号等多种因素的调节控制，本文综述了当前胚胎发育合子基因表达的时间及相关调控机制的研究进展。     

性别判定的分子机制

性别分化虽然是最基本的发育事件之一,性别决定的分子机制却五花八门,哺乳动物的性别决定于Y染色体上的Sry基因存在与否,果蝇和线虫的性别决定于X染色体的多少,蕨类的性别决定于外激素,性别分化是一个多基因有序参与的过程.果蝇的调节体系是一个由可变RNA剪接决定的正调节级联,它有两个支路:细胞自主地起作用;线虫的调节体系是一个负调节级联,不完全是细胞自主的.两性间X染色体数目不等,所以要对X连锁基因的表达作剂量补偿.哺乳动物的剂量补偿机制是将雌性的两条X染色体随机关闭一条,果蝇是使雄性那条X染色体转录水平提高1倍,线虫则是使XX个体的X转录水平降低,这种多样性提供了胚胎发育过程中分子调节开关作用机理的一个丰富的信息源泉.性别决定的分子奥秘正在被逐步揭开.     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗β-地中海贫血的最新进展

地中海贫血是β-珠蛋白基因(HBB)点突变或缺失引起的单基因遗传病,患者产生溶血性贫血,其生存主要依赖于反复输血及去铁治疗,最终导致多器官受损、衰竭,给个人、家庭和国家带来严重的经济负担.随着基因编辑技术的蓬勃发展,可能治愈基因突变性疾病的基因治疗应运而生,其中CRISPR/Cas9基因编辑技术凭其靶向特异性、经济性等优势备受关注,并已广泛应用于分子生物学以及生命科学领域的研究.如今CRISPR/Cas9基因编辑技术修复人多能干细胞HBB基因、诱导胎儿血红蛋白(HbF)合成或抑制α-珠蛋白基因(HBA基因)表达是治愈β-地中海贫血的三大可行性策略,相关临床试验已相继开展.本文就CRISPR/Cas9系统的研究进展、作用机制以及在治疗β-地中海贫血的最新研究与应用进行综述,涉及细胞实验、动物模型、临床试验等内容,并介绍了CRISPR/Cas9系统衍生的新型基因编辑工具碱基编辑器在该领域的研究应用,为促进β-地中海贫血从基础研究转向临床治疗提供新的思路和方向.     

胚胎发育的基因调控

１９９５年诺贝尔生理学／医学奖授给了三位国际名发育生物学家，他们对果蝇早期胚胎的基因调控作用出了杰出了贡献，他们发现了一些重要的基因能控制果蝇的胚胎发育，这为研究人类的胚胎发育物阐明畸形产生的机理奠定了重要理论基础，虽然他们采用的方法是经典遗传学手段，但得到的成果却令人惊叹而信服，这些突破性成就来自于纯性的基础研究，在当前强调应用性研究的气氛中，颇为理论研究鼓气壮胆。     

金鱼母体因子β-catenin cDNA的克隆及在胚胎发育中的作用

核质相互作用一直是动物胚胎发育领域的研究焦点, 母体因子对于脊椎动物胚胎发育的启动具有决定性作用. 在已有的研究中, 直接研究母体因子β-catenin基因的时空表达规律与其功能的相关性还较少见, 因此, 我们对该基因在金鱼胚胎发育全程中的作用进行了时空性的跟踪研究. 报道了金鱼β-catenin cDNA全基因序列, 并与斑马鱼的β-catenin cDNA序列和氨基酸序列进行了比较, 结果表明, 两者具有很高的同源性, 分别为93% (2227/2384 bp)和98.5% (768/780 aa); 系统地研究了β-catenin基因在金鱼胚胎发育全过程中的表达规律; 用反义RNA和绿色荧光蛋白基因共注射技术, 直接活体考察了β-catenin基因活性对金鱼胚胎发育的影响. 结果证明, β-catenin在胚胎中的分布是动态的, 主要定位于体轴和背部组织, 以及头尾结构. β-catenin活性的丧失, 导致胚胎背部结构严重缺损和沿前后轴组织发育受阻, 并在幼体形成前死亡, 说明该基因是胚胎启动和发育的必要因子之一.     

贮藏温度对鲜枸杞类胡萝卜素和氨基酸的影响及调控机制

本研究探讨了4和-4℃贮藏对鲜枸杞类胡萝卜素水平、类胡萝卜素合成、存储、降解相关基因以及氨基酸代谢相关基因表达的调控作用.结果表明,–4℃贮藏的枸杞果实中β-胡萝卜素、玉米黄素和玉米黄素双棕榈酸酯含量显著高于4℃,贮藏末期玉米黄素双棕榈酸酯含量比4℃贮藏高42.14%.枸杞果实低温贮藏过程中类胡萝卜素合成、存储和降解相关基因普遍上调表达,特别是类胡萝卜素裂解酶基因LbCCD4在贮藏过程中表达量升高超过70倍. 4℃贮藏枸杞果实类胡萝卜素合成基因表达显著高于–4℃,但是存储蛋白基因LbHSP21、LbOR2表达极显著低于–4℃,降解酶基因LbNCED6、LbCCD1、LbCCD4则极显著高于–4℃,可能是导致其类胡萝卜素含量低于–4℃的主要原因.另一方面, 4℃贮藏上调脯氨酸合成相关的LbOAT表达、维持脯氨酸降解相关的LbProDH在较低水平,从而有利于脯氨酸的积累.上述结果说明,–4℃贮藏更有利于枸杞类胡萝卜素的积累、保持较好的营养品质,并延缓果实衰老劣变.