E3泛素连接酶Pellino蛋白的研究进展

Pellino蛋白是近年来新发现的一类E3泛素连接酶,通过靶蛋白泛素化介导蛋白降解、蛋白与蛋白的相互作用、蛋白质细胞定位以及信号传导.目前研究表明Pellino蛋白在固有免疫细胞和获得性免疫细胞中具有重要调控作用,与炎症和自身免疫密切相关.本文总结了近年来Pellino蛋白的表达与活性调控、介导的信号转导途径以及在免疫...     

微RNA关键结合蛋白的功能与机制研究

在原计划研究内容基础上,开展了piRNA、miRNA作用通路中功能蛋白质因子的筛选、功能机制研究。(1)对MIWI/piRNA机器的代谢分子机制和生理学意义进行了深入研究;(2)发现CAF1/MIWI/piRNA介导后期精子细胞中m RNA清除;(3)筛选获得了若干RISC相互作用蛋白,发现BTG2蛋白对miRNA引起的m RNA脱腺苷酸化具有显著促进作用,并且依赖于其与CAF1间的相互作用;(4)对2个与miRNA生物合成直接相关的关键蛋白质的类泛素化修饰(SUMOylation)进行了体内体外的鉴定,并进一步研究了这种蛋白质修饰的功能。该研究完成了原计划研究内容,取得了一些重要研究结果。     

去泛素化酶及其与人类疾病相关性的研究进展

去泛素化酶(Deubiquitinating enzymes, DUBs)通过与泛素化靶蛋白的相互作用,切割或去除靶蛋白的泛素链,进而逆转靶蛋白的降解,参与泛素相关的信号转导及人类许多疾病的发生和发展。研究DUBs系统及其与人类疾病的相关性,挖掘出DUBs中新药的靶点对人类健康有重要作用。近年来,针对DUBs的种类、结构以及相关生理作用取得了新进展。本文通过对DUBs的分类、结构以及在肿瘤、免疫和神经系统疾病中的关系和靶向DUBs的先导化合物的研究进展进行综述,以期为DUBs相关的深入研究提供参考。     

基于LightGBM的蛋白质类泛素化修饰位点预测

蛋白质类泛素化修饰位点的准确识别对基础研究和药物开发都具有重要意义.该文提出了一种基于蛋白质序列特征的类泛素化修饰位点预测模型.该模型结合氨基酸的物理化学属性统计特征和氨基酸序列二元语法模式特征,训练一种轻量型梯度提升机(Light gradient boosting machine,LightGBM)分类器预测某个蛋...     

多泛素链延伸酶E4B对TLR信号通路的调节作用

研究多泛素链延伸酶E4B对TLR信号通路的影响.在HEK293T细胞中,通过双荧光报告系统检测E4B对TLR信号通路的影响,并且用免疫共沉淀的方法鉴定E4B的相互作用蛋白质.发现多泛素链延伸酶E4B能够抑制TLR通路的下游转录因子NF-κB和IRFs的转录活性,并且能与TRAF6发生相互作用.提示多泛素链延伸酶E4B可能参与TLR信号通路的调控,为TLR信号通路的研究提供新的线索.     

利用泛素分裂系统筛选AtTR1相互作用蛋白质

以AtTR1作为诱饵蛋白利用泛素分裂系统在拟南芥cDNA文库中筛选与拟南芥AtTR1基因相互作用的蛋白质.运用营养缺陷型培养基和X-Gal显色、PCR扩增及酶切分析等实验排除假阳性,并对阳性克隆进行序列测定和比对.通过泛素分裂系统筛选到可靠的AtTR1相互作用蛋白质,测序比对后,选取HMA与AtTR1通过GST pull-down进行进一步的验证,结果证明它们确实存在相互作用,这对进一步研究AtTR1及其相互作用蛋白质在植物耐热中的作用和耐热分子机制奠定了基础.     

泛素-蛋白酶体途径的组成及其生物功能

泛素-蛋白酶体途径(UPP)是20世纪70年代末期新发现的一种细胞内蛋白降解途径,在多种蛋白质降解中发挥重要作用,具有高度特异性。UPP介导的细胞蛋白降解是一个复杂、缜密的调控过程。UPP可识别、标记、进而降解那些被泛素化的蛋白质。它在抗原提呈、细胞周期、NF-kB代谢等方面发挥重要调控作用,而且UPP的异常与许多疾病如肿瘤、脓毒症、骨骼肌损伤等的致病机制有关。就UPP的组成、作用机制及其功能进行综述。     

拟南芥AtHHR2与DREB2C的相互作用研究

已有研究表明拟南芥Highly Homologous RING domain 2(At5g43200,命名为AtHHR2)基因在盐胁迫中起正调控作用,并且其同源基因AtHHR3基因在酵母双杂交实验筛选中与DREB2C基因有相互作用.本研究利用体外、体内蛋白质相互作用实验以及生物化学方法进一步探究了AtHHR2的功能性.体外Pull-down实验证实了AtHHR2与DREB2C有体外的相互作用.体外泛素化实验进一步验证了它们之间的相互作用,且AtHHR2起到E3连接酶的作用.为了进一步确定它们的关系,我们用双分子荧光互补实验,在体内分别验证了AtHHR2与DREB2C之间确实有相互作用.综上所述在拟南芥中AtHHR2与DREB2C有相互作用关系,且AtHHR2起到E3连接酶的作用.     

SARS-CoV-2非结构蛋白Nsp2上调A549细胞泛素水平并被泛素化修饰研究

目的 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）因其强大的感染力肆虐全球,因此深入研究病毒与宿主的相互作用是揭示SARS-CoV-2致病机制的重要途经。方法 利用同源重组方法 将SRAS-CoV-2的非结构蛋白Nsp1～Nsp16构建到真核表达载体上,并通过Western blot检测Nsp1～Nsp16重组质粒的蛋白表达情况。接着使用Western blot检测Nsp2对细胞总泛素水平的影响,并通过细胞免疫荧光检测Nsp2在细胞中的分布情况。最后通过免疫共沉淀技术对Nsp2与泛素之间的相互作用关系进行检测。结果 Western blot检测显示Nsp1～Nsp16重组质粒能够在A549细胞中正常表达;筛选发现非结构蛋白Nsp2能在细胞质中上调细胞总泛素表达水平;免疫共沉淀检测进一步发现Nsp2能与泛素蛋白发生相互作用。结论 成功构建了SARS-CoV-2非结构蛋白Nsp1～Nsp16真核细胞表达载体,并发现非结构蛋白Nsp2可以增加细胞总泛素表达水平并被泛素化修饰。提示Nsp2通过泛素途径参与到SARS-CoV-2与宿主的相互作用,有助于深入了解病毒与宿主的作用机制。     

泛素调节的蛋白质降解--2004年诺贝尔化学奖成果简介

以色列科学家阿龙·切哈诺沃(Aaron Ciechanover)、阿夫拉姆·赫什科(Avram Hershko)和美国科学家欧文·罗斯(Irwin Rose)因发现泛素调节的蛋白质降解被授予2004年诺贝尔化学奖.泛素是一种含76个氨基酸的多肽,存在于除细菌外的许多不同组织和器官中,具有标记待降解蛋白质的作用.被泛素标记的蛋白质在蛋白酶体中被降解.泛素控制的蛋白质降解具有重要的生理意义,它不仅能够清除错误蛋白质,对细胞生长周期、DNA复制以及染色体结构都有重要的调控作用.     

TNF-RII and c-IAP1 mediate ubiquitination and degradation of TRAF2

Tumour necrosis factor-alpha (TNF-alpha) is a proinflammatory mediator that exerts its biological functions by binding two TNF receptors (TNF-RI and TNF-RII), which initiate biological responses by interacting with adaptor and signalling proteins. Among the signalling components that associate with TNF receptors are members of the TNF-R-associated factor (TRAF) family. TRAF2 is required for TNF-alpha-mediated activation of c-Jun N-terminal kinase (JNK), contributes to activation of NF-kappaB, and mediates anti-apoptotic signals,. TNF-RI and TNF-RII signalling complexes also contain the anti-apoptotic ('inhibitor of apoptosis') molecules c-IAP1 and c-IAP2 (refs 5, 6), which also have RING domain-dependent ubiquitin protein ligase (E3) activity. The function of IAPs in TNF-R signalling is unknown. Here we show that binding of TNF-alpha to TNF-RII induces ubiquitination and proteasomal degradation of TRAF2. Although c-IAP1 bound TRAF2 and TRAF1 in vitro, it ubiquitinated only TRAF2. Expression of wild-type c-IAP1, but not an E3-defective mutant, resulted in TRAF2 ubiquitination and degradation. Moreover, E3-defective c-IAP1 prevented TNF-alpha-induced TRAF2 degradation and inhibited apoptosis. These findings identify a physiologic role for c-IAP1 and define a mechanism by which TNF-RII-regulated ubiquitin protein ligase activity can potentiate TNF-induced apoptosis.     

小麦泛素融合降解蛋白基因全长cDNA的克隆及分析

实验利用RT-PCR技术，在小麦矮苏3品种中克隆了1个编码泛素融合降解蛋白基因的cDNA，并且含有完整的5′端，将该基因命名为Tufd1，利用RACE技术克隆了该cDNA的3′端。根据这2段cDNA克隆，设计特异引物，利用RT-PCR扩增出了Tufd1完整的开放读码框(ORF)，其编码区长948bp，编码315个氨基酸的多肽，在NCBI中运行BLAST。分析表明，Tufd1蛋白同拟南芥的UFD1蛋白有74％的同源性，在所编码的多肽链的N-端有UFD1保守结构域，可作为催化蛋白降解的信号。     

Modest stabilization by most hydrogen-bonded side-chain interactions in membrane proteins

Understanding the energetics of molecular interactions is fundamental to all of the central quests of structural biology including structure prediction and design, mapping evolutionary pathways, learning how mutations cause disease, drug design, and relating structure to function. Hydrogen-bonding is widely regarded as an important force in a membrane environment because of the low dielectric constant of membranes and a lack of competition from water. Indeed, polar residue substitutions are the most common disease-causing mutations in membrane proteins. Because of limited structural information and technical challenges, however, there have been few quantitative tests of hydrogen-bond strength in the context of large membrane proteins. Here we show, by using a double-mutant cycle analysis, that the average contribution of eight interhelical side-chain hydrogen-bonding interactions throughout bacteriorhodopsin is only 0.6 kcal mol(-1). In agreement with these experiments, we find that 4% of polar atoms in the non-polar core regions of membrane proteins have no hydrogen-bond partner and the lengths of buried hydrogen bonds in soluble proteins and membrane protein transmembrane regions are statistically identical. Our results indicate that most hydrogen-bond interactions in membrane proteins are only modestly stabilizing. Weak hydrogen-bonding should be reflected in considerations of membrane protein folding, dynamics, design, evolution and function.     

用离散量方法预测细胞凋亡蛋白的亚细胞位置

细胞凋亡蛋白的亚细胞位置与它的功能紧密相联．基于一个凋亡蛋白的亚细胞位置主要决定于它的氨基酸序列这一观点，提出了一种新的预测凋亡蛋白亚细胞位置的算法——离散量方法．计算了蛋白质一级序列中紧邻残基对的出现个数，作为离散源中的参数，利用离散增量极小化对四类凋亡蛋白进行定位预测．采用Zhou和Doctor使用的数据库，通过Re-sub-stitution检验和Jack-knife检验方法，离散量方法比他们使用的协变判别式算法总体预测成功率分别高1．0％和12．2％；采用我们自己整理的扩大以后的数据库，通过Re-substitution检验和Jack-knife检验方法，总体预测成功率分别为88．1％和78．1％．     

拟南芥信号传递途径

探讨拟南芥发育过程中一些调控基因表达的信号是如何传递的。广泛查阅近期有关发育生物学方面的文章,综述了拟南介信号传递的过程。发现植物体有许多与动物相同的信号传递途径,如磷酸化级联途径。在拟南芥中Raf1激酶,蛋白激酶（MEK）、蛋白激酶激酶（MAPK）都与信号转导直接有关。另外发现磷酸化过程在一定程度上依赖于卷须蛋白（CLV1）的自动磷酸化。植物信号转导途径类似于动物,通过磷酸化作用传递各种信号,来保持细胞增殖和分化的平衡。     

利用质谱技术鉴定寨卡病毒非结构蛋白NS1的细胞内相互作用蛋白

寨卡病毒(Zika Virus)属于黄病毒科中的黄病毒属,虽然很早就已经被人类所发现,但是一直到2015年在南美巴西的大规模爆发,才引起了广泛的关注.寨卡病毒对人类的感染往往引起包括小头畸形和格林-巴利综合征在内的多种症状.寨卡病毒的基因组为单链正链RNA,其基因组可以编码翻译并剪切加工出3个结构蛋白,分别为膜蛋白,囊膜蛋白和核衣壳蛋白,以及7个非结构蛋白(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5).相关研究已经证明,NS1蛋白与同属黄病毒属的登革病毒的发病有紧密的联系,而且根据其蛋白结构推测其可能与寨卡病毒穿越血脑屏障有关.因此鉴别NS1与细胞内的相互作用蛋白对于发现寨卡病毒在细胞内的转运,转录,以及装配都有重大的意义.在此,该课题构建并在HEK293细胞中表达包含Flag和Strep两种标签的NS1融合蛋白,通过免疫沉淀的方法将与NS1结合的蛋白利用标签蛋白进行分离,利用高分辨生物质谱技术,对蛋白进行分析鉴定.通过分别带有Flag与Strep标签的相互作用蛋白分析,发现了16个两种标签共同的结合蛋白,其进一步的通路分析证明这些蛋白于与病毒转录、病毒复制和免疫反应多个通路有关,相关的研究结果为今后进一步研究寨卡病毒的复制机制以及开发抗病毒药物提供了重要的参考价值.     

Insights into E3 ligase activity revealed by a SUMO-RanGAP1-Ubc9-Nup358 complex

SUMO-1 (for small ubiquitin-related modifier) belongs to the ubiquitin (Ub) and ubiquitin-like (Ubl) protein family. SUMO conjugation occurs on specific lysine residues within protein targets, regulating pathways involved in differentiation, apoptosis, the cell cycle and responses to stress by altering protein function through changes in activity or cellular localization or by protecting substrates from ubiquitination. Ub/Ubl conjugation occurs in sequential steps and requires the concerted action of E2 conjugating proteins and E3 ligases. In addition to being a SUMO E3, the nucleoporin Nup358/RanBP2 localizes SUMO-conjugated RanGAP1 to the cytoplasmic face of the nuclear pore complex by means of interactions in a complex that also includes Ubc9, the SUMO E2 conjugating protein. Here we describe the 3.0-A crystal structure of a four-protein complex of Ubc9, a Nup358/RanBP2 E3 ligase domain (IR1-M) and SUMO-1 conjugated to the carboxy-terminal domain of RanGAP1. Structural insights, combined with biochemical and kinetic data obtained with additional substrates, support a model in which Nup358/RanBP2 acts as an E3 by binding both SUMO and Ubc9 to position the SUMO-E2-thioester in an optimal orientation to enhance conjugation.